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  • Déclarations de divulgation
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un complexe hôte-invité de cucurbit[7]uril et d’acide urique a été formé dans une solution aqueuse avant d’ajouter une petite quantité dans la solution Au NP pour la détection quantitative par spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) à l’aide d’un spectromètre modulaire.

Résumé

Ce travail décrit une méthode rapide et très sensible pour la détection quantitative d’un biomarqueur important, l’acide urique (UA), via la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) avec une faible limite de détection d’environ 0,2 μM pour de multiples pics caractéristiques dans la région des empreintes digitales, à l’aide d’un spectromètre modulaire. Ce schéma de biodétection est médié par la complexation hôte-invité entre un macrocycle, un cucurbit[7]uril (CB7) et un UA, et la formation ultérieure de nanojonctions plasmoniques précises dans les nanoagrégats Au NP: CB7 auto-assemblés. Une synthèse Facile au NP des tailles souhaitables pour les substrats SERS a également été réalisée sur la base de l’approche classique de réduction du citrate avec une option à faciliter à l’aide d’un synthétiseur automatisé construit en laboratoire. Ce protocole peut être facilement étendu à la détection multiplexée de biomarqueurs dans les fluides corporels pour des applications cliniques.

Introduction

L’acide urique, qui est le produit final du métabolisme des nucléotides puriques, est un biomarqueur important dans le sérum sanguin et l’urine pour le diagnostic de maladies telles que la goutte, la prééclampsie, les maladies rénales, l’hypertension, les maladies cardiovasculaires et le diabète 1,2,3,4,5. Les méthodes actuelles de détection de l’acide urique comprennent les essais enzymatiques colorimétriques, la chromatographie liquide à haute performance et l’électrophorèse capillaire, qui prennent du temps, sont coûteuses et nécessitent une préparation d’échantillon sophistiquée 6,7,8,9.

La spectroscopie Raman améliorée en surface est une technique prometteuse pour le diagnostic de routine au point de service, car elle permet la détection sélective des biomolécules via leurs empreintes de vibration et offre de nombreux avantages tels qu’une sensibilité élevée, une réponse rapide, une facilité d’utilisation et une préparation d’échantillon nulle ou minimale. Les substrats SERS à base de nanoparticules de métaux nobles (par exemple, Au NP) peuvent améliorer les signaux Raman des molécules d’analyte de 4 à 10 ordres de grandeur10 via une forte amélioration électromagnétique causée par la résonance plasmoniquede surface 11. Les AU NP de tailles sur mesure peuvent être facilement synthétisés par opposition à la fabrication fastidieuse de nanocomposites métalliques complexes12, et sont donc largement utilisés dans les applications biomédicales en raison de leurs propriétés supérieures 13,14,15,16. La fixation de molécules macrocycliques, cucurbit[n]urils (CBn, où n = 5-8, 10), à la surface des NP Au peut encore améliorer les signaux SERS des molécules analytiques car les molécules CB hautement symétriques et rigides peuvent contrôler l’espacement précis entre les NP Au et localiser les molécules analytiques au centre ou à proximité des points chauds plasmoniques via la formation de complexes hôte-invité (Figure 1)17, 18,19,20. Les exemples précédents d’études SERS utilisant Au NP: CBn nanoagrégats comprennent les nitroexplosifs, les aromatiques polycycliques, le diaminostilbène, les neurotransmetteurs et la créatinine 21,22,23,24,25, les mesures SERS étant effectuées soit dans une cuvette, soit en chargeant une petite gouttelette sur un porte-échantillon sur mesure. Ce schéma de détection est particulièrement utile pour quantifier rapidement les biomarqueurs dans une matrice complexe à haute reproductibilité.

Ici, une méthode facile pour former des complexes hôte-invité de CB7 et un important biomarqueur UA, et pour quantifier UA avec une limite de détection de 0,2 μM via des agrégations médiées par CB7 de AU NP dans des milieux aqueux a été démontrée à l’aide d’un spectromètre modulaire, ce qui est prometteur pour les applications diagnostiques et cliniques.

