Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit[n]uril

Zusammenfassung

Ein Host-Gast-Komplex aus Cucurbit[7]uril und Harnsäure wurde in einer wässrigen Lösung gebildet, bevor eine kleine Menge in die Au NP-Lösung für die quantitative oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) mit einem modularen Spektrometer gegeben wurde.

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine schnelle und hochempfindliche Methode zum quantitativen Nachweis eines wichtigen Biomarkers, Harnsäure (UA), mittels oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS) mit einer niedrigen Nachweisgrenze von ~0,2 μM für mehrere charakteristische Peaks im Fingerabdruckbereich unter Verwendung eines modularen Spektrometers. Dieses Biosensorschema wird durch die Wirt-Gast-Komplexierung zwischen einem Makrozyklus, Kürbis[7]uril (CB7) und UA und der anschließenden Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen innerhalb der selbstorganisierten Au NP: CB7-Nanoaggregate vermittelt. Eine einfache Au NP-Synthese der gewünschten Größen für SERS-Substrate wurde ebenfalls auf der Grundlage des klassischen Citratreduktionsansatzes mit der Option durchgeführt, mit einem im Labor gebauten automatisierten Synthesizer erleichtert zu werden. Dieses Protokoll kann leicht auf den Multiplex-Nachweis von Biomarkern in Körperflüssigkeiten für klinische Anwendungen erweitert werden.

Einleitung

Harnsäure, das Endprodukt des Stoffwechsels von Purinnukleotiden, ist ein wichtiger Biomarker in Blutserum und Urin für die Diagnose von Krankheiten wie Gicht, Präeklampsie, Nierenerkrankungen, Bluthochdruck, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes 1,2,3,4,5. Zu den aktuellen Methoden für den Harnsäurenachweis gehören kolorimetrische enzymatische Assays, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese, die zeitaufwendig und teuer sind^und eine ausgeklügelte Probenvorbereitung erfordern 6,7,8,9.

Die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie ist eine vielversprechende Technik für die routinemäßige Point-of-Care-Diagnose, da sie die selektive Detektion von Biomolekülen über ihre Vibrationsfingerabdrücke ermöglicht und zahlreiche Vorteile wie hohe Empfindlichkeit, schnelle Reaktion, Benutzerfreundlichkeit und keine oder nur minimale Probenvorbereitung bietet. SERS-Substrate auf Basis von Edelmetall-Nanopartikeln (z.B. Au NPs) können die Raman-Signale der Analytmoleküle durch starke elektromagnetische Verstärkung durch Oberflächenplasmonenresonanz 11 um 4 bis¹⁰ Größenordnungen^{10 verstärken.} Au NPs mit maßgeschneiderten Größen können im Gegensatz zur zeitaufwändigen Herstellung komplexer Metall-Nanokomposite¹² leicht synthetisiert werden und werden daher aufgrund ihrer überlegenen Eigenschaften^13,14,15,16 häufig in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt. Die Anlagerung makrozyklischer Moleküle, Kürbis[n]urile (CB n, wobei n = 5-8, 10), an die Oberfläche von Au-NPs kann die SERS-Signale der Analytmoleküle weiter verstärken, da die hochsymmetrischen und starren CB-Moleküle den genauen Abstand zwischen den Au-NPs kontrollieren und die Analytmoleküle im Zentrum oder in unmittelbarer Nähe zu den plasmonischen Hotspots durch Bildung von Wirt-Gast-Komplexen lokalisieren können (Abbildung 1)^{17, 18,19,20}. Frühere Beispiele für SERS-Studien mit Au NP: CBn Nanoaggregate umfassen Nitrosprengstoffe, polyzyklische Aromaten, Diaminostilbene, Neurotransmitter und Kreatinin 21,22,23,24,25^, wobei die SERS-Messungen entweder in einer Küvette oder durch Laden eines kleinen Tröpfchens auf einen maßgefertigten Probenhalter durchgeführt werden. Dieses Nachweisschema ist besonders nützlich, um Biomarker in einer komplexen Matrix mit hoher Reproduzierbarkeit schnell zu quantifizieren.

