מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

Abstract

מבחנים שפורסמו עבור nociception מכני ב Drosophila הובילו הערכות משתנות של התנהגות. כאן, אנחנו מפוברק, לשימוש עם זחלים Drosophila, מותאם אישית ניקל טיטניום סגסוגת (ניטינול) חוטים. בדיקות מכאניות אלה דומות לסיבים של פון פריי המשמשים בעלי חוליות למדידת תפיסה מכנית. כאן, אנו מדגימים כיצד להפוך ולכייל בדיקות מכניות אלה וכיצד ליצור מינון התנהגותי מלא-תגובה מ subthreshold (טווח מזיק או רעיל) כדי suprathreshold (טווח רעיל נמוך עד גבוה) גירויים. כדי להדגים את התועלת של הבדיקות, חקרנו רגישות יתר הנגרמת על ידי נזק לרקמות בזחלי דרוזופילה. אלודיניה מכנית (רגישות יתר לגירוי מכני בלתי מזיק בדרך כלל) והיפרלגזיה (היענות מוגזמת לגירוי מכני רעיל) עדיין לא הוקמו בזחלים דרוזופילה. באמצעות בדיקות מכניות כי הם בדרך כלל מזיקים או בדיקות כי בדרך כלל לעורר התנהגות מרתיעה, מצאנו כי זחלים Drosophila לפתח רגישות יתר מכנית (הן allodynia ו hyperalgesia) לאחר נזק לרקמות. לפיכך, הבדיקות המכניות והבדיקות שאנו ממחישים כאן יהיו ככל הנראה כלים חשובים לנתח את המנגנונים המולקולריים/גנטיים הבסיסיים של רגישות יתר מכנית.

Introduction

זחלי דרוזופילה מפגינים התנהגות מתגלגלת מרתיעה אופיינית כאשר נחשפים לגירויים רעילים שונים: תרמי¹, מכני², וכימיקל³. התנהגות זו נבדלת בבירור מתנועה רגילה. כאן אנו מתארים מבחנים מכניים משופרים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך nociception מכני ורגישות מכנית.

במחקר שנערך לאחרונה, המצאנו חוטים דמויי פון פריי באמצעות חוטי ניטינול⁴. בדיקות המפעילות כוחות ולחצים שונים נעשו על ידי שינוי האורכים והקוטרים של חוטי הניטינול היוצרים כל גשוש. בדיקות מכניות כוילו וערכי הכוח הנמדדים (במילינוטון, mN) הוסבו ללחץ (קילופסקל, kPa), בהתבסס על אזור הקצה של כל בדיקה⁴. ייצור מותאם אישית של בדיקות מכניות מותר לנו ליצור subthreshold (≤200 kPa) כדי suprathreshold (225 kPa כדי 5318 kPa) לחצים, אשר יכול, באופן עקרוני, להיות מועיל לחקר רגישות יתר מכנית. באמצעות חוטים אלה פון פריי מכני משופר, הראינו כי לחץ⁴, בניגוד לכוח נבדק בעבר^2,5,6 בקורלציה עקבית יותר עם היענות התנהגותית מרתיעה בזחלים Drosophila. בדיקה מכנית משופרת המתוארת כאן גם עזר לזהות גורם גדילה אנדותל כלי דם שמורות (VEGF) הקשורות קולטן טירוסין קינאז איתות מסלול המסדיר nociception מכני זבובים וחולדות⁴.

אלודיניה מכנית והיפרלגזיה, שתי אופנים של רגישות יתר, הם understudied יחסית בזחלים Drosophila, לעומת תרמית (חום וקור) ואמצעים חושיים כימיים^3,7,8,9,10. זה כנראה בשל היעדר בדיקות מכניות ספציפיות המשתרעות מגירויים מזיקים לטווח רעיל גבוה^2,5,6. גירוי בלתי מזיק בדרך כלל המעורר את התנהגות מתגלגל מרתיע טיפוסי לאחר זחלים Drosophila לחוות נזק לרקמות^3,7 נקרא allodynia. תגובה מתגלגלת מוגזמת לגירוי רעיל בדרך כלל ידועה בשם hyperalgesia⁷. גירויים רעילים מוגדרים ככאלה שמעוררים נזק לרקמות ויכולים להפעיל nociceptors¹¹. גירויים רעילים המועברים לזחלי דרוזופילה פוגעים באפידרמיס המחסום, בנוירונים החושיים ההיקפיים^3,4,7, או שניהם.

במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לפברק ולכייל בהתאמה אישית בדיקות מכניות דמויי פון פריי המתאימות לזחלים של דרוזופילה. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בבדיקות אלה כדי לבדוק תגובות נוציפציביות מכניות בזחלי דרוזופילה. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר את התועלת של בדיקות אלה באמצעות אותם כדי להדגים את נוכחותם של רגישות יתר מכנית, הן allodynia והן hyperalgesia, בעקבות נזק לרקמות בזחלים Drosophila (ראה תוצאות מייצגות).

