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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un complesso ospite-ospite di cucurbitacea[7]uril e acido urico si è formato in una soluzione acquosa prima di aggiungere una piccola quantità nella soluzione Au NP per il rilevamento quantitativo della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS) utilizzando uno spettrometro modulare.

Abstract

Questo lavoro descrive un metodo rapido e altamente sensibile per il rilevamento quantitativo di un importante biomarcatore, l'acido urico (UA), tramite spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS) con un basso limite di rilevamento di ~ 0,2 μM per più picchi caratteristici nella regione delle impronte digitali, utilizzando uno spettrometro modulare. Questo schema di biorilevamento è mediato dalla complessazione ospite-ospite tra un macrociclo, cucurbitacea[7]uril (CB7) e UA, e dalla successiva formazione di precise nanogiunzioni plasmoniche all'interno dei nanoaggregati Au NP: CB7 autoassemblati. È stata inoltre eseguita una facile sintesi Au NP di dimensioni desiderabili per substrati SERS basata sul classico approccio di riduzione del citrato con un'opzione da facilitare utilizzando un sintetizzatore automatizzato costruito in laboratorio. Questo protocollo può essere facilmente esteso al rilevamento multiplexato di biomarcatori nei fluidi corporei per applicazioni cliniche.

Introduzione

L'acido urico, che è il prodotto finale del metabolismo dei nucleotidi purinici, è un importante biomarcatore nel siero del sangue e nelle urine per la diagnosi di malattie come gotta, preeclampsia, malattie renali, ipertensione, malattie cardiovascolari e diabete 1,2,3,4,5. Gli attuali metodi per il rilevamento dell'acido urico includono saggi enzimatici colorimetrici, cromatografia liquida ad alte prestazioni ed elettroforesi capillare, che richiedono tempo, denaro e richiedono una sofisticata preparazione del campione 6,7,8,9.

La spettroscopia Raman potenziata in superficie è una tecnica promettente per la diagnosi di routine del punto di cura in quanto consente il rilevamento selettivo delle biomolecole tramite le loro impronte digitali di vibrazione e offre numerosi vantaggi come alta sensibilità, risposta rapida, facilità d'uso e preparazione del campione nulla o minima. I substrati SERS a base di nanoparticelle di metalli nobili (ad esempio, Au NP) possono migliorare i segnali Raman delle molecole di analita da 4 a 10 ordini di grandezza10 attraverso un forte miglioramento elettromagnetico causato dalla risonanza plasmonica di superficie11. Au NP di dimensioni su misura possono essere facilmente sintetizzate rispetto alla fabbricazione dispendiosa in termini di tempo di nanocompositi metallici complessi12, e quindi sono ampiamente utilizzate in applicazioni biomediche grazie alle loro proprietà superiori 13,14,15,16. L'attaccamento di molecole macrocicliche, cucurbitacee [n]urils (CBn, dove n = 5-8, 10), sulla superficie di Au NP può migliorare ulteriormente i segnali SERS delle molecole analitiche in quanto le molecole CB altamente simmetriche e rigide possono controllare la spaziatura precisa tra le NP Au e localizzare le molecole analitiche al centro o in prossimità degli hotspot plasmonici attraverso la formazione di complessi ospite-ospite (Figura 1)17, 18,19,20. Esempi precedenti di studi SERS che utilizzano Au NP: CBn nanoaggregati includono nitroesplosivi, policiclici aromatici, diaminostilbene, neurotrasmettitori e creatinina 21,22,23,24,25, con le misurazioni SERS eseguite in una cuvetta o caricando una piccola goccia su un portacampioni su misura. Questo schema di rilevamento è particolarmente utile per quantificare rapidamente i biomarcatori in una matrice complessa con un'elevata riproducibilità.

Qui, un metodo facile per formare complessi ospite-ospite di CB7 e un importante biomarcatore UA e per quantificare UA con un limite di rilevamento di 0,2 μM tramite aggregazioni mediate da CB7 di Au NP in mezzi acquosi è stato dimostrato utilizzando uno spettrometro modulare, che è promettente per applicazioni diagnostiche e cliniche.

