טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי ללא לייזר לביצוע ניתוח מבני מסדר גבוה יותר של חלבונים

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה לשימוש בדוסימטריה רדיקלית מוטבעת ומקור אור פלזמה לביצוע טביעת רגל של חלבון חמצון פלאש. שיטה זו מחליפה את לייזר UV מסוכן כדי לפשט ולשפר את הרבייה של חמצון פוטוכימי מהיר של מחקרי חלבון.

Abstract

טביעת רגל של חלבון רדיקלי הידרוקסיל (HRPF) היא טכניקת ניתוח מבנית מתפתחת ומבטיחה מסדר גבוה יותר המספקת מידע על שינויים במבנה החלבון, אינטראקציות בין חלבונים לחלבון או אינטראקציות בין חלבונים. HRPF משתמש ברדיקלים הידרוקסיל^(▪OH) כדי לתייג באופן בלתי הפיך משטח נגיש ממס של חלבון. המורכבות, העלות והאופי המסוכן הטמון בביצוע HRPF הגבילו באופן משמעותי את האימוץ הנרחב בביופארמה. גורמים אלה כוללים: 1) שימוש בלייזרים מורכבים, מסוכנים ויקרים הדורשים אמצעי זהירות משמעותיים; ו -2) חוסר ההתאמה של HRPF שנגרם על ידי ניקוי רקע של ^▪OH המגבילים מחקרים השוואתיים. פרסום זה מספק פרוטוקול להפעלת מערכת HRPF נטולת לייזר. מערכת HRPF נטולת לייזר זו משתמשת בטכנולוגיית חמצון הבזק מקור פלזמה באנרגיה גבוהה ובלחץ גבוה עם דוזימטריה רדיקלית בשורה. מקור אור הפלזמה בטוח יותר, קל יותר לשימוש ויעיל יותר ביצירת רדיקלים הידרוקסיל מאשר מערכות HRPF מבוססות לייזר, והדוסימטר הרדיקלי בשורה מגביר את הרבייה של מחקרים. בשילוב, מערכת HRPF נטולת הלייזר מטפלת ומתגברת על החסרונות והמגבלות שהוזכרו בטכניקות מבוססות לייזר.

Introduction

קונפורמציה של חלבונים ומבנה מסדר גבוה יותר (HOS) הם הקובעים העיקריים של תפקוד ביולוגי תקין והתנהגות חריגה¹. כנ"ל לגבי biopharmaceuticals, אשר מבנה ופעילות תפקודית תלויה בהיבטים שונים של הייצור והסביבה שלהם. שינוי Biopharmaceutical ב HOS קושרו תופעות לוואי (ADR) המיוחסים פרמקולוגיה לא רצויה תגובה אימונולוגית המטופל^2,3. המראה של ADRs התריע על התעשייה הביופארמה לתפקיד הקריטי כי חלבון HOS ממלא הבטיחות והיעילות של biotherapeutics, והם הקימו את הצורך ניתוח HOS חדש ומשופר⁴.

טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי (HRPF) היא טכניקה מבטיחה למעקב אחר השינוי בחלבון HOS. HRPF כרוך תיוג בלתי הפיך של החיצוני של חלבון עם ^▪OH ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) כדי לזהות את פני השטח נגיש ממס של החלבון^5,6,7. HRPF שימש בהצלחה לגילוי פגמים בחלבון HOS ותפקודו^8,9, לאפיין את HOS של נוגדנים חד שבטיים (mAb)^10,11,12,13, לקבוע את Kd מחייב של ליגנד¹⁴, ועוד הרבה יותר^{15,16,17,18,19}. שיטה נפוצה ליצירת ^▪OH עבור HRPF היא חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP), אשר משתמשת בלייזר UV מהיר ואנרגיה גבוהה כדי לייצר ^▪OH מפוטוליזה של H₂O₂. על פי רוב, FPOP משתמש לייזרים excimer יקר העסקת גז מסוכן (KrF) הדורש אמצעי הגנה משמעותיים כדי למנוע פגיעה בדרכי הנשימה והעין²⁰. כדי למנוע סכנות שאיפה, אחרים השתמשו בתדר מרובע ניאודימיום yttrium אלומיניום גארנט (Nd:YAG) לייזרים²¹, אשר מבטל את השימוש בגז רעיל אבל הם עדיין יקרים, דורשים מומחיות מבצעית משמעותית, ודורשים בקרות אור תועה נרחב כדי להגן על המשתמשים מפני פגיעה בעין.