Hierin wurde eine einfache Methode zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen von CB7 und einem wichtigen Biomarker UA und zur Quantifizierung von UA mit einer Nachweisgrenze von 0,2 μM über CB7-vermittelte Aggregationen von Au-NPs in wässrigen Medien unter Verwendung eines modularen Spektrometers demonstriert, das für diagnostische und klinische Anwendungen vielversprechend ist.

Protokoll

1. Synthese von Au-NPs

1. Synthese von Au-Samen nach der konventionellen Turkevich-Methode²⁶
   1. Bereiten Sie 10 ml 25 mM HAuCl_4-Lösung vor, indem Sie 98,5 mg HAuCl₄ auflösen. 3H₂O Vorläufer mit 10 ml entionisiertem Wasser in einer Glasdurchstechflasche.
      HINWEIS: Übertragen Sie eine kleine Menge HAuCl 4-Vorläufer in ein Wiegeboot und verwenden Sie einen Kunststoffspatel anstelle eines metallischen Spatels, um die Kristalle auszuwiegen, da der HAuCl_4-Vorläufer Metalllaborgeräte korrodiert. Der Wiegeschritt sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, da_{HAuCl 4 hygroskopisch} ist und daher sein Gewicht im Laufe der Zeit erhöht, indem es Wasser aus der Atmosphäre aufnimmt. HAuCl₄ ist stark korrosiv und kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Seien Sie besonders vorsichtig bei der Handhabung.
   2. Bereiten Sie 0,5 ml 500 mM Natriumcitratlösung vor, indem Sie 64,5 mg Natriumcitratpulver mit 0,5 ml entionisiertem Wasser in einer Durchstechflasche aus Glas auflösen.
   3. Verdünnen Sie 1 ml der 25 mM HAuCl_4-Lösung mit 99 mL Wasser in einer 250 mL Flasche mit blauem Deckel, um 100 ml 0,25 mM_{HAuCl 4-Lösung} zu erhalten.
   4. 99,5 ml der 0,25 mM HAuCl_4-Lösung in einen 250 ml Dreihalskolben mit rundem Boden geben, der mit einem Kondensator ausgestattet ist. Die Lösung unter starkem Rühren auf 90 °C erhitzen und die Temperatur 15 min halten.
   5. Injizieren Sie 0,5 ml der 500 mM Natriumcitratlösung in das Reaktionsgemisch und halten Sie die Temperatur und das Rühren aufrecht, bis die Farbe der Lösung rubinrot wird.
      HINWEIS: Die Reaktion dauert ca. 30 min.
2. Seeded Growth von Au NPs über die kinetisch kontrollierte Methode¹³
   1. Die as-synthetisierte Au-Samenlösung wird auf 70 °C abgekühlt.
   2. Bereiten Sie 10 ml 60 mM Natriumcitratlösung vor, indem Sie 154,8 mg Natriumcitratpulver mit 10 ml entionisiertem Wasser in einer Durchstechflasche aus Glas auflösen.
   3. Es werden 0,67 ml der 25 mM HAuCl_4-Lösung und 0,67 ml der 60 mM Natriumcitratlösung mit einem Zeitintervall von 2 min in die Au-Samen injiziert.
   4. Wiederholen Sie Schritt 1.2.3, um die Größe von Au NPs schrittweise auf 40 nm zu erhöhen.
      HINWEIS: Es dauert etwa 10 Wachstumsschritte, um 40 nm zu erreichen. Die tatsächliche Anzahl der erforderlichen Schritte kann von der genauen Einrichtung abhängen.
3. Seeded Growth von Au NPs mit automatisiertem Synthesizer (Abbildung 2)
   1. 25 ml der in Abschnitt 1 hergestellten Au-Saatgutlösung in ein konisches 50 mL Zentrifugenröhrchen geben und in einem Thermomischer auf 70 °C abkühlen.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Temperatur im Thermomischer mit einem Thermoelement-Thermometer, das in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 25 ml Wasser platziert ist.
   2. Füllen Sie eine 3 mL Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 ml 25 mM HAuCl_4-Lösung . Füllen Sie eine weitere 3 mL Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 ml 60 mM Natriumcitratlösung.
   3. Legen Sie die Spritzen in die Spritzenpumpen und verwenden Sie Luer-to-MicroTight-Adapter, um den PEEK-Schlauch (150 μm Innendurchmesser) mit den Spritzen zu verbinden. Führen Sie den Schlauch in das Zentrifugenröhrchen mit der Au-Saatgutlösung im Thermomischer ein.
   4. Stellen Sie beide Spritzenpumpen so ein, dass sie 0,1675 ml Lösung über 20 min (8,357 μL pro min) dosieren.
   5. Stellen Sie die Drehzahl des Thermomixers auf 700 U/min ein und drücken Sie Start an der Spritzenpumpe, die die 25 mM HAuCl_4-Lösung enthält.
   6. Drücken Sie nach 2 Minuten auf Start an der Spritzenpumpe, die die 60 mM Natriumcitratlösung enthält.
   7. Entfernen Sie 30 Minuten nach Beginn der Injektion der HAuCl 4-Lösung ein Aliquot der Au_NP-Lösung zur Analyse.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.5 – 1.3.7, um den Durchmesser der Au NPs schrittweise auf bis zu 40 nm zu erhöhen.
      HINWEIS: Dieses Setup kann verwendet werden, um Au-NPs in einem Schritt auf bis zu 40 nm zu erhöhen, indem das Volumen der in Schritt 1.3.4 hinzugefügten Reaktanten erhöht wird. Dies wird erreicht, indem die Dosierzeit bei gleichbleibender Injektionsrate erhöht wird.