Protocollo

1. Sintesi delle AP

  1. Sintesi di semi di Au tramite il metodo convenzionale Turkevich26
    1. Preparare 10 mL di soluzione di HAuCl4 da 25 mM sciogliendo 98,5 mg di HAuCl4· Precursore 3H2O con 10 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di vetro.
      NOTA: trasferire una piccola quantità di precursore HAuCl4 in una barca di pesatura e utilizzare una spatola di plastica anziché una spatola metallica per pesare i cristalli perché il precursore HAuCl4 corroderà le stoviglie metalliche. La fase di pesatura deve essere eseguita il più rapidamente possibile, poiché HAuCl4 è igroscopico e quindi aumenterà il suo peso nel tempo assorbendo acqua dall'atmosfera. HAuCl4 è altamente corrosivo e può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Prestare particolare attenzione quando lo si maneggia.
    2. Preparare 0,5 mL di soluzione di citrato di sodio 500 mM sciogliendo 64,5 mg di polvere di citrato di sodio con 0,5 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di vetro.
    3. Diluire 1 mL della soluzione HAuCl4 da 25 mM con 99 mL di acqua in una bottiglia da 250 mL con tappo blu per ottenere 100 mL di soluzione HAuCl4 da 0,25 mM.
    4. Aggiungere 99,5 mL della soluzione HAuCl4 da 0,25 mM in un matraccio a fondo tondo a tre colli da 250 mL dotato di condensatore. Riscaldare la soluzione a 90 °C agitando vigorosamente e mantenere la temperatura per 15 minuti.
    5. Iniettare 0,5 mL della soluzione di citrato di sodio da 500 mM nella miscela di reazione e mantenere la temperatura e mescolare fino a quando il colore della soluzione diventa rosso rubino.
      NOTA: La reazione dura circa 30 minuti.
  2. Crescita seminata di Au NP attraverso il metodo cineticamente controllato13
    1. Raffreddare la soluzione di semi di Au sintetizzata a 70 °C.
    2. Preparare 10 mL di 60 mM di soluzione di citrato di sodio sciogliendo 154,8 mg di polvere di citrato di sodio con 10 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di vetro.
    3. Iniettare 0,67 mL della soluzione HAuCl4 da 25 mM e 0,67 mL della soluzione di citrato di sodio 60 mM ai semi di Au con un intervallo di tempo di 2 min.
    4. Ripetere il passaggio 1.2.3 per aumentare gradualmente la dimensione delle APP Au a 40 nm.
      NOTA: Ci vogliono circa 10 passi di crescita per raggiungere i 40 nm. Il numero effettivo di passaggi necessari può dipendere dalla configurazione precisa.
  3. Crescita seminata di Au NP utilizzando un sintetizzatore automatizzato (Figura 2)
    1. Trasferire 25 mL della soluzione di semi Au preparata nella sezione 1 in un tubo centrifugo conico da 50 mL e raffreddare a 70 °C in un termomiscelatore.
      NOTA: Monitorare la temperatura all'interno del termomiscelatore utilizzando un termometro a termocoppia posto in un tubo di centrifuga da 50 mL contenente 25 mL di acqua.
    2. Riempire una siringa monouso Luer lock da 3 mL con 2,5 mL di soluzione HAuCl4 da 25 mM. Riempire un'altra siringa monouso Luer lock da 3 mL con 2,5 mL di soluzione di citrato di sodio da 60 mM.
    3. Posizionare le siringhe nelle pompe a siringa e utilizzare adattatori Luer-to-MicroTight per collegare il tubo in PEEK (diametro interno di 150 μm) alle siringhe. Inserire il tubo nel tubo della centrifuga contenente la soluzione di semi di Au nel bimbyler.
    4. Impostare entrambe le pompe a siringa in modo da erogare 0,1675 mL di soluzione nell'arco di 20 minuti (8,357 μL al minuto).
    5. Impostare la velocità di rotazione del termomixer a 700 giri/min e premere Start sulla pompa a siringa contenente la soluzione HAuCl4 da 25 mM.
    6. Dopo 2 minuti, premere Start sulla pompa a siringa contenente la soluzione di citrato di sodio da 60 mM.
    7. 30 minuti dopo l'inizio dell'iniezione della soluzione di HAuCl4 , rimuovere un'aliquota della soluzione di Au NP per l'analisi.
    8. Ripetere i passaggi 1.3.5 – 1.3.7 per aumentare gradualmente il diametro delle AP Au fino a 40 nm.
      NOTA: questa configurazione può essere utilizzata per far crescere Au NP fino a 40 nm in un unico passaggio aumentando il volume dei reagenti aggiunti nel passaggio 1.3.4. Ciò si ottiene aumentando il tempo di erogazione mantenendo la stessa velocità di iniezione.

2. Caratterizzazione di Au NP

  1. Spettroscopia UV-Vis
    1. Aggiungere 1 mL della soluzione di Au NP a una cuvetta di quarzo semi-micro.
    2. Accendere lo spettrometro.
    3. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda su 400 - 800 nm.
    4. Acquisire lo spettro UV-Vis per ogni campione.
  2. Diffusione dinamica della luce (DLS)
    1. Filtrare la soluzione campione in una semi-micro cuvetta di plastica con un filtro da 0,22 μm.
    2. Accendere lo strumento DLS.
    3. Impostare la temperatura a 25 °C ed equilibrare per 60 s.
    4. Misurare la dimensione idrodinamica di ciascun campione.
  3. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
    1. Gettare a goccia una goccia da 5 μL della soluzione campione su una griglia Cu a 300 maglie rivestita a C e asciugarla all'aria.
      NOTA: la diluizione è necessaria per campioni di soluzione Au NP più concentrati per ottenere Au NP ben dispersi su una griglia TEM.
    2. Acquisire più immagini TEM per ogni campione utilizzando un TEM a una tensione di accelerazione di 200 kV.
    3. Misurare il diametro di 200 Au NP per ogni campione utilizzando ImageJ per calcolare la dimensione media e la deviazione standard.