למרות שניתן להשיג מידע רב באמצעות HRPF, אימוץ נרחב בביופארמה לא נענה. שני חסמים לאימוץ מוגבל HRPF כוללים: 1) שימוש בלייזרים מסוכנים ויקרים הדורשים אמצעי זהירות משמעותיים²⁰; ו -2) חוסר ההתאמה של HRPF שנגרם על ידי ניקוי רקע של ^▪OH המגבילים מחקרים השוואתיים²². כדי להחליף את השימוש בלייזר, במהירות גבוהה, אנרגיה גבוהה פלזמה פלאש פוטוליזה היחידה פותחה כדי לבצע בבטחה FPOP באופן קל. כדי לשפר את חוסר ההתאמה של ניסויי HRPF, דוסימטריה רדיקלית בזמן אמת מיושמת.

הנוהג של HRPF הוגבל על ידי חוסר תאימות המיוחס ניקוי רקע של ^▪OH²². בעוד ^▪OH הם בדיקות מצוינות של טופוגרפיה חלבון, הם גם מגיבים עם מרכיבים רבים שנמצאו בהכנות, מה שהופך אותו הכרחי כדי למדוד את הריכוז היעיל של רדיקלים זמינים כדי לחמצן חלבון היעד. וריאציות בהכנת חיץ, ריכוז מי חמצן, תכונות ליגנד, או פוטוליזה יכול לגרום הבדלי חמצון בין קבוצות בקרה וניסוי שיוצרים עמימות במחקרים דיפרנציאליים HOS. התוספת של דוזימטריה רדיקלית בזמן אמת מאפשרת התאמה של ההשפעה ^▪עומס OH ולכן מגבירה את הביטחון והשחזור במהלך ניסוי HRPF. השימוש בדוזימטריה רדיקלית ב- FPOP תואר במקום אחר^23,24,25, והוא נדון בפירוט בפרסום האחרון²⁶. כאן, אנו מתארים את השימוש במערכת פוטוליזה פלאש רומן ודוזימטריה בזמן אמת כדי לתייג אפו-מיוגלובין סוסים (aMb), השוואת רמות של חמצון פפטיד בניסוי FPOP לזה של המתקבל בעת שימוש בלייזר excimer.

Protocol

1. התקנת הצינור נימי

1. בעזרת אבן סחף סיליקה, cleave 250 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) נימי סיליקה ל 27 אינץ '. בדוק את הקצוות נימי לחתוך נקי, ישר.
2. צור שני חלונות בערך 15 מ"מ אורך על ידי שריפת ציפוי פולימיד. החל מ"הקצה התחתון" הופכים את חלון הפוצליזה הראשון ל-90 מ"מ הרחק מ"הקצה התחתון" וחלון הדוזימטר השני במרחק של 225 מ"מ מה"קצה התחתון".
   הערה: ברגע שהציפיה נשרפת נימי הוא שביר מאוד.
3. פתחו את האגוז והפרול ביציאה 5 והכניסו את "הקצה התחתון" של הנימי ממש מעבר לקצה החרוטי של הפרול(איור 1A).
4. על מודול photolysis, להסיר את כובע תא photolysis על ידי משיכת אותו ישר החוצה ולאחר מכן להסיר את מסכת מתכת רכוב מגנטי אשר יחזיק את נימי במקום.
   התראה: בתוך מכסה התא הפוקוליזה יש מראה מעוגלת, אל תאפשר לשום דבר לגעת במראה.
5. במודול dosimeter, פתח את תא הדוסימטר על-ידי דחיפת הלשונית משמאל והנפת תא הדוזימטר פתוח לימין. הסר את הקליפים המותקנים מגנטית אשר יחזיקו את נימי במקום.
6. מניחים את נימי לתוך הערוץ מחורצת בבסיס תא הפוטופליזה. מרכז את החלון הנימי באמצעות חלון תא הפוטיליזה. תוך החזקת נימי בעמדה ביד אחת, מוסיפים את המסכה המגנטית כדי להחזיק את נימי במקום. הנח את מכסה הפוטוליזה בחזרה בעמדה.
7. מניחים את נימי לתוך הערוץ מחורצת בבסיס תא dosimeter. מרכז את החלון הנימי השני על הצמצם הקטן במרכז בסיס התא הדוזימטר. תוך החזקת נימי בעמדה ביד אחת, מניחים את שני הקליפים המגנטיים בעמדה להחזיק את נימי במקום. סגור את תא הדוזימטר עד שילחץ על סגור.
8. הכנס את נימי דרך האגוז knurled על גבי המעלית נימי של אספן המוצר(איור 1B). מרחיבים את נימי רק מעל החלק התחתון של הבקבוקון.
   הערה: חשוב עבור נימי להגיע לתחתית הבקבוקון כדי להבטיח כי נימי הוא שקוע בתמיסת להרוות בעת הפעלת ניסוי.