2. Charakterisierung von Au-NPs

1. UV-Vis-Spektroskopie
   1. Fügen Sie 1 ml der Au NP-Lösung zu einer Semi-Mikro-Quarzküvette hinzu.
   2. Schalten Sie das Spektrometer ein.
   3. Stellen Sie den Wellenlängenbereich auf 400 - 800 nm ein.
   4. Erfassen Sie das UV-Vis-Spektrum für jede Probe.
2. Dynamische Lichtstreuung (DLS)
   1. Filtern Sie die Probenlösung in eine Kunststoff-Semi-Mikro-Küvette mit einem 0,22-μm-Filter.
   2. Schalten Sie das DLS-Instrument ein.
   3. Stellen Sie die Temperatur auf 25 °C ein und gleichen Sie sie für 60 s.
   4. Messen Sie die hydrodynamische Größe jeder Probe.
3. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
   1. Ein 5-μL-Tropfen der Probenlösung wird auf ein C-beschichtetes 300-Mesh-Cu-Gitter getropft und an der Luft getrocknet.
      HINWEIS: Für konzentriertere Au NP-Lösungsproben ist eine Verdünnung erforderlich, um gut dispergierte Au-NPs auf einem TEM-Gitter zu erhalten.
   2. Erfassen Sie mehrere TEM-Bilder für jede Probe mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV.
   3. Messen Sie den Durchmesser von 200 Au-NPs für jede Stichprobe mit ImageJ, um die durchschnittliche Größe und die Standardabweichung zu berechnen.