Protocol

1. בניית בדיקה מכנית

1. חותכים כל חוט ניטינול (איור 1B), בניצב לציר הארוך שלו, לאורך שצוין (איור 1M-N) באמצעות חותך תיל קטן (איור 1C). הסיבים מגיעים בשלושה קטרים שונים שנקבעו מראש (איור 1B).
   הערה: האורכים המפורטים כאן הם מדריך להשגת הלחצים המשוערים שצוינו, באמצעות פרוטוקול דומה לבניית ההר. בסופו של דבר, ללא קשר לאורך חתך הסיבים, ועומק החור בהר, יש למדוד / לכייל את הסיבים על איזון כדי להשיג את ערך הכוח / הלחץ המדויק.
2. בדוק את קצה הסיב תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להבטיח שלא יישארו קצוות חדים או לא סדירים מכיוון שאלה עלולים לגרום נזק לרקמות לעור הזחלים ולהפריע לכיול.
3. החלק ידנית את הקצוות החדים של הגשושית המכנית באמצעות אבן חידוד עד שלא יימשכו אי-סדרים חדים(איור 1D).
4. לעשות חור לקראת הסוף של מקל ארטיק עץ (איור 1E) באמצעות מחט hypodermic (ראה לוח החומרים). הכנס את המחט לפחות באמצע גובה מקל הארטיק (איור 1E). זה יוצר תא להחדרת חוט הניטינול.
5. מרחו דבק עץ על חוט ניטינול יחיד (איור 1F)והכניסו את חוט הים מצופה הדבק לחריץ המחט במקל ארטיקמעץ (איור 1G). אפשר להתייבש במשך ~ 5 שעות.
6. כייל כל בדיקה מכנית על-ידי לחיצה עליה כנגד סולם עד שהגשושית המכנית תתכופף (איור 1H-L). זוהי הנקודה של כוח מקסימלי שניתן לרשום גרם. בהתאם לקוטרי הסיבים (מוגדרים מראש) והאורכים (שנקבעו על ידי המשתמש) ניתן ליצור מגוון רחב של כוחות ולחצים.
7. המר את המסה שנרשמה בשלב 1.6 כדי לכפות במילינוטון (mN) באמצעות הנוסחה f = ma (כוח שווה למסה כפול תאוצה כבידתית). ו: כוח; ז: מסה; a: האצת כבידה (9.8^{מטר/שניה 2)}(איור 1M).
8. לבסוף, המר את הכוח המחושב ללחץ (כוח/אזור) בקילפסקאל (kPa) על-ידי חלוקת הכוח הנמדד לפי שטח הפנים של קצה הסיב (איור 1M). כדי לחשב את האזור, להמיר את הקוטר של חוטי nitinol שונים מ אינצ'ים (0.04", 0.06", ו 0.08") לסנטימטרים. לאחר מכן, πr² (שם, r = רדיוס חוטי הניטינול) קובע את האזור (ראה איור 1M). הכנת בדיקות מרובות באמצעות חוטים בקוטרים ובאורכים שונים תיצור ערכה מלאה המשתרעת על פני טווח התגובה לזחלים של דרוזופילה (ערכת מדגם המוצגת באיור 1N).
   הערה: בדוק כל בדיקה מכנית לפחות כל 3-4 שבועות. כאשר הלחץ חורג ביותר מ-± 3% מהמדד המקורי, יש לפברק בדיקה מכנית חדשה.

2. הכנת זחלים

1. העלה את זן הבקרה(w¹¹¹⁸⁾צאצאי זחלים או זחלים המכילים את הטרנסגנים ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (להדמיית נזק לנוירונים חושיים) על מזון סטנדרטי באינקובטור 25 °C (60 °F). בדרך כלל, מניות נשמרים באופן שגרתי ב 18 °C (69 °F), אבל שני ההורים וצאצאי הזחל גדלים ב 25 °C (69 °F) על מזון קמח תירס סטנדרטי לניסויים.
   הערה: זבובים בוגרים (חמישה זכרים ועשר נקבות, יחס 1:2) נשמרים בבקבוקוני הזבוב, כדי לאפשר הטלת ביצים, כ-24 שעות. הזמן לאחר הטלת ביצים (AEL) מתחיל ממתי המבוגרים מוסרים.
2. לאסוף את הזחלים instar השלישי, לאחר כ 96 שעות של הטלת ביצה, על ידי התזת בעדינות מי ברז לתוך מזון זבוב רך המכיל את הזחלים. זחלים נודדים שעזבו את האוכל, או שהתנצחו על ספירקלים אצטרוריים או אחוריים, גדולים / ישנים מדי לבדיקה זו. זחלי instar השני (~ פחות מ 4 מ"מ אורך) הם קטנים מדי.
3. יוצקים את תכולת המזון הזבוב הרך לצלחת פטרי בגודל סטנדרטי נקי (100 מ"מ x 15 מ"מ).
4. בעזרת מלקחיים, מיין כוכב שלישי בינוני, בגודל בינוני, זחלים (ראו איור 2A)מזחלים קטנים יותר (כוכב שני ובכוכב שלישי מוקדם) או זחלים גדולים יותר (כוכב שלישי מאוחר או נודד). מומלץ לבצע מניפולציה עדינה עם מלקחיים כדי למנוע נזק לרקמות לזחלים.
   הערה: ההעברה באמצעות מלקחיים מבוססת בעיקר על מתח מים ולא על ידי הפעלת לחץ על הזחלים עם להבי המלקחיים. חלופה לשימוש במלקחיים לתמרון זחלים היא מברשות צבע רכות. עם כל אחד מהכלים, המשתמש צריך לתרגל העברת בעלי החיים, כדי לא לגרום נזק לרקמות לא מכוונות שעלול לסבך מדידות התנהגותיות.
5. מעבירים את זחלי ה-instar האמצעיים, באמצעות מלקחיים, לצלחת פטרי קטנה (30 מ"מ x 15 מ"מ) המכילה תקע קטן של מזון מעופף לח במים בטמפרטורת החדר. שמור את הזחלים בצלחת פטרי הקטנה עד הניסויים מבוצעים, אבל לא יותר מ 20 דקות.
   הערה: בדרך כלל, העברת 20-30 זחלים לתקע המזון ייתן מספר הולם במשך 20 דקות של מבחנים התנהגותיים.