2. התקנת לולאת הזרקה

1. השתמש צינורות טפלון עם קוטר חיצוני 1/16" וקוטר פנימי של 0.015" (381 מיקרומטר). בצע את המשוואה 1 כדי לחשב את אורך הצינור הדרוש לאמצעי האחסון הרצוי באמצעות משוואה 1.
   
   כאשר L הוא אורך הצינור במילימטרים, V הוא הנפח הרצוי במיקרוליטרים ו- d הוא הקוטר הפנימי של הצינור במילימטרים. עבור נפח הזרקה של 25 μL וקוטר פנימי של 381 מיקרומטר, אורך הצינור צריך להיות בערך 219.3 מ"מ.
   הערה: עבור כמויות של פחות מ- 20 μL, השתמש בצינורות PTFE בקוטר פנימי של 0.01 אינץ'.
2. חותכים את צינורות טפלון לאורך הדרוש באמצעות חותך צינור. בדוק את הקצוות של הצינור לחתוך נקי, ישר.
3. הכנס קצה אחד של לולאת ההזרקה החדשה דרך אחד האגוזים ומניחים פרול חדש על קצה הצינור. החזיקו את הפרול והאגוז במקום והכניסו את הצינור ליציאה 3 של שסתום ההזרקה עד שהוא יורד החוצה בשסתום. החזיקו את הצינור בחוזקה והדקו את אצבע האגוזים בחוזקה. באמצעות מפתח ברגים, להדק את האגוז 1/4 לפנות עוד יותר. הסר ובדוק את ההרכבה.
   הערה: אם הפרול אינו קבוע במיקום, התקן מחדש והדק 1/8 פנה עוד יותר. חזור על הפעולה עם הקצה השני של הלולאה.
4. ברגע שלשני הקצוות יש אגוז ופרול קבוע, בורג רופף בקצה אחד ליציאה 3 והקצה השני ליציאה 6(איור 1C). פעם בעמדה להדק את שני הצדדים לאצבע חזק אז 1/4 להפוך את האצבע בעבר חזק עם מפתח ברגים.

3. אתחל את מערכת הפוטוליזה

1. הפעל את מודולי הפוטוליזה בסדר הבא: (1) מודול Fluidics (2) מודול פוטוליזה (3) מודול דוסימטריה (4) אספן מוצר, ולבסוף (5) מחשב המערכת ולהפעיל את תוכנת הבקרה
   הערה: אפשר למודול Dosimeter לפחות חצי שעה להתחמם מהתחלה קרה.
2. צינורות שקועים לחלוטין מעמדת "שסתום" במשאבת המזרק(איור 1D)ל-10 מ"ל של חיץ. הנח את הצינור מעמדת ה"פסולת"(איור 1D)ואת הצינור מיציאה 2 ביציאת המזרק(איור 1C)למכל ריק לאיסוף פסולת.
   הערה: השתמש במאגר שהחלבון שלך יושעה בו. המאגר המומלץ הוא 10 mM NaPO₄.
3. על קרוסלה אספן המוצר, מקום 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל במיקום מסומן H ו 6.
4. אם אתה משתמש נימי מזהה μm 250, להגדיר את קצב זרימת העומס ל 500 μL / min, עיבוד קצב הזרימה ל 7.5 μL / min, ואת קצב זרימת הפסולת ל 500 μL / min.
5. חשב את השהיית ההבזק, זמן המוצר וזמן הבזבוז כדי להשתמש במצב חצי אוטומטי באמצעות משוואה 2.
   