3. Formazione di complessi CB7-UA

  1. Preparazione della soluzione CB7 da 0,4 mM
    1. Aggiungere 4,65 mg di CB7 a un flaconcino di vetro da 15 ml.
      NOTA: La quantità di CB7 viene calcolata in base al peso della formula di CB7 (= 1163 Da) che è stato utilizzato dalla maggior parte dei rapporti in letteratura. Tuttavia, i campioni solidi CB7 contengono tipicamente acqua, HCl, metanolo e altri sali lasciati dalle fasi di sintesi e purificazione, contribuendo a ~ 10 - 20% di peso morto nel campione. I solventi e i sali intrappolati non potevano essere rimossi riscaldando in un forno a vuoto o con altri mezzi. Le loro quantità variano tra diversi lotti di campioni, ma possono essere quantificate utilizzando l'analisi elementare. Tuttavia, il protocollo presentato non è sensibile alla presenza di quantità non quantificate di solventi e sali nei campioni CB7.
    2. Aggiungere 10 ml di acqua al flaconcino e stringere il tappo.
    3. Sonicare il campione a temperatura ambiente fino a quando il solido CB7 non è completamente disciolto.
      NOTA: CB7 è stato sintetizzato secondo la letteratura27 ma è anche disponibile in commercio.
  2. Preparazione della soluzione UA da 0,4 mM
    1. Aggiungere 2,69 mg di UA a un tubo di centrifuga da 50 ml.
    2. Aggiungere 40 ml di acqua al tubo e stringere il tappo.
    3. Utilizzare un bimbyxer per ruotare la soluzione campione impostando la temperatura a 70 °C, la velocità a 800 giri/min e il tempo a 2 ore. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
      NOTA: UA ha una bassa solubilità in acqua (0,40 mM)5. Ruotare più a lungo se la polvere UA non è stata completamente sciolta. In alternativa, l'ultrasonicazione può essere utilizzata per facilitare la dissoluzione.
  3. Diluizioni sequenziali della soluzione UA da 0,4 mM
    1. Diluire 5 mL della soluzione UA da 0,4 mM con 5 mL di acqua in un flaconcino di vetro da 15 mL per ottenere 10 mL di soluzione UA da 0,2 mM. Stringere il cappuccio e sonicare per 30 s.
    2. Ripetere il passaggio 3.3.1 utilizzando una quantità appropriata di UA e acqua come descritto nella Tabella 1.
  4. Preparazione dei complessi CB7-UA
    1. Aggiungere 0,75 mL della soluzione CB7 da 0,4 mM e 0,75 mL della soluzione UA da 0,4 mM in un tubo da 1,5 mL. Fissare il coperchio e sonicare per 30 s.
    2. Attendere 30 minuti per garantire la formazione di complessi host-guest.
    3. Ripetere i passaggi 3.4.1 – 3.4.2 utilizzando una soluzione UA di diverse concentrazioni.