3. מבחני תפיסה מכניים

1. הנח זחל אינסטאר באמצע השלישי (באמצעות מלקחיים) על משטח דק של ויניל שחור או כהה תחת סטריאומיקרוסקופ שדה בהיר. הצבע הכהה מספק ניגודיות המשפרת את ההדמיה של הזחל. עדיף לקבל חתיכת ויניל כהה מטלטלין בחופשיות כי זה מאפשר למשתמש ליישר את הזחל מבלי לגעת או לפגוע בו.
2. שים את אורות הסיבים האופטיים בין עדשות המטרה מיקרוסקופ כרית ויניל שחור או כהה; זה יאפשר תאורת ניגודיות גבוהה נאותה לראיית הזחל.
3. השלך זחלים שאינם מפגינים תנועה רגילה לאחר ההעברה לפנקס. אלה יכולים להפריע לתגובה התנהגותית nociceptive נורמלי. לתנועה רגילה, ראה וידאו 1.
4. לנגב, באמצעות מגבת נייר, כל מים עודפים המקיפים את הזחל שעלול לגרום הזחל לצוף על כרית ויניל.
5. כוון את הזחל על ידי הזזת כרית הויניל הכהה. הראש/הפה של הזחל צריך להצביע שמאלה אם אתה ימני ולהיפך אם אתה שמאלי(איור 2A-B).
6. החל את החללית המכנית שנבחרה, בדרך כלל עבור 1-2 שניות, על הצד הגבי האחורי של הזחל בחלק הבטן בקירוב A8 (ראה איור 2B),עד שהגשושית מתכופפת ומעוררת את כמות הלחץ שנמדדה קודם לכן (איור 2C). חשוב שהגשוש ילחץ על פני השטח הגביים של הזחל וידחס את הזחלים לתוך הפנקס שמתחת בנקודת המגע של הגשוש.
   הערה: בנקודת המגע בין קצה חוט הניטינול לבין קוטיקל-אפידרמיס הגב, בדיקות נמוכות מ -2,300 kPa, בעיקר להתכופף מבלי לחדור את הקוטיקל ואת הרקמות הבסיסיות. בדיקות כאלה משפיעות לעתים רחוקות על תמותת^{הזחלים 4}. בלחצים גבוהים יותר (>5,000 kPa) הבדיקות הן להתכופף, מדי פעם, לחדור את הקוטיקל ואת הרקמות הבסיסיות. ניקוב הזחלים פוגע בהישרדות הזחלים^4, ואם נצפה, זחלים אלה מושלכים בדרך כלל מניתוח התנהגותי.
7. רשום את התגובה ההתנהגותית עבור כל זחל. תגובה nociceptive חיובית (וידאו 2) מצוין אם הזחל מראה גליל שלם של 360 ° לאורך ציר גופו בתוך 3 s. תגובות אחרות (ניסיון להסתובב, זחילה מהירה ומתנועע) נחשבות שליליות לצורך מבחנה זו.
   הערה: זחלים מגורה עם גירוי מכני subthreshold (200 kPa) לא לעורר את התגובה nociceptive טיפוסי או מתגלגל (וידאו 3). זחלים מסוימים אכן הציגו תגובות מגע מהירות קדימה או קלות כגון שינויים בכיוון התנועה.
8. השלך את הזחל והכן את הבא לבדיקה, חוזר על שלבים 3.1 עד 3.7.
9. חזור על שלבים 3.1–3.7 עד להגעה למספר הזחלים הרצוי (שלוש עד שש קבוצות של n = 10 זחלים שימשו כאן עבור כל גשוש).
   הערה: בעת שימוש בבדיקות מכניות בלחץ נמוך יותר (174-462 kPa), הבדיקה תיקח יותר זמן לכל זחל. הסיבה לכך היא כי קצה חוטים ארוכים יותר מתנדנד יותר, מה שהופך אותו קשה יותר לתקוע את הזחל במרכז קטע A8. תרגול הוא הכרחי עם בדיקות אלה.