   איפה זה הזמן בדקות, s הוא המרחק נימי במילימטרים, d הוא הקוטר הפנימי של נימי במילימטרים, ו f הוא קצב הזרימה ב μL / min.
   1. עבור עיכוב פלאש, המרחק הוא מן "הקצה התחתון" של נימי לחלון הראשון, אשר צריך להיות בערך 90 מ"מ. באמצעות נימי מזהה μm 250 וקצב זרימת עיבוד של 7.5 μL / min המדגם יגיע לחלון הפוקוליזה בעוד כ -35 שניות. אפשר לשני הבזקים ב- 1 הרץ להתרחש לפני שהדגימות מגיעות, לכן הגדר את השהיית הפלאש ל- 33 שניות.
   2. עבור זמן המוצר, הזן את כמות הזמן פתרון מוזרק ייקח לזרום משסתום ההזרקה לסוף נימי. עבור נימי מזהה 27" באורך 250 מיקרומטר, הגדר את זמן המוצר ל- 4.5 דקות.
   3. עבור זמן הפסולת, הזן את משך הזמן הכולל של פתרון מוזרק ייקח לאסוף. בשלב זה, אספן המוצר יעבור מעמדת המוצר אל בקבוקון הפסולת. עבור נפח הזרקה של 25 μL וקצב זרימה של 7.5 μL / min, להגדיר את זמן הפסולת ל 7.8 דקות.
6. יש לשטוף את לולאת ההזרקה חמש פעמים על ידי הזרקת 25 μL של מים ברמה של HPLC ליציאת ההזרקה כאשר שסתום ההזרקה מוגדר למיקום העומס.
7. באופן ידני להפוך את שסתום ההזרקה עד 'להזריק מיקום' כדי לשטוף את שאר המערכת. בחר תהליך (החוצה) בתוכנת הבקרה כדי להתחיל לזרום מים. תוך כדי תנועה, להעלות את המוצר אספן נימי להרים על ידי בחירה למעלה תחת אספן המוצר, כך שאתה יכול לראות את סוף נימי. זרימת מים דרך נימי עד טיפה צורות.
   הערה: אם טיפה אינה נוצרת, בדוק את שסתום המזרק עבור דליפות. אם יש דליפה, לשחרר את האגוז, reseat נימי, ו retighten.

4. לקבוע בפועל ^▪OH תשואה כדי לבדוק השפעות ניקוי קיצוניות מן המאגר.

1. בתוכנת הבקרה, הפעל את הזרימה על-ידי בחירה באפשרות תהליך (החוצה). בכרטיסייה 'הגדרות', הגדר את מתח ההבזק ל- 0 V. תחת הכרטיסיה שליטה ידנית במקטע נתוני dosimeter, בחר התחל נתונים + מצב אוטומטי.
2. בחר את המיקום עבור בקבוקון המוצר (H) ובקבוקון פסולת (6).
3. בחר מוכן, באופן ידני להפוך את שסתום ההזרקה עד למצב העומס, ולהזריק 25 μL של 1 mM אדנין עם 100 מ"מ H₂O₂ ליציאת ההזרקה. לאחר הזרקת, באופן ידני להפוך את שסתום ההזרקה עד למצב ההזרקה.
   הערה: פעולה זו מפעילה באופן אוטומטי את המערכת כדי להתחיל את הזרימה, להפעיל את מקור הפלזמה, ולהשיג את נתוני הדוזימטריה.
4. הגבירו את המתח על-ידי ניווט לכרטיסיה 'הגדרות' ושינוי מתח ההבזק. חזור על שלבים 4.2 ו- 4.3 באמצעות 500 V, 750 V, 1000 V ו- 1250 V. בצע את הקריאה של ספיגת אדנין בכל מתח בטריפלים.
5. בחר בכרטיסיה חישובים כדי לקבוע את הספיגה הממוצעת של כל דגימה. תחילה, לחץ על בחרולאחר מכן בחר באופן ידני את ההתחלה והסוף של ספיגת השיא. בשטח הפנוי, כתוב בתיאור של הדוגמה. חזור על הפעולה עבור כל הנתונים שנרכשו.
   הערה: בועות עלולות להיווצר ולגרום לעלייה חדה בקריאת דוזימטר. בעת בחירת נתונים כדי לקבוע ספיגה ממוצעת, השמט אזורים עם בועות.
6. העתק והדבק נתונים ב- Excel כדי לחשב את השינוי הממוצע בספיגת אדנין עבור כל מתח, ובכך לקבוע את התשואה היעילה ^▪OH.
7. חזור על שלבים 4.1-4.6 אם נעשה שימוש בתנאי דגימה מרובים (מאגר/תוספים שונים) כדי לנרמל את ▪ התפוקה היעילה ^שלOH עבור כל תנאי.

5. שינוי של חלבון כדי לזהות שינויים במבנה בסדר גבוה יותר.

1. יש לערבב 4 מ"מ אדנין עם 20 מיקרומטר חלבון ביחס של אחד לאחד כדי ליצור פתרון המכיל 2 מ"מ אדנין ו-10 מיקרומטר חלבון.
2. הפוך את הפתרון להרוות באמצעות 0.3 מ"ג / מ"ל קטלאז כדי לשבור עודף מי חמצן ו 35 mM מתונין amide להרוות את כל הרדיקלים הנותרים. Aliquot 25 μL של פתרון מרווה לתוך microtube 200 μL כך נפח שווה של מרווה ואת המוצר שכותרתו מעורבב.
3. לדלל H₂O₂ עד 200 מ"מ ולשמור על קרח.
4. בכרטיסיה תוכנת בקרה בכרטיסייה הגדרות, הפעל את מתח הפלאש ב- 0 V כדי לקבוע כל חמצון רקע.
5. בכרטיסיה בקרה ידנית, בחר התחל נתונים + מצב אוטומטי, ואחריו תהליך (החוצה), ולאחר מכן מוכן, ולבסוף להפוך את שסתום ההזרקה למטה למיקום העומס.
6. מניחים פתרון מרווה בעמדה 1 על קרוסלת איסוף המוצר. בתוכנת בקרת המערכת שנה את בקבוקון המוצר ל- 1.
7. מיד לפני ההזרקה, מערבבים 12.5 μL של תערובת אדנין וחלבון עם 12.5 μL של H₂O₂ כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מ"מ אדנין, 5 μM חלבון, ו 100 מ"מ H₂O₂. בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב, במהירות לסובב למטה, ולהזריק 25 μL באמצעות יציאת ההזרקה בתוך 10 שניות של ערבוב.
8. לעבור שסתום ההזרקה למצב להזריק ולחכות בזמן המדגם מעובד.
9. חזור על הרכישה עם 500 V, 750 V, 1000 V ו- 1250 V. בצע כל מדידת מתח משולשת.
10. חשב את הספיגה הממוצעת כמתואר בשלב 4.5. העתק והדבק את כל הנתונים ל- Excel.

6. כיבוי המערכת

1. לאחר כל הדגימות נאספו, לשטוף את יציאת המזרק ואת לולאת מדגם על ידי הגדרת שסתום ההזרקה עד למצב העומס ולהזריק 25 μL של מים HPLC חמש פעמים.
2. להפוך את שסתום ההזרקה עד עמדת ההזרקה כדי לשטוף את שאר המערכת עם מים HPLC.
3. לעצור את הזרימה, לסגור את תוכנת בקרת המערכת, ולכבות את המודולים החל אספן המוצר, מודול dosimeter, מודול פוטוליזה, ואז סוף סוף מודול fluidics.

7. הכנה לדוגמה וספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית

1. Denature את החלבון על ידי דגירה דגימות ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בנוכחות 50 mM Tris ו 1 mM CaCl₂. מצננים דגימות לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1:20 טריפסין לחלבון. לעכל את החלבון לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב מדגם. למחרת בבוקר, לסיים את העיכול טריפסין על ידי חימום דגימות ל 95 °C (60 °F) במשך 10 דקות.
2. זהה פפטידים באמצעות מערכת LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה המחוברת למערכת UPLC.
3. לטעון את המדגם הראשון על עמודת מלכודת (300 מיקרומטר מזהה X 5 מ"מ 100 Å גודל נקבובית, 5 מיקרומטר גודל חלקיקים) ולשטוף ב 5.0 μL / מ"ל במשך 3 דקות עם מים המכילים 2% ממס B (אצטוניטריל ו 0.1% חומצה פורמית).
4. להפריד את הפפטידים על C18 nanocolumn (0.75 מ"מ x 150 מ"מ, 2 מיקרומטר גודל חלקיקים, 100 Å גודל נקבובית) בקצב זרימה של 300 nL / min עם שיפוע בין ממס A (מים המכילים 0.1% חומצה פורמית) ו ממס B. השיפוע עבור elution פפטיד מורכב עלייה ליניארית מ 2 ל 35% B על פני 22 דקות, השתולל ל 95% B מעל 5 דקות והחזיק במשך 3 דקות כדי לשטוף את הטור, ולאחר מכן חזר 2% B מעל 3 דקות והחזיק במשך 9 דקות כדי לאכוף מחדש את הטור.
5. השג את הנתונים במצב יון חיובי. הגדר את מתח הריסוס ל 2400 V, ואת הטמפרטורה של צינור העברת היונים ל 300 מעלות צלזיוס.
6. השג את סריקות MS המלאות מ- 250-2000 m/z ולאחר מכן שמונה סריקות MS/MS תלויות נתונים עוקבות בשמונת יוני הפפטיד הנפוצים ביותר. השתמש דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות ב 35% אנרגיה מנורמלת כדי לפצל את הפפטידים.
7. זהה את כל הפפטידים שלא שונו שזוהו מניתוח MS/MS באמצעות תוכנת ניתוח חלבונים זמינה כנגד קובץ FASTA הדרוש המכיל את רצף החלבון ואת האנזים הפרוטאוליטי הרלוונטי.
8. חפש וכומת פפטידים ששונו באמצעות תוכנת עיבוד נתונים של HRPF. מידת החמצון עבור כל פפטיד מזוהה מחושבת על ידי חלוקת אזור השיא הכרומטוגרפי המסוכם של פפטיד שונה על ידי אזור השיא הכרומטוגרפי הכולל של פפטיד זה שונה ולא השתנה באמצעות משוואה 3.
   P = [אני(מחומצן באופן חמצנוני) X 1 + אני (מחומצן כפליים) X 2 + אני(מחומצן משולשת) X 3 + .../[ I לאמחומצן + אני(מחומצן כפליים)+ אני(מחומצן משולשת)...]
   כאשר P מציין את המספר הממוצע של אירועי חמצון לכל מולקולת פפטיד, ואני מייצג את אזור השיא של פפטיד unoxidized (Iunoxidized) ואת פפטיד עם n אירועי חמצון.

8. למחקר דיפרנציאלי, לחזור על שלבים 5-7 על המצב השני.

הערה: כדי לאשר את הרבייה, מומלץ לבצע שני משכפלים ביולוגיים בנוסף לשלשים טכניים עבור כל תנאי.

תוצאות

מקור הפלזמה בלחץ גבוה בשילוב עם דוזימטריה בזמן אמת מאפשר שליטה טובה יותר ^{של ▪}OH תשואה להתבונן שינויים במבנה חלבון בסדר גבוה יותר בצורה מדויקת יותר. התוספת של אדנין מאפשרת דוזימטר רדיקלי יעיל בזמן אמת. עם החמצון, אדנין מאבד ספיגת UV ב 265 ננומטר (איור 2A). השינוי בספיגת אדנ?...

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח תיוג נכון של חלבונים במהלך כל ניסוי HRPF. ראשית, קצב זרימה מתאים וקצב הבזק מקור נבחרים כדי לוודא שכל בולוס של המדגם מוקרן פעם אחת. זה מבטיח כי החלבון נחשף בולוס יחיד של ^▪החדש שנוצר OH. לאחר חמצון החלבון, ניתן לשנות את מבנה החלבון מסדר גבוה יותר. כדי להיות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A	any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes	Fisher Scientific	SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm)	Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS120-500
Apomyoglobin	Sigma-Aldrich
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Centrifuge	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide	Chem-Impex	03109
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32”	Molex	1068680064	any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC	Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS118-500
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	W6-4