Protocole

1. Synthèse des IP Au

  1. Synthèse de graines Au via la méthode conventionnelle Turkevich26
    1. Préparer 10 mL de solution de HAuCl4 de 25 mM en dissolvant 98,5 mg de HAuCl4· Précurseur 3H2O avec 10 mL d’eau désionisée dans un flacon en verre.
      REMARQUE: Transférez une petite quantité de précurseur HAuCl4 dans un bateau de pesage et utilisez une spatule en plastique au lieu d’une spatule métallique pour peser les cristaux, car le précurseur HAuCl4 corrodera les articles de laboratoire en métal. L’étape de pesage doit être effectuée le plus rapidement possible, car HAuCl4 est hygroscopique et augmentera donc son poids au fil du temps en absorbant l’eau de l’atmosphère. HAuCl4 est très corrosif et peut causer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Faites très attention lorsque vous le manipulez.
    2. Préparer 0,5 mL de solution de citrate de sodium de 500 mM en dissolvant 64,5 mg de poudre de citrate de sodium avec 0,5 mL d’eau désionisée dans un flacon en verre.
    3. Diluer 1 mL de la solution HAuCl4 de 25 mM avec 99 mL d’eau dans une bouteille à bouchon bleu de 250 mL pour obtenir 100 mL de solution HAuCl4 de 0,25 mM.
    4. Ajouter 99,5 mL de la solution HAuCl4 de 0,25 mM dans une fiole à fond rond à trois cols de 250 mL équipée d’un condenseur. Chauffer la solution à 90 °C sous agitation vigoureuse et maintenir la température pendant 15 min.
    5. Injecter 0,5 mL de la solution de citrate de sodium de 500 mM dans le mélange réactionnel et maintenir la température et l’agitation jusqu’à ce que la couleur de la solution devienne rouge rubis.
      REMARQUE: La réaction prend environ 30 min.
  2. Croissance ensemencée des AU NP via la méthode à contrôle cinétique13
    1. Refroidir la solution de graines Au synthétisée à 70 °C.
    2. Préparer 10 mL de solution de citrate de sodium de 60 mM en dissolvant 154,8 mg de poudre de citrate de sodium avec 10 mL d’eau désionisée dans un flacon en verre.
    3. Injecter 0,67 mL de la solution HAuCl4 de 25 mM et 0,67 mL de la solution de citrate de sodium de 60 mM aux graines Au avec un intervalle de temps de 2 min.
    4. Répétez l’étape 1.2.3 pour augmenter progressivement la taille des NP Au à 40 nm.
      REMARQUE: Il faut environ 10 étapes de croissance pour atteindre 40 nm. Le nombre réel d’étapes nécessaires peut dépendre de la configuration précise.
  3. Croissance ensemencée des NP Au à l’aide d’un synthétiseur automatisé (Figure 2)
    1. Transférer 25 mL de la solution de graines Au préparée au point 1 dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL et refroidir à 70 °C dans un thermomélangeur.
      REMARQUE: Surveillez la température à l’intérieur du thermomélangeur à l’aide d’un thermomètre à thermocouple placé dans un tube de centrifugeuse de 50 mL contenant 25 mL d’eau.
    2. Remplissez une seringue jetable Luer lock de 3 mL avec 2,5 mL de solution HAuCl4 de 25 mM. Remplissez une autre seringue jetable Luer lock de 3 mL avec 2,5 mL de solution de citrate de sodium de 60 mM.
    3. Placez les seringues dans les pompes à seringues et utilisez des adaptateurs Luer-to-MicroTight pour connecter le tube PEEK (diamètre interne de 150 μm) aux seringues. Insérez le tube dans le tube de centrifugeuse contenant la solution de graines Au dans le thermomélangeur.
    4. Réglez les deux pompes à seringue pour distribuer 0,1675 mL de solution sur 20 min (8,357 μL par min).
    5. Réglez la vitesse de rotation du thermomélangeur à 700 tr/min et appuyez sur Démarrer sur la pompe à seringue contenant la solution HAuCl4 de 25 mM.
    6. Après 2 min, appuyez sur Démarrer sur la pompe à seringue contenant la solution de citrate de sodium de 60 mM.
    7. 30 min après le début de l’injection de la solution HAuCl4 , prélever une aliquote de la solution Au NP pour analyse.
    8. Répétez les étapes 1.3.5 – 1.3.7 pour augmenter progressivement le diamètre des NP Au jusqu’à 40 nm.
      REMARQUE: Cette configuration peut être utilisée pour développer au NP jusqu’à 40 nm en une seule étape en augmentant le volume de réactifs ajoutés à l’étape 1.3.4. Ceci est réalisé en augmentant le temps de distribution tout en maintenant le même taux d’injection.

2. Caractérisation des IP Au

  1. Spectroscopie UV-Vis
    1. Ajouter 1 mL de la solution Au NP à une cuvette semi-micro quartz.
    2. Allumez le spectromètre.
    3. Réglez la plage de longueurs d’onde sur 400 - 800 nm.
    4. Acquérir le spectre UV-Vis pour chaque échantillon.
  2. Diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    1. Filtrer la solution d’échantillon dans une cuvette semi-micro en plastique avec un filtre de 0,22 μm.
    2. Allumez l’instrument DLS.
    3. Réglez la température à 25 °C et équilibrez pendant 60 s.
    4. Mesurez la taille hydrodynamique de chaque échantillon.
  3. Microscopie électronique à transmission (TEM)
    1. Déposez une gouttelette de 5 μL de la solution d’échantillon sur une grille de Cu de 300 mailles revêtue de C et séchez-la à l’air.
      REMARQUE: Une dilution est nécessaire pour les échantillons de solution Au NP plus concentrés afin d’obtenir des NP Au bien dispersés sur une grille TEM.
    2. Acquérir plusieurs images TEM pour chaque échantillon à l’aide d’une TEM à une tension d’accélération de 200 kV.
    3. Mesurez le diamètre de 200 AU NP pour chaque échantillon à l’aide d’ImageJ pour calculer la taille moyenne et l’écart-type.