4. מיקרוסקופיה קונפוקלית להערכת מורפולוגיה עצבית

1. מניחים זחל (של גנוטיפ ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP כדי לתייג נוירונים חושיים) מגורה בעבר עם חוט ניטינול לתוך תא האתריזציה בתוך צנצנת קופלין המכיל 10 מ"ל נושא כדור צמר גפן ספוג ~ 1 מ"ל של אתר diethyl. תן לזחל לשבת בתא ~ 5 דקות.
   הערה: פרוטוקול מפורט לאתריות מסופק במחקר קודם שפורסם על ידי הקבוצה שלנו¹².
2. שוטפים את הזחל בעדינות מתא האתריזציה לצלחת פטרי קטנה.
3. הכינו שקופית מיקרוסקופ אחת, שני כיסויים קטנים (22 x 22 מ"מ) וכיסוי אחד ארוך (22 x 54 מ"מ) (ראו טבלת חומרים).
4. הוסף טיפות קטנות של אתר:פתרון שמן (1:5 יחס של אתר אתיל לתמיסת שמן halocarbon, ראה טבלה של חומרים) לשני קצות השקופית, ולאחר מכן למקם את כיסויים קטנים על גבי טיפות קטנות. סידור זה יוצר פער חלל קטן שבו הזחל יכול להתאים.
   הערה: לחץ על הכיסויים הקטנים כנגד שקופית המיקרוסקופ עד שיהיה קשה להחליק.
5. הוסף כמה טיפות של אתר:פתרון שמן באמצע שקופית המיקרוסקופ ולאחר מכן למקם את הזחל, באמצעות מלקחיים, על מרכז שקופית מיקרוסקופ (בין coverslips קטן). ודא כי הציר הקדמי של הזחל מקביל לצד הקצר של השקופית וכי הצד הגבי פונה כלפי מעלה.
6. מכסים את הזחלים עם כיסוי ארוך ממוקם על גבי הזחל ואת שני כיסויים קטנים יותר.
   הערה: לחץ בנדיבות על הכיסוי הארוך עד שהזחל כמעט שטוח.
7. קטע תמונה A8 של הזחל באמצעות מיקרוסקופ confocal (ראה טבלה של חומרים)באמצעות אורך גל לייזר 488 (GFP).
   הערה: תמונה הזחל מיד בגלל הרדמה דרך אתר יתפוגג במהירות (~ 5-10 דקות) ואת הזחל יתעורר ולזוז, אשר יסבך הדמיה נוספת.
8. לכוד תמונות מחסנית Z ברזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים באמצעות צמצם מספרי 20x (NA) 0.7 עדשה אובייקטיבית יבשה בזום 1x, גודל צעד של 1.5 מיקרומטר.

5. כמות של נזק לרקמות

1. אסוף והמר את תמונות הערימה מסדרת Z, מסעיף 4.8, להקרנת Z יחידה (שיטוח של תמונות מרובות שצולמו במישורי מוקד שונים לתמונה אחת ללא הפרדות צבע). זה יכול להתבצע באמצעות תוכנה מסחרית זמינה (למשל, אולימפוס Fluoview) או כל פלטפורמת קוד פתוח שווה ערך, למשל, פיג'י / תמונה J. שמור את הקרנת Z יחיד בפורמט TIFF.
2. פתח את תוכנית ניתוח התמונה פיג'י/ImageJ.
3. לחץ על קובץ, מתוך שורת התפריטים ובחר פתח מהחלון המוצג.
4. בחר את הקרנת התמונה הבודדת המאוחסנת, שנשמרה בתבנית TIFF, שיש לנתח.
5. לחצו על 'עריכה'מתוך שורת התפריטים ובחרו באפשרות 'היפוך' מהחלון המוצג.
6. לחץ על התמונה, מתוך שורת התפריטים ולאחר מכן בחר התאם, מהחלון המוצג, ולבסוף בחר באפשרות בהירות/ניגודיות.
7. בחרו באפשרות 'צורה ביד חופשית' מתוך סרגל הכלים למדידת אזור הרווח (אם קיים).
8. לחצו על 'נתח'מתוך שורת התפריטים ובחרו באפשרות 'מדידה'. זה יציג את האזור של הפער או הפצע.

תוצאות

פיתחנו גשושיות מכניות מותאמות אישית, תוך שימוש בצינור ניטינול(איור 1A,N),כדי לעורר התנהגויות מעוררות מכנית ויצרנו עקומת תגובה מלאה של מינון התנהגותי באמצעות בדיקות מכניות בלתי מזיקות ומזיקות בעוצמה משתנה(איור 2D)המוכיחות כי ניתן להשתמש בבדיקות אלה כדי ללמוד את הבסיס (בהיעדר פציעה) תפיסה מכנית.