3. Bildung von CB7-UA-Komplexen

1. Herstellung einer 0,4 mM CB7-Lösung
   1. 4,65 mg CB7 in eine 15 ml Durchstechflasche aus Glas geben.
      HINWEIS: Die Menge an CB7 wird basierend auf dem Formelgewicht von CB7 (= 1163 Da) berechnet, das von den meisten Berichten in der Literatur verwendet wurde. Dennoch enthalten CB7-Feststoffproben typischerweise Wasser, HCl, Methanol und andere Salze, die von den Synthese- und Reinigungsschritten übrig geblieben sind, was zu ~ 10 - 20% Eigengewicht in der Probe beiträgt. Die eingeschlossenen Lösungsmittel und Salze konnten nicht durch Erhitzen in einem Vakuumofen oder auf andere Weise entfernt werden. Ihre Mengen variieren zwischen verschiedenen Probenchargen, können aber mit Hilfe der Elementaranalyse quantifiziert werden. Das vorgelegte Protokoll reagiert jedoch nicht empfindlich auf das Vorhandensein einer nicht quantifizierten Menge an Lösungsmitteln und Salzen in den CB7-Proben.
   2. Geben Sie 10 ml Wasser in die Durchstechflasche und ziehen Sie die Kappe fest.
   3. Beschallen Sie die Probe bei Raumtemperatur, bis der CB7-Feststoff vollständig gelöst ist.
      HINWEIS: CB7 wurde gemäß Literatur²⁷ synthetisiert, ist aber auch im Handel erhältlich.
2. Vorbereitung einer 0,4 mM UA-Lösung
   1. 2,69 mg UA in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen geben.
   2. Geben Sie 40 ml Wasser in den Schlauch und ziehen Sie die Kappe fest.
   3. Verwenden Sie einen Thermomixer, um die Probenlösung zu schwenken, indem Sie die Temperatur auf 70 °C, die Drehzahl auf 800 U/min und die Zeit auf 2 h einstellen. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen.
      HINWEIS: UA hat eine geringe Löslichkeit in Wasser (0,40 mM)⁵. Länger schwenken, wenn das UA-Pulver nicht vollständig gelöst wurde. Alternativ kann Ultraschall verwendet werden, um die Auflösung zu erleichtern.
3. Sequentielle Verdünnungen der 0,4 mM UA-Lösung
   1. Verdünnen Sie 5 ml der 0,4 mM UA-Lösung mit 5 mL Wasser in einer 15 mL Glasdurchstechflasche, um 10 mL 0,2 mM UA-Lösung zu erhalten. Ziehen Sie die Kappe fest und beschallen Sie für 30 s.
   2. Wiederholen Sie Schritt 3.3.1 mit einer angemessenen Menge UA und Wasser, wie in Tabelle 1 beschrieben.
4. Vorbereitung der CB7-UA-Komplexe
   1. 0,75 ml der 0,4 mM CB7-Lösung und 0,75 ml 0,4 mM UA-Lösung in ein 1,5-ml-Rohr geben. Befestigen Sie Deckel und Beschallung für 30 s.
   2. Warten Sie 30 Minuten, um die Bildung von Gastgeber-Gäste-Komplexen sicherzustellen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 – 3.4.2 mit UA-Lösung in verschiedenen Konzentrationen.

4. SERS-Erfassung von UA

1. Versuchsaufbau des Raman-Systems (Abbildung 3)
   1. Schalten Sie den 633 nm He-Ne Laser (22,5 mW) ein.
   2. Schalten Sie das modulare Raman-Spektrometer ein.
   3. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Software.
   4. Klicken Sie auf das Symbol Spektroskopie-Anwendungsassistenten , und wählen Sie dann Raman aus.
   5. Starten Sie eine neue Akquisition. Stellen Sie die Integrationszeit auf 30 s, scannt auf durchschnittlich 5 und boxcar auf 0.
   6. Speichern Sie das Hintergrundspektrum und geben Sie die Laserwellenlänge (d. h. 633 nm) ein.
      HINWEIS: Die Integrationszeit ist die Zeit für jeden Scan, die durchschnittlichen Scans sind die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um jedes Spektrum zu erstellen, und Boxcar ist die Anzahl der benachbarten Pixel, die^{durchschnittlich 28} beträgt.
2. Bildung der SERS-Substrate
   1. 0,9 ml der 40 nm Au NP-Lösung und 0,1 ml der vorgeformten CB7-UA-Komplexlösung in ein 1,5-ml-Rohr geben. Befestigen Sie den Deckel und beschallen Sie, bis die Lösung von rubinrot zu lila wechselt.
      HINWEIS: Kommerzielle Citrat-stabilisierte 40 nm Au NP-Lösungsproben können ebenfalls verwendet werden. Typischerweise wird die optische Dichte des LSPR-Peaks (Localized Surface Plasmon Resonance) durch Verdünnung aus konzentrierten Stammlösungsproben auf 1 eingestellt. Die Citratkonzentration in der Probe wird typischerweise als 2 mM gehalten.
   2. Übertragen Sie die Probenlösung auf eine Semi-Mikroküvette. Legen Sie die Küvette in den Raman-Probenhalter und schließen Sie die Abdeckung.
   3. Starten Sie die Messung.
   4. Richten Sie die automatische Speicherung ein, um fünf aufeinanderfolgende SERS-Spektren aufzuzeichnen.
   5. Stoppen Sie die Messung und ändern Sie die Probe.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 – 4.2.5 mit CB7-UA-Lösung in verschiedenen Konzentrationen.
      HINWEIS: Die Aggregationszeit hängt von der Konzentration von UA in den Nanoaggregaten ab, die von 30 s für 0,1 μM UA bis 30 min für 20 μM UA reicht, da die Konzentration von leerem CB7 einen großen Beitrag zur Vermittlung der Aggregation von Au-NPs leistet. Für den CB7-UA-Komplex ist ein Portal durch das sperrige UA-Molekül blockiert, wodurch es für die Bindung an die Au-NP-Oberfläche nicht verfügbar ist und daher nicht in der Lage ist, die NP-Aggregation²¹ zu vermitteln. Die Probe ist bereit für die Messung, wenn sich die Farbe der Lösung von rubinrot zu violett ändert.

5. Datenanalyse

1. Datenverarbeitung
   1. Lade die Baseline mit dem ALS-Plugin (Asymmetric Least Squares) herunter und installiere es in Origin.
      HINWEIS: Das ALS-Plugin erfordert OriginPro.
   2. Fügen Sie die Rohdaten in Origin ein.
   3. Berechnen Sie einen Durchschnittswert aus den fünf SERS-Spektren jeder Probe. Teilen Sie den Wert durch die Leistung des Lasers (d. h. 22,5 mW) und durch die Integrationszeit (d. h. 30 s).
   4. Klicken Sie auf das ALS-Symbol , um das Dialogfeld zu öffnen. Legen Sie den asymmetrischen Faktor auf 0,001, den Schwellenwert auf 0,03 %, den Glättungsfaktor auf 2 und die Anzahl der Iterationen auf 20 fest, um die Basislinie jedes gemittelten Spektrums zu korrigieren.
   5. Zeichnen Sie die SERS-Spektren verschiedener UA-Konzentrationen mit gestapelten Linien durch y-Offsets auf. Die Ausgabe sollte Intensität (zählt s-1 mW-1) gegen ^{Raman-Verschiebung (cm-1)} sein.

Ergebnisse

In der vorgestellten Au-NP-Synthese zeigen die UV-Vis-Spektren eine Verschiebung der LSPR-Peaks von 521 nm auf 529 nm nach 10 Wachstumsschritten (Abbildung 4 A,B), während die DLS-Daten eine enge Größenverteilung zeigen, da die Größe der Au NPs von 25,9 nm auf 42,8 nm zunimmt (Abbildung 4C,D). Die durchschnittlichen Größen von G0, G5 und G10, die anhand von TEM-Bildern gemessen werden (Abbildung 4E

Diskussion

Das im Protokoll beschriebene automatisierte Syntheseverfahren ermöglicht es, Au NPs zunehmender Größe reproduzierbar zu synthetisieren. Obwohl es einige Elemente gibt, die noch manuell durchgeführt werden müssen, wie die schnelle Zugabe von Natriumcitrat während der Saatgutsynthese und die regelmäßige Überprüfung, um sicherzustellen, dass der PEEK-Schlauch sicher ist, ermöglicht diese Methode Au NPs großer Größe (bis zu 40 nm), die normalerweise mehrere manuelle Injektionen von HAuCl₄ und Natriu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 nm gold nanoparticles	NanoComposix	AUCN40-100M	NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube	Corning Falcon	14-432-22	50 mL volume
Cucurbit[7]uril	Lab-made		see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate	Sigma aldrich	520918	≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe	Cole-Parmer	WZ-07945-15	3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter	LuerTight	P-662	360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing	IDEX	1572	360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter	IDEX	WZ-02013-30	Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer	Ocean Optics	QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma aldrich	S4641	ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe	Digi-Sense	WZ-08516-55	Type-K
Syringe pump	Aladdin	ALADDIN2-220	2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer	Digi-Sense	WZ-20250-91	Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer	Eppendorf	5382000031	With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid	Sigma aldrich	U2625	≥99%, crystalline