3. Formation de complexes CB7-UA

  1. Préparation de la solution CB7 de 0,4 mM
    1. Ajouter 4,65 mg de CB7 dans un flacon en verre de 15 mL.
      REMARQUE : La quantité de CB7 est calculée en fonction du poids de la formule de CB7 (= 1163 Da) qui a été utilisée par la plupart des rapports dans la littérature. Néanmoins, les échantillons solides CB7 contiennent généralement de l’eau, du HCl, du méthanol et d’autres sels laissés par les étapes de synthèse et de purification, contribuant à ~ 10 à 20% de poids mort dans l’échantillon. Les solvants et les sels piégés ne pouvaient pas être éliminés en chauffant dans un four à vide ou par d’autres moyens. Leurs quantités varient d’un lot d’échantillons à l’autre, mais peuvent être quantifiées à l’aide d’une analyse élémentaire. Pourtant, le protocole présenté n’est pas sensible à la présence d’une quantité non quantifiée de solvants et de sels dans les échantillons CB7.
    2. Ajouter 10 mL d’eau au flacon et resserrer le bouchon.
    3. Soniquer l’échantillon à température ambiante jusqu’à ce que le solide CB7 soit complètement dissous.
      NOTE: CB7 a été synthétisé selon la littérature27 , mais il est également disponible dans le commerce.
  2. Préparation de la solution UA 0,4 mM
    1. Ajouter 2,69 mg d’UA dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.
    2. Ajouter 40 mL d’eau au tube et serrer le bouchon.
    3. Utilisez un thermomélangeur pour faire tourbillonner la solution d’échantillon en réglant la température à 70 °C, la vitesse à 800 tr/min et le temps à 2 h. Laisser refroidir la solution à température ambiante.
      NOTE: UA a une faible solubilité dans l’eau (0,40 mM)5. Tourbillonner plus longtemps si la poudre d’UA n’a pas été complètement dissoute. Alternativement, les ultrasons peuvent être utilisés pour faciliter la dissolution.
  3. Dilutions séquentielles de la solution d’UA de 0,4 mM
    1. Diluer 5 mL de la solution UA de 0,4 mM avec 5 mL d’eau dans un flacon en verre de 15 mL pour obtenir 10 mL de solution UA de 0,2 mM. Serrez le capuchon et soniquez pendant 30 s.
    2. Répétez l’étape 3.3.1 en utilisant une quantité appropriée d’UA et d’eau comme décrit dans le tableau 1.
  4. Préparation des complexes CB7-UA
    1. Ajouter 0,75 mL de la solution CB7 de 0,4 mM et 0,75 mL de solution UA de 0,4 mM dans un tube de 1,5 mL. Fixez le couvercle et soniquez pendant 30 s.
    2. Attendez 30 min pour assurer la formation des complexes hôte-invité.
    3. Répétez les étapes 3.4.1 à 3.4.2 en utilisant une solution d’UA de différentes concentrations.

4. Détection SERS de l’UA

  1. Mise en place expérimentale du système Raman (Figure 3)
    1. Allumez le laser He-Ne 633 nm (22,5 mW).
    2. Allumez le spectromètre Raman modulaire.
    3. Allumez l’ordinateur et démarrez le logiciel.
    4. Cliquez sur l’icône Assistants d’application de spectroscopie , puis sélectionnez Raman.
    5. Commencez une nouvelle acquisition. Réglez le temps d’intégration sur 30 s, les scans sur 5 en moyenne et boxcar sur 0.
    6. Stockez le spectre d’arrière-plan et entrez dans la longueur d’onde du laser (c.-à-d. 633 nm).
      REMARQUE: Le temps d’intégration est le temps pour chaque numérisation, les numérisations à la moyenne est le nombre de numérisations moyennées pour créer chaque spectre et boxcar est le nombre de pixels voisins en moyenne28.
  2. Formation des substrats SERS
    1. Ajouter 0,9 mL de la solution Au NP de 40 nm et 0,1 mL de la solution complexe CB7-UA préformée dans un tube de 1,5 mL. Fixez le couvercle et soniquez jusqu’à ce que la solution passe du rouge rubis au violet.
      REMARQUE: Des échantillons commerciaux de solution de 40 nm Au NP stabilisés au citrate peuvent également être utilisés. En règle générale, la densité optique du pic de résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) est ajustée à 1 par dilution à partir d’échantillons de solution mère concentrée. La concentration de citrate dans l’échantillon est généralement maintenue à 2 mM.
    2. Transférer la solution d’échantillon dans une cuvette semi-micro. Placez la cuvette dans le porte-échantillon Raman et fermez le couvercle.
    3. Démarrez la mesure.
    4. Configurez l’enregistrement automatique pour enregistrer cinq spectres SERS consécutifs.
    5. Arrêtez la mesure et modifiez l’échantillon.
    6. Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.5 en utilisant une solution CB7-UA de différentes concentrations.
      REMARQUE: Le temps d’agrégation dépend de la concentration d’UA dans les nanoagrégats, allant de 30 s pour 0,1 μM UA à 30 min pour 20 μM UA, en raison de la différence de concentration de CB7 vide qui a une contribution majeure à la médiation de l’agrégation des AU NP. Pour le complexe CB7-UA, un portail est bloqué par la molécule UA volumineuse, ce qui la rend indisponible pour la liaison à la surface Au NP et donc incapable de servir de médiateur à l’agrégation NP21. L’échantillon est prêt à être mesuré lorsque la couleur de la solution passe du rouge rubis au violet.

5. Analyse des données

  1. Traitement des données
    1. Téléchargez et installez le plugin baseline with asymmetric least squares (ALS) dans Origin.
      REMARQUE: Le plugin ALS nécessite OriginPro.
    2. Insérez les données brutes dans Origin.
    3. Calculez une valeur moyenne à partir des cinq spectres SERS de chaque échantillon. Divisez la valeur par la puissance du laser (c.-à-d. 22,5 mW) et par le temps d’intégration (c.-à-d. 30 s).
    4. Cliquez sur l’icône ALS pour ouvrir la boîte de dialogue. Définissez le facteur asymétrique sur 0,001, le seuil sur 0,03 %, le facteur de lissage sur 2 et le nombre d’itérations sur 20 pour corriger la ligne de base de chaque spectre moyenné.
    5. Tracez les spectres SERS de différentes concentrations d’UA à l’aide de lignes empilées par décalage y. La sortie doit être l’intensité (compte s-1 mW-1) par rapport au décalage Raman (cm-1).

Résultats

Dans la synthèse Au NP présentée, les spectres UV-Vis montrent un déplacement des pics LSPR de 521 nm à 529 nm après 10 étapes de croissance (Figure 4A,B) tandis que les données DLS montrent une distribution de taille étroite à mesure que la taille des NP Au augmente de 25,9 nm à 42,8 nm (Figure 4C,D). Les tailles moyennes de G0, G5 et G10 mesurées à partir d’images TEM (Figure 4E) so...

Discussion

La méthode de synthèse automatisée décrite dans le protocole permet de synthétiser de manière reproductible les AU NP de tailles croissantes. Bien que certains éléments doivent encore être effectués manuellement, tels que l’ajout rapide de citrate de sodium pendant la synthèse des graines et la vérification périodique pour s’assurer que le tube PEEK est sécurisé, cette méthode permet des AU NP de grandes tailles (jusqu’à 40 nm), ce qui nécessiterait généralement plusieurs injections manuelles de...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

TCL est reconnaissant du soutien de la Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) et du UCL BEAMS Future Leader Award financé par le prix institutional Sponsorship award de l’EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL et IPP sont reconnaissants envers la bourse d’études financée par le programme de participation à la recherche A*STAR-UCL par le biais de l’EPSRC M3S CDT (EP/ L015862/1). GD et TJ tiennent à remercier l’EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) pour avoir parrainé leur bourse d’études. TJ et TCL remercient Camtech Innovations pour sa contribution à la bourse d’études de TJ. Tous les auteurs sont reconnaissants envers le Fonds de libre accès de l’UCL.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
40 nm gold nanoparticlesNanoComposixAUCN40-100MNanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tubeCorning Falcon14-432-2250 mL volume
Cucurbit[7]urilLab-madesee ref. 19
Gold(III) chloride trihydrateSigma aldrich520918≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringeCole-ParmerWZ-07945-153 mL volume
Luer-to-MicroTight adapterLuerTightP-662360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubingIDEX1572360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutterIDEXWZ-02013-30Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometerOcean OpticsQE pro
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma aldrichS4641ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard ProbeDigi-SenseWZ-08516-55Type-K
Syringe pumpAladdinALADDIN2-2202 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometerDigi-SenseWZ-20250-91Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixerEppendorf5382000031With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acidSigma aldrichU2625≥99%, crystalline

Références

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