תוצאות הבדיקה ההתנהגותית שלנו קבעו כי בדיקות המפעילות לחצים מתחת ל- 200 kPa (~ 1.57 mN) (איור 1M), כאשר הן מוחלות על זחלי דרוסופילה, אינן מעוררות תגובת גלגול מרתיעה (איור 2D ו- Video 3). כצפוי, בדיקות מכניות תת-קרקעיות או לא רעילות אלה (175 kPa או 200 kPa) לא עוררו נזק לרקמות עצביות נראות לעין (איור 2E). בגלל שהם לא לגרום נזק, בדיקות כאלה יכול להיות שימושי כדי להעריך allodynia מכני (רגישות יתר לגירויים מכניים שאינם רעילים בדרך כלל). לעומת זאת, בדיקות suprathreshold או רעילות (מ 462 kPa ל 5,116 kPa), עורר תגובה התנהגותית מוגברת (איור 2D) באופן תלוי מינון - עם לחצים גבוהים יותר לעורר תגובות התנהגותיות חזקות יותר. כצפוי, לחץ מכני suprathreshold גם גרם נזק לרקמות תלויות מינון לנוירונים החושיים ההיקפיים עצמם (איור 2E). האזור הנמדד של נזק לרקמות (בμm² ± סטיית תקן) שנלקח מארבעה זחלים לכל קבוצה היו: 2,051.03 ± 703.81 (462 kPa), 5,102 29 ± 1,004.67 (2,283 kPa) ו- 12,238.83 ± 3,724.11 (5,116 kPa). לפיכך, לחצים הגדולים או שווים ל- 462 kPa (~ 63 mN), המעוררים תגובת גלגול מרתיעה (ב-25% או יותר מהזחלים) וגורמים לנזק לרקמות עצביות גלויות (איור 2E), עשויים להיות מתאימים לחקר היפרלגזיה מכנית (רגישות יתר לגירויים מכניים מזיקים בדרך כלל). בדיקות מכניות Nociceptive (≥462 kPa) תמיד לגרום נזק לרקמות (n = 10, מוערך באופן איכותי) אבל לא תמיד לעורר תגובה מתגלגלת מרתיעה.

כדי להעריך רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia), השתמשנו במודל זחל Drosophila מבוסס היטב של רגישות nociceptive המשתמשת אור אולטרה סגול (UV) הקרנה כדי לגרום נזק לרקמות^7,12. בדיקה זו סייעה לנתח את המנגנונים הגנטיים והתאיים של רגישות יתר תרמית^8,9^,10,13,14,15. כדי לקבוע אם טיפול UV גורם allodynia מכני, באמצע השלישי כוכב שליטה (w¹¹¹⁸⁾זחלים היו מוקרן מדומה או UV מוקרן (15-20 mJ / cm²) (איור 3A). לאחר מכן, הזחלים נבדקו באופן התנהגותי ב 2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות לאחר הטיפול עם בדיקה מכנית subthreshold בדרך כלל (200 kPa, 1.57 mN). כ-20% מהזחלים הגיבו כבר ב-2 שעות לאחר טיפול UV, בעוד ש-50% השיבו ב-4 שעות, לעומת 6.6% ו-8.3% בעלי חיים מדומים מוקרנים ב-UV, בהתאמה (איור 3B). זה מציין כי נזק לרקמות הנגרמת על ידי UV גורם allodynia מכני ב 4 שעות לאחר הקרנה. בנקודות זמן מאוחרות יותר (8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות) התגובה ההתנהגותית של הזחלים שטופלו UV היה בטווח של 16%-20% מגיבים (ממוצע של n = 3-6 סטים של 10 זחלים כל אחד), גדל מעט (אבל לא מובהק סטטיסטית) לעומת קבוצת הביקורת מדומה מוקרן (בטווח של 3%-6% של המגיבים, ממוצע ממוצע של n = 3-6 קבוצות של זחלים כל אחד) (איור 3B).

כדי לחקור היפרלגזיה מכנית, נעשה שימוש בלחץ suprathreshold (462 kPa, 3.63 mN), שבדרך כלל גורם לתגובה מתגלגלת מרתיעה בכ-20% מהזחלים (איור 2D)וגורם לנזק עצבי לרקמות העצביות (איור 2E). מרחנו את הגשושית 462 kPa על הצד הגבי של הזחלים עם או בלי נזק לרקמות הנגרמות על ידי UV(איור 3A). מצאנו כי זחלים נבדקו ב 4 שעות, 8 שעות, ו 16 שעות לאחר טיפול UV הראו עלייה משמעותית בתגובה מתגלגל מרתיעה, עם 4 שעות להיות השיא של רגישות יתר התנהגותית (~ 60% מגיב); בעלי חיים מדומים מוקרנים UV הראו ~ 27% של תגובה מרתיעה (איור 3C). בדומה לאגודיניה מכנית, התגובה ההתנהגותית ב 8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות של בעלי חיים שטופלו UV (בטווח של 36%-42%) מבחינה סטטיסטית לא ניתן היה להבחין בין הזחלים שאינם מטופלים (בטווח של 20%-26%). הזחלים בשלב ה-instar השלישי המאוחר אכן הראו ירידה קלה בתגובה ההתנהגותית הבסיסית בהשוואה לשלב ה-instar השלישי האמצעי. אנו משערים שזה יכול להיות גם על ידי גודל מוגבר של הזחלים (איור 2A) או עובי מוגבר של הקוטיקל המכסה את הגוף. עובדה זו יכולה להסביר מדוע בשלב מאוחר יותר של הפיתוח הטיפול UV אינו גורם רגישות מכנית גדולה יותר, כפי שנצפה 4 שעות לאחר טיפול UV.

יחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך זחלים Drosophila לפתח הן אלודיניה מכנית hyperalgesia מכני בעקבות נזק לרקמות הנגרמת על ידי UV. זמן השיא של allodynia מכני hyperalgesia זהה, 4 שעות לאחר טיפול UV; עם זאת, hyperalgesia מכני יש זנב זמני בולט יותר כפי שהוא חוזר לבסיס לאט יותר בהשוואה allodynia מכני.

איור 1: פיתוח כלי דמוי פון פריי להערכת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. (A) תמונה של בדיקה מכנית המשמשת לחקר תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. (B)חוטי ניטינול וקטריהם היחסיים מוצגים בקנה מידה יחסי. (C)תמונה של חותך התיל האלכסוני המשמש לחיתוך חוטי הניטינול. (ד)החלקת הקצוות החדים של חוט הניטינול החתוך באבן מחדדת. (E)מחט Hypodermic נהג לעשות חור לתוך ידית מקל ארטיק עץ של החללית. קצה המחט צריך להגיע לפחות לחצי מגובה מקל הידית להחדרת חוטים מאובטחת. (F-G) מצורף של חוט הניטינול על ידי הדבקה לתוך ידית מקל ארטיק עץ עם חור הכנסה. (H-L) כיול של בדיקות מכניות על ידי לחיצה עליהם כנגד סולם. (ז)ערכים של כוח (ב- mN) ולחץ (ב kPa) שנוצר על ידי בדיקות מכניות שונות. אורכו של כל חוט ניטינול המשמש לבניית הבדיקות (P1-P10; P: בדיקה) מפורט בסנטימטרים (ס"מ). (N)תמונה של קבוצה שלמה של בדיקות מכניות, החל 174 kPa ל 5,116 kPa. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מבחני nociception מכניים: חוטים דמויי פון פריי יוצרים עקומת תגובת מינון של התנהגות מתגלגלת מרתיעה וגורמים נזק לרקמות לנוירונים חושיים. (A)תמונות של השלבים השונים (כוכב שני ושלישי) של זחלי דרוזופילה. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (B) קריקטורה של הנוף הגבי של הזחל השלישי instar Drosophila. הנקודה האדומה מציינת את קטע הבטן שבו החללית המכנית מוחלת. T: קטע בית החזה; A: קטע בטן. ציוני דרך אנטומיים אחרים מסומנים. (C) קריקטורה של הבדיקה: בדיקה מכנית מוחלת על הצד הגבי של הזחל עד שהוא מתכופף על פני השטח מתחת ולאחר מכן מוחזק במשך 2 s. אם הלחץ גבוה מספיק, זה מעורר תגובה מתגלגלת מרתיעה עם שחרורו. (D) תגובת מינון התנהגותי; כל נקודה כחולה מייצגת את אחוז הזחלים שהגיבו, בגלגול מרתיע, לגירוי המכני בתוך קבוצה של 10 בעלי חיים. עלילת כינור של אחוז התנהגות מתגלגלת מרתיעה הנגרמת על ידי בדיקות מכניות שונות. kPa: קילופסקלים. התוויית תיבות מייצגת חציון (ירוק), שפם (אדום) מייצג את האחוזונים העשירי וה-90. (ה)נזק לרקמות: זחלי כוכב שלישי (של גנוטיפ ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP לתיוג נוירונים חושיים nociceptive) נבדקו בקטע הגב A8 עם הלחצים שצוינו. לאחר מכן נבדקו הנוירונים החושיים DdaC Class IV המסווגים באופן פלואורסצנטי (על פני קו האמצע הגבי) (ראו סעיפים 4 ו-5). אזורים לבנים (כוכביות אדומות) מייצגים פערים או נזק לרקמות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. בלוח ב', הזחל מוצג בתצוגה הגבית, ואילו ב-C הוא התצוגה לרוחב. בדיקות מכאניות שנלחצו כנגד צד הקוטיקל-אפידרמיס הגבי של הזחל מייצרות כיס דמוי דיכאון בנקודת המגע של קצה הגשוש והסביבה. הקו השחור המוצק המעוקל לכיוון הצד הגחוני הוא החלק העליון של הכיס, ואילו הקו הצדדי האפור המקווקו מייצג את הצד הצדדי ואת תחתית הכיס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: רגישות יתר מכנית לאחר נזקי UV. (A)סכמטי של העיצוב הניסיוני לבדיקת רגישות. באמצע השלישי כוכב היו מטופלים מדומה (שאינם UV) או UV מוקרן. לאחר מכן בוצעה מבחני nociception מכניים בנקודות זמן שונות (2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 16 שעות ו-24 שעות) לאחר טיפול מדומה או הקרנה. (ב) אלודיניה מכנית: אחוז הזחלים המציגים גלגול מרתיע לאחר בדיקה עם גירוי מכני תת-קרקעי או לא רעיל בדרך כלל (200 kPa, 1.57 mN) בנקודות הזמן שצוינו לאחר טיפול מדומה או הקרנת UV. (ג)היפרלגזיה מכנית: אחוז הזחלים המציגים גלגול מרתיע לאחר חיטוט עם suprathreshold בדרך כלל או גירוי מכני רעיל (462 kPa, 3.63 mN) בנקודות הזמן המצוין לאחר טיפול מדומה או הקרנת UV. קווי שגיאה מציינים ממוצע +/- SEM. נעשה שימוש בבדיקת tדו-זנבית לניתוח סטטיסטי: *p < 0.05, **p < 0.01; ns: לא משמעותי. כל נקודה אדומה, בחלוניות B ו- C, מייצגת את היחס הממוצע של 10 זחלים, n = 3-6 סטים לכל נקודת זמן/תנאי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: תנועה רגילה של זחלי דרוזופילה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: גירוי מכני רעיל של זחלי דרוזופילה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 3: גירוי מכני subthreshold של זחלים Drosophila. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