4. Rilevamento SERS di UA

  1. Configurazione sperimentale del sistema Raman (Figura 3)
    1. Accendere il laser He-Ne da 633 nm (22,5 mW).
    2. Accendere lo spettrometro Raman modulare.
    3. Accendere il computer e avviare il software.
    4. Fare clic sull'icona Procedure guidate applicazione spettroscopia e quindi selezionare Raman.
    5. Avviare una nuova acquisizione. Imposta il tempo di integrazione su 30 s, le scansioni in media a 5 e boxcar su 0.
    6. Memorizza lo spettro di sfondo e inserisci la lunghezza d'onda del laser (cioè 633 nm).
      NOTA: il tempo di integrazione è il tempo per ogni scansione, le scansioni alla media è il numero di scansioni mediate per creare ogni spettro e boxcar è il numero di pixel vicini in media28.
  2. Formazione dei substrati SERS
    1. Aggiungere 0,9 mL della soluzione Au NP a 40 nm e 0,1 mL della soluzione complessa CB7-UA preformata in un tubo da 1,5 mL. Chiudere il coperchio e sonicare fino a quando la soluzione non cambia da rosso rubino a viola.
      NOTA: Possono essere utilizzati anche campioni commerciali di soluzione Au NP da 40 nm stabilizzati con citrato. Tipicamente, la densità ottica del picco di risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR) viene regolata a 1 tramite diluizione da campioni concentrati di soluzione madre. La concentrazione di citrato nel campione è tipicamente mantenuta come 2 mM.
    2. Trasferire la soluzione campione in una cuvetta semi-micro. Posizionare la cuvetta nel portacampioni Raman e chiudere il coperchio.
    3. Avviare la misurazione.
    4. Impostare il salvataggio automatico per registrare cinque spettri SERS consecutivi.
    5. Interrompere la misurazione e modificare il campione.
    6. Ripetere i passaggi 4.2.1 – 4.2.5 utilizzando la soluzione CB7-UA di diverse concentrazioni.
      NOTA: il tempo di aggregazione dipende dalla concentrazione di UA nei nanoaggregati, che va da 30 s per 0,1 μM UA a 30 min per 20 μM UA, a causa della differenza nella concentrazione di CB7 vuoti che ha un contributo importante nel mediare l'aggregazione di Au NP. Per il complesso CB7-UA, un portale è bloccato dalla molecola UA ingombrante, rendendolo non disponibile per il legame alla superficie Au NP e quindi incapace di mediare l'aggregazione NP21. Il campione è pronto per la misurazione quando il colore della soluzione cambia da rosso rubino a viola.

5. Analisi dei dati

  1. Elaborazione dati
    1. Scarica e installa la baseline con il plug-in alz.asimmetrico dei minimi quadrati (ALS) in Origin.
      NOTA: il plugin ALS richiede OriginPro.
    2. Inserisci i dati grezzi in Origin.
    3. Calcolare un valore medio dai cinque spettri SERS di ciascun campione. Dividere il valore per la potenza del laser (cioè 22,5 mW) e per il tempo di integrazione (cioè 30 s).
    4. Fare clic sull'icona ALS per aprire la finestra di dialogo. Impostare il fattore asimmetrico su 0,001, la soglia su 0,03 %, il fattore di livellamento su 2 e il numero di iterazioni su 20 per correggere la linea di base di ogni spettro mediato.
    5. Traccia gli spettri SERS di diverse concentrazioni di UA usando linee impilate per offset y. L'uscita dovrebbe essere l'intensità (conta s-1 mW-1) contro lo spostamento Raman (cm-1).

Risultati

Nella sintesi Au NP presentata, gli spettri UV-Vis mostrano uno spostamento dei picchi LSPR da 521 nm a 529 nm dopo 10 fasi di crescita (Figura 4A, B) mentre i dati DLS mostrano una distribuzione dimensionale ristretta man mano che le dimensioni delle NP Au aumentano da 25,9 nm a 42,8 nm (Figura 4C, D). Le dimensioni medie di G0, G5 e G10 misurate dalle immagini TEM (Figura 4E) sono rispettivamente ...

Discussione

Il metodo di sintesi automatizzato descritto nel protocollo consente di sintetizzare in modo riproducibile Au NP di dimensioni crescenti. Sebbene ci siano alcuni elementi che devono ancora essere eseguiti manualmente, come l'aggiunta rapida di citrato di sodio durante la sintesi del seme e il controllo periodico per garantire che il tubo in PEEK sia sicuro, questo metodo consente Au NP di grandi dimensioni (fino a 40 nm), che di solito richiederebbero più iniezioni manuali di HAuCl4 e citrato di sodio, da si...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

TCL è grata al sostegno del Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) e dell'UCL BEAMS Future Leader Award finanziato attraverso il premio Institutional Sponsorship dall'EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL e IPP sono grati alla Studentship finanziata dal programma di attaccamento alla ricerca A * STAR-UCL attraverso l'EPSRC M3S CDT (EP / L015862 / 1). GD e TJ desiderano ringraziare l'EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) per aver sponsorizzato il loro studentato. TJ e TCL riconoscono Camtech Innovations per il contributo alla studentship di TJ. Tutti gli autori sono grati all'UCL Open Access Fund.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
40 nm gold nanoparticlesNanoComposixAUCN40-100MNanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tubeCorning Falcon14-432-2250 mL volume
Cucurbit[7]urilLab-madesee ref. 19
Gold(III) chloride trihydrateSigma aldrich520918≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringeCole-ParmerWZ-07945-153 mL volume
Luer-to-MicroTight adapterLuerTightP-662360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubingIDEX1572360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutterIDEXWZ-02013-30Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometerOcean OpticsQE pro
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma aldrichS4641ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard ProbeDigi-SenseWZ-08516-55Type-K
Syringe pumpAladdinALADDIN2-2202 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometerDigi-SenseWZ-20250-91Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixerEppendorf5382000031With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acidSigma aldrichU2625≥99%, crystalline

Riferimenti

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