Лазерный гидроксилрадикал белковый след для выполнения структурного анализа белков более высокого порядка

Резюме

Этот протокол представляет собой метод использования встроенной радикальной дозиметрии и плазменного источника света для выполнения флеш-окисления белка. Этот метод заменяет опасный УФ-лазер для упрощения и улучшения воспроизводимости быстрого фотохимического окисления белковых исследований.

Аннотация

Гидроксилрадикалящий белковый след (HRPF) является новым и перспективным методом структурного анализа более высокого порядка, который предоставляет информацию об изменениях в структуре белка, белково-белковых взаимодействиях или белково-лигандных взаимодействиях. HRPF использует гидроксильные радикалы^(▪ОН) для необратимой маркировки поверхности белка, доступной для растворителя. Сложность, стоимость и опасный характер выполнения HRPF существенно ограничили широкое внедрение в биофармацевтических системах. К таким факторам относятся: 1) использование сложных, опасных и дорогостоящих лазеров, требующих существенных мер предосторожности; и 2) невоспроизводимость HRPF, вызванная фоновой засоряющей ^▪ОН, которые ограничивают сравнительные исследования. Данная публикация содержит протокол работы системы HRPF без лазера. Эта безлазерная система HRPF использует высокоэнергетическую технологию окисления плазменного источника света высокого давления с поточной радикальной дозиметрией. Плазменный источник света безопаснее, проще в использовании и более эффективен в генерации гидроксильных радикалов, чем лазерные системы HRPF, а поточный радикальный дозиметр повышает воспроизводимость исследований. В совокупности система HRPF без лазера устраняет и преодолевает упомянутые недостатки и ограничения лазерных методов.

Введение

Конформация белка и связанная с ней структура высшего порядка (HOS) являются основными детерминантами правильной биологической функции и аберрантного поведения^1. То же самое относится и к биофармацевтическим препаратам, структура и функциональная активность которых зависит от различных аспектов их производства и среды. Биофармацевтические изменения в ХОС были связаны с побочными лекарственными реакциями (ADR), приписываемыми нежелательной фармакологии и иммунологическому ответу пациента^2,3. Появление АДР предупредило биофармацевтическую промышленность о критической роли, которую белок H....

протокол

1. Установка капиллярной трубки

1. Используя кремнеземный расщепляющий камень, расщепление капилляра кремнезема внутреннего диаметра (ID) до 27 дюймов. Проверьте концы капилляров на наличие чистого, прямого разреза.
2. Создайте два окна длиной примерно 15 мм, сжег полиимидное покрытие. Начиная с «нижнего конца», сделайте первое окно фотолиза на 90 мм от «нижнего конца» и второе дозиметрическое окно на 225 мм от «нижнего конца».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как только покрытие сгорает, капилляр очень хрупкий.
3. Открутите гайку и наконечник в порту 5 и вставьте «нижний конец» капилляра сразу за коническим концомнаконечника (рисунок 1А).

Результаты

Плазменный источник высокого давления в сочетании с дозиметрией в реальном времени позволяет лучше контролировать ^{выход ▪}OH, чтобы более точно наблюдать изменения в структуре белка более высокого порядка. Добавление аденина позволяет создать эффективный радикальный дозиметр в.......

Обсуждение

Существует несколько критических шагов для обеспечения правильной маркировки белков во время любого эксперимента HRPF. Во-первых, выбирается соответствующая скорость потока и скорость вспышки источника, чтобы убедиться, что каждый болюс образца облучается один раз. Это гарантирует, чт?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A	any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes	Fisher Scientific	SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm)	Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS120-500
Apomyoglobin	Sigma-Aldrich
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Centrifuge	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide	Chem-Impex	03109
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32”	Molex	1068680064	any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC	Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS118-500
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	W6-4