שינינו בדיקה מכנית הוקמה^1,2,16 באמצעות בדיקות מכניות מותאמות אישית מפוברק חוטי ניטינול. סגסוגת מתכת זו מאפשרת לנו להשתמש חוטים בקוטר קטן יותר המתאימים לגודל של זחלי Drosophila. מונופילמנטים מבוססי קו דיג שלטו בתחום nociception מכני לטוס עד כה^2,5,6,16. חוטי הניטינול שלנו שומרים על צורתם ומדדו לחץ במשך כ -3-5 חודשים (מניסיוננו). על ידי שינוי האורך והקוטר של חוטי הניטינול, המשתמש יכול ליצור מגוון רחב של לחצים המשתרעים מתת-כותרת לתגובה מתגלגלת כמעט מלאה. בפרט, ביצוע בדיקות subthreshold הוא פשוט יותר עם חוטי ניטינול בקוטר קטן יותר. באמצעות בדיקות אלה, מצאנו כי לחץ, ולא כוח, מעורר תגובות התנהגותיות nocifensive עקבי יותר⁴. אנו מדגימים כאן, באמצעות מודל רגישות nociceptive UV-induced מבוסס היטב^7,10,13, כי חוטים אלה הם גם כלי שימושי לחקר רגישות יתר מכנית – allodynia ו hyperalgesia.

מחקרים קודמים באמצעות בדיקות מכניות מפוברק מקו דיג הובילו שונות מסוימת בתגובה התנהגותית^2,6,16,17. מספר גורמים עשויים להסביר זאת. ראשית, מכיוון שהלחץ הוא המשתנה החשוב, ההבעה של קצה הסיב כך שהוא מעוגל ואין לו קצוות חדים היא קריטית. שנית, דיווח על ערכי לחץ ולא רק כוח חשוב לשחזור הניסויים, מכיוון שבדיקות מכניות שונות המייצרות כוחות דומים יכולות לעורר לחצים שונים⁴. שלישית, חיוני ליישם רק גירוי מכני אחד לכל זחל באמצעות בדיקות רעילות, מכיוון שבדיקות כאלה מייצרות נזק לרקמות תלויות מינון ברמות האפידרמיס⁴ והנוירונים החושיים (איור 2E). גירוי מכני רעיל שני או עוקב, לאחר נזק לרקמות כבר המושרה, יכול לפגוע בתפקוד של נוירונים חושיים היקפיים מושפעים לעורר תגובה התנהגותית שונה. במחקר אחר, זחלים מגורה פעמיים עם בדיקות מכניות רעילות הציגו בעיקר תגובה התנהגותית^{משופרת 5}, מה שמרמז על התפתחות של רגישות מכנית חריפה (hyperalgesia), אשר עשוי לנבוע נזק לרקמות עורר על ידי הגירוי המכני המזיק הראשון. לעומת זאת, מחברים אחרים 6 דיווחו על^תגובה התנהגותית מעורבת (מוגברת או מופחתת), המצביעה על כך שהתגובה ההתנהגותית שהשתנתה יכולה להיות בגלל נזק/תפקוד לקוי של הרקמה העצבית. גירוי כל זחל רק פעם אחת מבטל שונות אפשרית בתגובות התנהגותיות הנובעות רגישות או נזק לרקמות. רביעית, אנו מגרים מכנית קטע A8, שהוא אחורי יותר מאשר מחקרים קודמים (אזורים מועדפים A3-A4)^2,5,16. בדיקות בין ~ 3,900 kPa ו 5,300 kPa להחיל על כל קטע A2 או A8 לא הראה שום הבדלים התנהגותיים⁴. בנוסף, A8, לעומת A2-A4, קל יותר לעורר עם בדיקות מכניות המייצרות לחצים נמוכים יותר (<300 kPa) כי הזחל הוא דק יותר באזור זה ולכן בקלות רבה יותר דחוס. מחקרים אחרים הראו כי גירוי מכני רעיל של הקצה האחורי של הזחל (מועבר על ידי סיכת חרקים נוקשה, מוחזק עם מלקחיים) עורר בעיקר קטר קדמי, ולא תגובה מרתיעה או מתגלגלת¹⁸. תגובה התנהגותית שונה זו יכולה להיות בשל הבדלים במאפיינים של החומרים המשומשים (חוטי ניטינול ניתנים לכיפוף לעומת סיכת חרקים בלתי דחוסה) או ללחצים שונים המועברים לזחלים (ערך הלחץ של סיכת החרקים לא דווח).

הפיתוח של מבחני nociception מכני עבור זחלים Drosophila אפשרה לשדה לגלות כי ערוצי יון חושיים מכניים שונים ומעגלים עצביים לתווך nociception מכני^5,6,16,17. עם זאת, המחקר של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) פיגר, לעומת רגישות של אופני החושים האחרים - חום⁷, 8^,10,13,14, קר⁹, ו כימי³. השהיה זו עשויה לנבוע בחלקה מהיעדר בדיקות מכאניות מתאימות שיכולות ליצור טווח תגובה מלא המשתרע על פני תת-אחיזה ללחצים suprathreshold. חשיבות מיוחדת, במיוחד להערכת allodynia מכני, הם בדיקות subthreshold שאינם מעוררים תגובה מתגלגלת מרתיעה מזחלים לא נפגעים. המשמעות של הבדיקות המכניות המשופרות שלנו היא שניתן לפברק אותן כדי להתפרס על פני גירויים בלתי מזיקים (subthreshold ~ 174 kPa–200 kPa) או את הטווח הנמוך עד רעיל גבוה (suprathreshold ~ 225 kPa כדי ~ 5,116 kPa). כאן, אנו מדגימים באמצעות חוטים דמויי nitinol פון פריי כי זחלים Drosophila לפתח הן allodynia מכני היפרלגזיה מכני לאחר הקרנת UV. הרגישות המכנית מראה כמה הבדלים בהשוואה לרגישות תרמית. הן תחילתה והן שיא הרגישות המכנית מוקדם יותר (~ 4 שעות) בהשוואה לרגישות תרמית (חום) (~ 8 שעות להיפרלגזיה ו ~ 24 שעות לאגודיניה)⁷. בנוסף, allodynia מכני hyperalgesia הם בו זמנית (שניהם שיא ב ~ 4 שעות). יתר על כן, בעוד רגישות חום (allodynia ו hyperalgesia) פותר לחלוטין בנקודות זמן מאוחר יותר⁷, רגישות יתר מכנית הציג זנב ארוך שנשאר מעט מעל קו הבסיס. רגישות קרה בדרוזופילה כרוכה במתג בהתנהגויות מעוררות קור 9 ובהופעתן של^{התנהגויות} חדשות מעוררות קור – תופעה שאינה נצפית בגירוי מכני. הבדלים אלה בהתנהגויות התפרצות, משך זמן ונצפות מצביעים על כך שכל שיטה חושית עשויה להיות נשלטת על ידי מסלולי איתות שונים. שילוב מבחני הרגישות המתוארים כאן עם הכלים הגנטיים החזקים הזמינים בדרוסופילה אמור לאפשר ניתוח גנטי מדויק של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) שנצפו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker	Fisher Scientific	02-540C	Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.
Black (Arkansas) bench stone	Dan’s Whetstone	SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C	Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/
Confocal microscope	Olympus	FV1000	Any equivalent confocal microscope will do
Coplin Jar	Fisher Scientific	08-816	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816
Diethyl ether	Fisher Scientific	E138-500	For anesthetizing larvae.
Etherization chamber			This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.
Fiber Optic Light Guide	Schott AG	A08575	Schott Dual Gooseneck 23 inch
Forceps	Fine Science Tool	FS-1670	For transferring larvae
Glue	Aleene's	N/A	Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue
Graspable holder	Loew Cornell	N/A	Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100ML
Hypodermic needle 30G 1/2"L	Fisher Scientific	NC1471286	BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires
Large Petridish	Falcon	351007	60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Microscope (Zeiss) Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do
Microscope Cover Glass 22x22	Fisher	12-545-B
Microscope Cover Glass 22x40	Corning	2980-224	Tickness 1 1/2
Microscope Slides	Globe Scientific Inc.	1358Y
Mini Diagonal Cutter	Fisher Scientific	S43981	For cutting nitinol filaments
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008”	Mailin Co	N/A	Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/
Piece of black vinyl	Office Depot	N/A	We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva
Small Petridish	Falcon	351008	35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Spatula	Fisher Scientific	21-401-10	Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish
Wipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.
W1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605	Control strain for behavioral assays
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP	Bloomington Drosophila Stock Center	8749	Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons