לימוד טיפול משופר Cavitation

Michael Gray; Alexandra V. Vasilyeva; Veerle Brans; Eleanor Stride

doi:10.3791/61989

Summary

ניתן להשתמש בפרוטוקול הניסיוני המוצג לביצוע מדידות בזמן אמת של פעילות cavitation במכשיר תרבות תאים במטרה לאפשר חקירה של התנאים הנדרשים לאספקת תרופות מוצלחת ו/או ביו-אפקטים אחרים.

Abstract

עניין ביישומים הטיפוליים של אולטרסאונד הוא משמעותי וגדל, עם מטרות קליניות פוטנציאליות החל מסרטן למחלת אלצהיימר. Cavitation - היווצרות ותנועה עוקבת של בועות בתוך שדה אולטרסאונד - מייצג תופעה מרכזית ביסוד רבים של טיפולים אלה. עם זאת, נותרה אי ודאות ניכרת לגבי מנגנוני הפעולה המפורטים שבאמצעותם cavitation מקדם השפעות טיפוליות ויש צורך לפתח טכניקות ניטור אמינות שניתן ליישם קלינית. בפרט, קיימת שונות משמעותית בין מחקרים בפרמטרי החשיפה המדווחים כמספקים בהצלחה השפעות טיפוליות לבין הפליטות האקוסטיות המתאימות. מטרת מאמר זה היא לספק הנחיות עיצוב ופרוטוקול ניסיוני תוך שימוש ברכיבים זמינים נרחבים לביצוע מחקרים של ביואפקטים בתיווך cavitation, ולכלול ניטור אקוסטי בזמן אמת. יש לקוות כי הפרוטוקול יאפשר שילוב נרחב יותר של ניטור אקוסטי לתוך ניסויי אולטרסאונד טיפוליים ולאפשר השוואה קלה יותר על פני מחקרים של תנאי חשיפה המתאם שלהם אפקטים ביולוגיים רלוונטיים.

Introduction

אולטרסאונד (ארה"ב) שימש נרחב כטכניקת הדמיה אבחנתית בגלל אופיו הבטוח והלא פולשני, קלות היישום שלו ליד מיטת המטופל, ואת עלות האפקטיביות שלה¹. לצד יכולות האבחון והניטור שלה, לארה"ב יש פוטנציאל ניכר ליישומים טיפוליים. עבודה מוקדמת חקרה את השימוש בו בטרומבוליזה, TRANSFECTION DNA, ומשלוח תרופות²^,³^,⁴ ו טיפול בארה"ב מייצג כעת תחום פעיל מאוד של מחקר, עם יישומים כולל טיפול בגידול 5^,⁶^,⁷, אימונותרפיה⁸^,⁹, מחסום הדם - מוח (BBB) הפרעה¹⁰^,¹¹^,¹², תרומבוליזה¹³^,¹⁴^,¹⁵, וטיפול בזיהום חיידקי¹⁶^,¹⁷. תופעה מרכזית העומדת ביסוד יישומים אלה היא cavitation: התגרען, הצמיחה, ותנודה של חללים גזיים עקב שינויים בלחץ נוזלים¹⁸^,¹⁹.

יש מגוון של מנגנונים שבאמצעותם cavitation מייצרת השפעות ביולוגיות. לדוגמה, האופי הלא ליניארי ביותר של תנודות בועה בהשפעת שדה אמריקאי מיושם יכול ליצור microstreaming בנוזל שמסביב שיכול גם לשפר את הסעת סמים²⁰ ולהפעיל לחצים גזירה על הרקמה בקרבת הבועות. זה נפוץ במיוחד כאשר בועות נמצאות בקרבת גבול, גורם בועות להתנדנד לא כדורית, ועלול לקדם את ספיגת הסמים באמצעות חדירות הנגרמת על ידי גזירה²¹^,²²^,²³^,²⁴. בלחצים גבוהים יותר, נצפו תנודות משרעת גדולות יותר וקריסת בועה מהירה, המקנה מתח מכני ישיר²⁵ ולעתים קרובות יוצר גלי הלם, וכתוצאה מכך הדרגתיות לחץ גדול שיכול לשבש ולחלחל^{רקמות 26}^,²⁷. קריסת בועות ליד משטח יכולה גם לגרום להיווצרות microjets נוזלי במהירות גבוהה²⁸^,²⁹^,³⁰. microjets אלה יכולים לחדור רקמה, פוטנציאל יצירת נקבוביות או גרימת גלי מתח משניים³¹^,³². חדירות של ממברנות ביולוגיות הן ברמת הרקמה והן ברמות התאים מכונה באופן שונה sonophoresis, המשמש בעיקר בהקשר של שיפור הנגרמת על ידי ארה"ב חדירות העור³³^,³⁴, ו sonoporation, משמש בעיקר כדי לתאר את חדירות הפיך של קרום הסלולר עקב היווצרות של נקבוביות קרום³⁵^,³⁶.

ספיגה צמיגה בנוזל המקיף את הבועה המתנדנדת יכולה לייצר אפקט חימום משמעותי³⁷. יתר על כן, התנודות הלא ליניאריות ביותר מייצרות קרינה אקוסטית בתדרים גבוהים יותר מהשדה האמריקאי המניע. זה מוביל לספיגה מוגברת ברקמה שמסביב וחימום נוסף³⁸. קריסת בועה עשויה להיות מלווה גם בהשפעות כימיות בשל הטמפרטורות הגבוהות החולפות ולחצים בליבת הבועה, כגון דור של מינים תגובתיים מאוד וקרינה אלקטרומגנטית, המכונה sonoluminescence³². תופעות אלה נחקרו כדי להעריך נזק פוטנציאלי ו / או הפעלה של מסלולים סלולריים רלוונטיים למסירה³⁹ וניצלו בהפעלה מקומית של תרופות רגישות לאור בגישה המכונה טיפול sonodynamic⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³.

ניתן ליזום ביו-אפקטים רבים בתיווך ארה"ב אך ורק באמצעות בקרה על פרמטרי השדה בארה"ב (משרעת לחץ, תדירות, אורך הדופק ותדירות החזרה ומשך החשיפה), אך יצירת cavitation אמין ברקמה ביולוגית דורשת לעתים קרובות אנרגיות קלט גבוהות ולכן נושאת סיכון גבוה לנזק. מבוא של גרעיני cavitation אקסוגני או מלאכותי עשוי להפחית באופן משמעותי את אנרגיית הקלט הנדרשת כדי לייצר את מגוון רחב של אפקטים שנדונו לעיל ומציג עוד יותר השפעות נוספות שלא ניתן יהיה עם ארה"ב לבד. גרעיני Cavitation כוללים בועות גז²⁶^,⁴⁴, טיפות נוזליות⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷ וחלקיקים מוצקים⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰, עם גרעיני cavitation ננומטרי להיות אזור מתפתח של חקירה על היתרונות שלהם במונחים של זמן מחזור ממושך, פזרנות משופרת ופעילות cavitation ממושך⁴⁹^,⁵¹^,⁵²^,⁵³.

הגרעינים הנפוצים ביותר הם microbubbles גז (MBs), במקור שימש סוכני ניגודיות בהדמיה אבחון. הם בדרך כלל 1-2 מיקרומטר קוטר ומכילים ליבה של גז במשקל מולקולרי גבוה עם מסיסות מימית נמוכה במדיום שמסביב. הליבה מוקפת שומנים מגן, חלבון, או קליפת פולימר בדרך כלל מורכב פוספוליפידים⁵⁴. כאשר נחשפים לשדה בארה"ב, הדחיסה של MBs גורמת להם לעבור תנודות נפחיות, וכתוצאה מכך לייצר פיזור אקוסטי חזק, אשר אחראי על ההצלחה של MBs כסוכן ניגוד. כאמור, תנודות אלה מובילות גם להשפעות המכניות, התרמיות והכימיות הנ"ל שניתן לרתום ביישומים טיפוליים. תהליך הציפוי של MB מציע גם מנגנון לאנקפסולציות של תרופות בתוך מבנה ה-MB ולהצמדת תרופות ו/או מיקוד מינים לפני השטח של MB. טכניקה זו מקלה על שחרור מופעלות של תרופות כדי להפחית רעילות מערכתית⁵⁵. כמו כן הוכח לאחרונה כי חומר מפני השטח MB עשוי להיות מועבר למבנים ביולוגיים, שיפור אספקת סמים באמצעות מה שנקרא "sonoprinting"⁵⁶^,⁵⁷^,⁵⁸.

ניטור של פעילות cavitation בתיווך ארה"ב יכול לספק תובנות לתוך ההשפעות הביולוגיות וכתוצאה מכך הן במבחנה ו in vivo ופוטנציאל מאפשר כוונון ואופטימיזציה של אפקטים אלה. שתי השיטות היישומיות ביותר לניטור פעילות cavitation הן i) אופטיות, המשתמשות במיקרוסקופיה וידאו במהירות גבוהה במיוחד ובדרך כלל אינן אפשריות ב- vivo; ו- ii) אקוסטיות, המתעדות את שדות הקול המוקרנים מחדש המיוצרים על ידי בועות מתנדנדות ו /או קורסות. שני מרכיבי משרעת ותדירות של האות האקוסטי מכילים מידע על התנהגות בועה. ריכוזים נמוכים של בועות באירוע נמוך משרעת בארה"ב הוכחו לייצר פליטות הרמוניות בעיקר (כפולות מספר שלם של תדירות הנהיגה)⁵⁹. ככל שלחצי הנהיגה גוברים, ספקטרום פליטת הבועות עשוי להכיל גם רכיבים חלקיים הידועים בשם תת-הרמוניה ואולטרה-הרמוניים⁶⁰ המצביעים על התנהגות לא ליניארית חזקה יותר, כמו גם רעשי פס רחב, המעידים על cavitation אינרציאלי. הרמוניות מספר שלם הן אינדיקטור עיקרי לתנודות בועות, אך יכולות להיגרם גם על ידי אי-ליניאריות בכל מקום במערכת ניסיונית, למשל, עקב התפשטות לא ליניארית. לעומת זאת, הרמוניות חלקיות ורעש פס רחב מתואמים מאוד עם דינמיקה של בועה.

הקשר בין התנהגות הבועה לבין הפליטות האקוסטיות שזוהו עשוי להיות מסובך על ידי גורמים כולל השדה בארה"ב האירוע, סביבת הגרעין, ואת המאפיינים של מסלול הגילוי⁶⁰. עם זאת, מידע חשוב על התנהגות בועה והאינטראקציות שלהם עם תאים ניתן להשיג על ידי הבחנה מגמות בתדירות ואנרגיה בספקטרום האקוסטי. נתונים אלה יכולים גם לספק מידע בעל ערך שניתן להשתמש בו כדי ליצור את הבסיס לטכניקות ניטור טיפול קליני. כדי לנצל מידע זה באופן מלא, נדרשת התפתחות של שיטות ניסיוניות חזקות, ניתנות לתרגום וניתן לשחזור.

כיום יש שונות משמעותית בפרוטוקולים המדווחים לתכנון מערכות וביצוע מחקרים לתמיכה בפיתוח טיפולים בסיוע cavitation. מבחינת המנגנון, בוצעו מגוון גישות עיצוביות. מספר קבוצות עשו שימוש בתאי צלחת מקבילה⁵⁶^,⁶¹^,⁶²^,⁶³, או נבנה בהתאמה אישית או זמין מסחרית (למשל, OptiCell, ThermoFisher מדעי). Hu et al. (2013) פיתח תא תא בשילוב עם מודול sonication בארה"ב הדמיה קונפוקלית בזמן אמת⁶⁴, Carugo ואח '. (2015) השתמש במערכת הכוללת צלחת תרבית תאים מסחרית עם מכסה PDMS בהתאמה אישית כדי לאפשר שקיעה באמבט מים במהלך חשיפה אמריקאית⁶⁵, ו Pereno et al. (2018) השתמשו במכשיר המורכב מתהודה אקוסטופולואידית בשכבות המאפשרות אפיון אופטי ואקוסטי בו זמנית של דינמיקת בועות ואינטראקציות בין תאי^{בועות 66}. השימוש בעיצובים מפוברקים בהתאמה אישית ובאופן ספציפי ליישום מסבך את האפיון של השדה האמריקאי ותנאי חשיפה סביבתיים אחרים, מה שהופך את השוואות המחקר הצולבות למאתגרות. לדוגמה, קיימת שונות ניכרת בפרמטרים האמריקאים שזוהו להשגת sonoporation מוצלח, הכוללים תדרי מרכז הנעים בין 0.02 ל 15 מגה-הרץ, מחזורי עבודה הנעים בין 1% לגל מתמשך, ולחצים נדירים הנעים בין 0.1 ל-20 MPa²³^,⁶⁴^,⁶⁷^,⁶⁸^,⁶⁹^,⁷⁰ ( טבלה1). קיימת שונות ניכרת דומה ברכיבים הספקטרליים (הרמוניות, תת-הרמוניות וכו ') שזוהו כקשורים לביו-אפקטים מסוימים.

מטרת עבודה זו, אם כן, היא לספק מסגרת תכנון ויישום מערכת הניתנת לשחזור בקלות למחקר במבחנה של ביו-אפקטים תאיים הנגרמים על ידי cavitation עם הכללה ספציפית של יכולת ניטור cavitation.

Protocol

1. עקרונות עיצוב המערכת

הערה: סעיף זה מציג את עקרונות העיצוב המשמשים ליצירת מערכות לניטור חשיפה ו cavitation בארה"ב. עקרונות אלה מודגמים עם שתי מערכות קיימות לטרנס-פליטה אקוסטית (SAT) (המוצגות באיור 1). כל מערכת מורכבת מתא חשיפה לתאים, מקור אמריקאי, ומתמר אלמנט יחיד המתפקד כגלאי cavitation פסיבי (PCD), כולם משולבים בתא בדיקה ספסל. עיצובים אלה מתבססים על פיתוח המערכת הקודמת המתוארת בקרוגו ואח '(2015)⁶⁵.

למקסם את קלות השימוש.
1. הפוך את תא החשיפה לתאים לתואם לטכניקות תרבות ומערכות הדמיה קיימות באמצעות התקני תרבות תאים מסחריים קיימים כמצעי זריעה/צמיחה.
  1. עבור SAT2, השתמש בצלחת תרבות (קוטר 35 מ"מ, מתוכם שטח בקוטר 21 מ"מ ניתן לצפייה, ראה טבלת חומרים).
  2. עבור SAT3, השתמש בהכנסת טרנסוול (בקוטר 6.5 מ"מ, ראה טבלת חומרים). Transwells יש קרום חדיר ולכן צריך להיות ממוקם במדיה הסלולרית ולא במים.
אפשר טעינה ואיטום מהירים של תא החשיפה לתא.
1. יוצרים את תא החשיפה לתאי SAT2 על ידי לחיצה על מכסה פולימר גמיש מעל מנת התרבות (Carugo et al. 2015^65). כפי שניתן לראות באיור 1C, למכסה יש זוג חורים בקוטר 1.2 מ"מ המאפשרים למלא את התא במזרק מחט קהה של 18 גרם. לאחר המילוי, יש לאטום יציאות מילוי אלה במוטות פלסטיק קצרים(שולחן החומרים).
2. מלא את תא SAT3 על ידי מזרק או פיפטה וחותם על ידי לחיצה התאמת פקק גומי / באנג.
3. אפשר טעינה מהירה של תא החשיפה לתא האטום לתא הבדיקה. מחזיקי תאי החשיפה לתאים נבנו בתוך מכסי התא, שם מספיקה התאמה קלה ללחיצה כדי להבטיח יישור תקין. עם המערכות המוצגות באיור 1, הזמן לשינויים במדגם יכול להיות קצר ככל 20 שניות כאשר תאי חשיפה לתאים מרובים הוכנו מראש.
4. מזער את נפח התא הפנימי כך שהמערכת תהיה ניידת וניתן יהיה למזער את כמות המים/מדיה הנדרשת. פעולה זו גם מאיצה את ההתאוששות מדליפות מקריות או דליפות של סוכני cavitation מתוך תא החשיפה לתא.
  הערה: נפח SAT2 הפנימי הוא כ 0.8 L. נפח SAT3 הפנימי הוא כ 7.6 L – עשה גדול יותר כדי להתאים טעינה קלה ושינוי של מתמר המקור או התצורה שלה. תא פנימי של 0.3 L נוסף כדי למזער את הנפח החד פעמי ולאפשר שימוש בנוזלים רלוונטיים ביולוגית שאינם המיכל למלא מים (למשל, מדיית תרבות התא). תחתית התא הפנימי עשויה מגיליון מיילר בעובי 30 מיקרומטר כדי לאפשר שידור אקוסטי מרבי.
5. הפוך את התא ואת הרכיבים הפנימיים מחומרים ברורים אופטית כאשר הדבר אפשרי, כך שכל הבעיות (למשל, דליפות, מקמבובלים לכודים) ניתן לראות במהירות לתקן.
למקסם את ההמרה האקוסטית של תא החשיפה.
1. למקסם את ההמרה באמצעות האפשרויות של חומרי קיר תא ועוביים. תחת ההנחה כי הנוזלים משני צדי הקיר הם למעשה זהים (למשל, מים), סדר הגודל של מקדם העברת לחץ השכיחות הרגיל⁷¹ הוא:
  כאשר אורך הגל בקיר העובי L, ו- z_L ו- z_o הם העכבות האופייניות (תוצרים של צפיפות ומהירות קול) לחומר הקיר ולנוזל, בהתאמה. T = 1 מציין שידור מושלם.
2. לניטור ספקטרום רחב של cavitation (למשל, 1-8 MHz), רוב פולימרים במעבדה (למשל, PDMS, PTFE, פוליסטירן) ישנה את הלחץ המועבר על ידי לא יותר מ 10% אם עובי החומר הוא פחות מ 1/10 th של^אורך גל בחומר. מצב זה יכול להיות קשה לעמוד עם חומרים מתכלים סטנדרטיים בתדרים גבוהים (למשל, #1.5 כריכה ב 8 MHz), ולכן זה תרגול טוב לחזות או לכייל ישירות את תגובת תדר השידור.
3. להעברת פס צר של אות המקור האמריקאי לתא החשיפה לתא, אפשר שכבה עבה יותר אם מדובר בכפולה של מספר שלם של חצי אורך גל בחומר השכבה. לדוגמה, מכסה PDMS ב- SAT2 משמש בעובי של 2.0 מ"מ (~ 2 אורך גל ב- 1MHz, c_PDMS ~ 1000 m/s).
הגדל את אזור החשיפה באמצעות בחירת סביבת המקור והתא.
1. כדי למקסם את מספר התאים החשופים, הפוך את תחום ההתקשרות לתאים לרחב ככל האפשר תוך שמירה על תאימות לציוד culturing והדמיה זמין.
2. השתמש במקור אמריקאי עם שדה המשתרע על פני אזור ההתקשרות לתא עם שונות מרחבית מינימלית באמצעות אזור טרום המוקד של מקור ממוקד גדול (SAT2) או מקור ממוקד או עדשה עם רוחב האונה הראשי התואם את קוטר אזור המצורף לתא (SAT3). עיין בטבלת החומרים לקבלת מקורות ספציפיים.
3. צמצם את מורכבות השדה שהוצגה על ידי מחזיק תא התא על-ידי תמיכה מכנית בתא התא הרחק מהחלק החזק ביותר של שדה האירוע, מזעור חתך הפיזור של המחזיק או הנחת חומר סופג על המחזיק. דוגמאות מוצגות באיור 1A וב-1D.
ודא תנאי חשיפה חוזרים.
1. סיים את השדה האקוסטי בגבול קבוע כדי למנוע שונות שיכולה לנבוע ממשקי מי אוויר בתאים מלאים חלקית. ב SAT2 ו 3, זה מושגת על ידי התקנת סופג אקוסטי (ראה טבלה של חומרים)על מכסה התא עם יתרון נוסף של הפחתת מורכבות השדה שעלול לנבוע השתקפויות גבול.
2. נטר והקלט את מתח כונן המקור בקלט יציאת/מקור המגבר כך שניתן יהיה לזהות במהירות שונות מינורית או תקלה משמעותית. השתמש בבדיקת מתח או בהתקן אחר שבטוח לשימוש בטווח מתח הכונן של עניין. בדוק מעת לעת את הכיול של גשוש המתח באמצעות מקור ידוע כגון מחולל צורת גל.
3. בקרה, ניטור ותיעוד של טמפרטורת התא ותכולתו. תגובות של תאים, מתמרים, מדיום התפשטות עשוי להיות כל רגיש לטמפרטורה. ב- SAT2, ניטור ובקרה מתבצעים עם זוג יציאות מחזור המחוברות למערכת מיזוג מים, בעוד SAT3 מעסיקה תנור אקווריום (לא מוצג). הגדר את טמפרטורת המים לפי הצורך כדי לחקות את התנאים הפיזיולוגיים הרלוונטיים עבור היישום הטיפולי.
  הערה: טמפרטורות פנימיות עשויות להשתנות הן כתוצאה מגורמים חיצוניים והן מחימום שנוצר על ידי ארה"ב של המתמר והבינוני.
4. בזהירות degas את נוזלי התא (ים) כדי למזער את הסבירות של cavitation לא מכוון ו / או פיזור מבועות קיימות בנתיב ההפצה.
  הערה: אם degassing לא מתבצע, למשל בשל ההשפעה השלילית על התאים, אז תהיה רמת רקע משופרת של פעילות בועה, אשר מתאים.
כייל את המערכת שהורכבה במלואה.
1. כלול אמצעי למדידת אירוע שדה הלחץ על התאים החשופים כאשר כל רכיבי המערכת נמצאים במקום, כולל תא החשיפה לתא. ב SAT2 ו 3, זה מושגת עם פתח במכסה התא שדרכו מחט או סיבים אופטיים הידרופון יכול להיות מוכנס מבלי להפריע לשדה להימדד. קרב את המידות ככל האפשר למיקום התאים.
2. בחר הידרופון עם רדיוס רגיש_(rcv)הוא קטן מספיק, כי זה לא י מדווח לא נכון את שדה הלחץ הנמדד. הגודל המקובל הוא פונקציה של תדר מקור (f) ורדיוס (_src) כמו גם המרחק בין המקור לסריקת השדה (z_rcv). קריטריון כללי לבחירת גודל הידרופון הוא: , המוביל ל: , כאשר c הוא מהירות הקול⁷².
3. ודא שההידרופון מכויל בתנאים המשמשים באפיון המערכת, כולל הטמפרטורה כפי שצוין בסעיף 1.6. באופן ספציפי, אם ההידרופון מוחזק בזווית ביחס למישור הסריקה, ההידרופון חייב להיות מכויל בזווית זו, שכן השפעות הישירות עשויות להיות שונות באופן משמעותי מאלה הצפויות בהתבסס אך ורק על גיאומטריה. השינוי ברגישות הידרופון ביחס לטמפרטורה צריך להיות זמין מהיצרן.
4. סרוק את האזור כולו שבו תאים עשויים להיחשף. כדי ללכוד רמה מתאימה של פרטי שדה, השתמש בריווח סריקה לא גס יותר מ-^1/5th של אורך גל בתדירות הגבוהה ביותר של עניין. אם נצפתה מורכבות שדה בלתי צפויה, שקול להשתמש באותות פרץ קצרים (למשל, 1-3 מחזורים) כדי לאפשר זיהוי וכימות של תרומות שדה ישירות ומפוזרות.
לשלב יכולת ניטור cavitation.
1. קבע את סוג מתמר הניטור ואת המיקום כחלק מהתכנון של המערכת הכוללת, ולא כשיפוץ. בפועל, זה מוביל למערכת קומפקטית מקסימלית מבלי להקריב את היכולת ליישר באופן אמין את רכיבי המערכת הקריטיים.
2. הנח התקן ניטור cavitation במערכת באופן כזה שניתן יהיה למקם אותו באופן חוזר עם זמן התקנה מינימלי נוסף או הפרעה לזרימת עבודה. ב SAT2, זה מושגת עם מתמר פיזואלקטרי אלמנט יחיד מתנהג כמו PCD מצויד במכסה התא, בעוד SAT3 משלב את PCD לתוך בסיס המקור באמצעות רפלקטור 90 °.
3. בחר את צורת PCD בהתאם למטרות הניסויים. באיור 2, חישובים של קווי המתאר של חצי משרעת של התקנים לא ממוקדים (משמאל) וממוקדים (מימין) מראים את ההבדלים העמוקים ברגישות המרחבית ביחס לתדירות. המכשיר הלא ממוקד מתאים יותר לניטור נפח גדול עם וריאציה מרחבית צנועה ביחס לתדר, בעוד המכשיר הממוקד מתאים יותר למדידות קומפקטיות רדיאליות יותר בתדרים מעניינים.
4. בחר את התדירות ורוחב הפס של מרכז ה- PCD כך שיתאימו לצרכי הניסוי. התדירות המרכזית נבחרת בדרך כלל להיות לפחות פי חמישה מהמקור האמריקאי כדי למזער את הרגישות לפליטות מקור ישירות. רוחב הפס מוגדל בדרך כלל על מנת להתבונן במגוון רחב של התנהגויות בועות (רעש הרמוני ופס רחב).
5. בחר שיטות מיזוג, הקלטה ועיבוד כדי לאפשר ניתוח של נתוני cavitation, כמתואר בסעיף הבא.

2. מכשור ועיבוד לניטור Cavitation

הערה: סעיף זה מציג את הרכיבים והפונקציות של זרימת האות המומלצים לאיסוף נתוני ניטור cavitation, ואת עיבוד הנתונים שמוביל להערכות איכותיות וכמותיות של פעילות cavitation.

מכשור (ראו גם איור 3).
1. אלא אם כן היישום דורש התקן מותאם אישית, בחר PCD מתוך המגוון הרחב של מתמרים מסחריים של רכיבים בודדים, המשווקים בדרך כלל לבדיקה לא הרסנית של יעדים שקועים. ספקים אלה יש גם כבלים ואביזרים (למשל, רפלקטור המראה ב SAT3).
2. צמצם את תגובת PCD למקור האמריקאי. ניתן לעשות זאת הן באמצעות בחירת ה- PCD (תדירות מרכז ורוחב פס) והן באמצעות מסנן מעבר חריץ או גבוה. האחרון ניתן ליישום כמודול עצמאי או כחלק מהתקן מיזוג אותות.
3. השתמש בדיגיטייזר עם טווח דינמי גדול (לפחות 12 סיביות) כדי ללכוד נתונים רבים ככל האפשר עם סבירות מינימלית לחיתוך אותות גבוה ויחס אות מרבי לרעש (SNR) של האותות הקטנים ביותר. בעת השוואת התקנים, סקור את המפרטים עבור אות לרעש ועיוות ו/או מספר סיביות אפקטיבי, מכיוון שאלה תיאורים שלמים יותר של טווח דינמי בר השגה. שקול גם אם גודל מאגר הזיכרון מספיק עבור האורך והקצב הרצויים של לכידת נתונים.
4. מטב את השימוש בטווח הדינמי של הדיגיטציה. אותות PCD עשויים לכסות מספר סדרי גודל, הן בגלל חשיפה ארוכה (כמו בועות בוטלו) ואם פועל ניסויים ברמות שונות של הכונן בארה"ב. לכן יש צורך לבדוק כי שרשרת מיזוג האות סולם את כל האותות, כך שהם יכולים להיות מוקלטים כראוי.
5. כלול דגימה מראש בשרשרת האותות, כך שניתן יהיה ללכוד כראוי את האותות הקטנים ביותר הצפויים. מניסיוננו, רעש עצמי PCD הוא הרבה מתחת לזה של רוב הדיגיטייזרים, כך מידה צנועה של preamplification (למשל, <100x) עדיין יכול לשפר את SNR של התוצאה הסופית.
6. סנן את תדר המקור בארה"ב לפני ההקדמה כדי למנוע רוויה של המגבר.
7. אם נעשה שימוש בפעימה/מקלט אמריקאי כדי לספק יכולות רווח ו/או סינון, השתמש בו במצב Pulser כדי לאשר אורך/יישור נתיב או בדוק אם קיימים פיזורים בלתי צפויים בנתיב ההפצה בין ה- PCD לתא החשיפה לתא.
8. אפשר הזרמת נתונים בזמן אמת לאחסון. מערכות SAT2 ו- SAT3 משתמשות שתיהן באוסילוסקופי USB של הזרמת 12 סיביות (ראה טבלת חומרים), שיש להן את הנוחיות של ניידות וממשקי משתמש בנויים היטב.
9. אשר התאמת עכבה מתאימה בשרשרת האותות כדי למנוע שגיאות רווח או רוחב פס. התקני PCD בדרך כלל יש עכבות פלט ליד 50 אוהם, כך תהליך מתאים הוא להחליף את PCD עם אות ידוע מחולל waveform (עם עכבה פלט 50 אוהם) ולאשר כי גודל האות המופיע על הדיגיטציה תואם את הציפיות, קשקשים ליניארי כאשר האות מוזרק משתנה, ולא גזירה נצפתה עבור האות הגדול ביותר של עניין.
עיבוד מקדים
1. תקן את אותות המתח הגולמי עבור כל הרווחים והרגישות הידועים בנתיב האות הקשורים לעיבוד נתונים בטווח התדרים של עניין.
2. אם הנתונים נרשמו באמצעות צימוד קלט DC או מציגים בדרך אחרת היסט DC, הסר היסט זה על-ידי חיסור ישיר או באמצעות מסנן מעבר גבוה.
חשב את ספקטרום הכוח P של כל אות מוקלט.
1. הגדר את אורך ההמרה פורייה N_{ft כך} שהתדירות הבסיסית של המקור האמריקאי f₀ היא כפולה של מספר שלם גדול של רוחב סל ההמרה: N_ft= nf_s/f₀, כאשר n הוא מספר שלם ו- f_s הוא תדירות הדגימה של הנתונים הדיגיטליים. הגדר n ≥ 50 ללכידה ברורה של תכונות ספקטרליות. לדוגמה של יסוד של 1 מגה-הרץ שנדגם במהירות של 50 מגה-הרץ, N_ft הוא 2500 ורוחב הסל הוא 0.02 מגה-הרץ.
2. כמו אורך המרה N_ft הוא בדרך כלל קטן יותר מאשר משך האות המוקלט, להשתמש בצפיפות ספקטרלית כוח (PSD) אומדן כגון השיטה של וולש⁷³. צריכת חשמל ברצועת תדרים המשתרעת על-פני f_1-f₂ היא , כאשר dF הוא רוחב סל ההמרה.
3. כדי לאפיין פעילות בועה במהלך כל חשיפה, להעריך את התרומות לספקטרום החשמל מכפולות מספר שלם של f₀ (הרמוניות), כפולות מספר שלם מוזר של f₀/2 (ultraharmonics), ורעש פס רחב (cavitation אינרציאלי).
4. תוכן הרמוני ואולטרה-הרמוני מוערך בפשטות על-ידי בחירת ערכי ספקטרום הכוח בתדרים ספציפיים. עם זאת, תגובות טונאליות משרעת גדולות עלולות להתפשט למספר קטן של פחי תדר סמוכים (למשל f0 ± 2-3), ולכן יש לכלול אותן בחישובי צריכת החשמל של הרצועה הצרה ולא לכלול אותן בחישובי הפס הרחב.
5. הערך את עוצמת הפס הרחב על-ידי חיסור התרומות ההרמוניות והאולטרהרמוניות מתוך ספקטרום הספק הכולל. לחלופין, ניתן להעריך תרומות אלה באמצעות עיבוד מראש מתוחכם יותר⁷⁴.
6. להעריך את אנרגיית אות cavitation המצטברת לאורך זמן החשיפה, רצוי על פי תכונה ספקטרום / סוג פעילות בועה.
7. בהנחה שלכל רשומות הנתונים היה משך T_rשווה , האנרגיה המצטברת בנתונים המוקלטים היא , כאשר M מציין את מספר הרשומות.
8. אם קיימים פערים בין הקלטות, כפי שעלול לקרות כאשר החשיפה רציפה, והקבצים השמורים לוכדים שבריר ממשך החשיפה הכולל T_e, ניתן להעריך את האנרגיה המצטברת כ
9. להעריך את המדידה SNR על ידי השוואה של רמות הספקטרום עם אלה של רעשי רקע שנרשמו בהיעדר ארה"ב.

3. פרוטוקול ניסיוני

הכנת SAT
1. למזער את הסבירות של cavitation בנתיב התפשטות על ידי degassing נוזל המילוי (מים מסוננים בדרך כלל) תחת לחץ של -10⁵ Pa לפחות שעתיים. אישור עם בדיקה חמצן מומס כי הלחץ החלקי של חמצן הוא מתחת 10 kPa מומלץ.
2. ממלאים את תא הבדיקה לאט כדי למזער את כניסתו מחדש של האוויר לתוך הנוזל degassed. המשך לרוקן את התא המלא במידת הצורך.
3. נקה את כל שאריות הבועות ממשטחי המתמר ומיכל המדיה מיד לאחר המילוי ושוב רגע לפני תחילת ניסויי החשיפה.
4. ודאו שטמפרטורת התא ותכולתו התייצבו לפני תחילת ניסויי החשיפה.
5. אפשר למגבר כוח המקור בארה"ב להתחמם (לפי המלצת היצרן) כך שהרווח והתפוקה יציבים ביחס לזמן.
הכנת תא חשיפה
1. השעיית סוכן Cavitation
  1. כאשר מדללים את סוכן cavitation, בעדינות וברצף מערבבים לעשות השעיה אחידה מבלי להחדיר macrobubbles או להרוס את הסוכן (במיוחד אם הם בועות פגז).
  2. בעת עבודה עם MBs, לסגת ולוותר לאט באמצעות מחט מד הגדול ביותר זמין כדי למזער את ההרס במהלך תהליך הטעינה⁷⁵. 18 G מחט מילוי קהה שימש באופן קבוע עם מערכות SAT.
הכנת SAT2
1. לעקר את מכסה PDMS לפני השימוש בניסויים עם תאים חיים.
2. יוצרים את תא החשיפה לתאים על ידי לחיצה שמתאימה את מכסה ה-PDMS לצלחת התרבות.
3. הכן מזרק עם מחט קהה 18 G ולמלא עם כ 10 מ"ל של נוזל (למשל, השעיה MB או בקרת מים).
4. הכנס את המחט דרך אחד מחורים מילוי PDMS ולאט לאט למלא את התא, הטיה כך macrobubbles יכול לברוח דרך חור המילוי הפתוח. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הטה את התא כך שהחור הפתוח יהיה מעל חור המילוי.
5. בעת מילוי, סגור את החור הפתוח על-ידי החדרת מוט פולימר קצר (4-5 מ"מ). הגדר את ההרכבה כך ששני החורים אופקיים.
6. הסר את מחט המילוי הקהה תוך הזרקת נוזל נוסף, כך שהאוויר לא נמשך פנימה. סגור את החור עם מוט פולימר אחר. תהליך זה משלים את האיטום של תא החשיפה לתא.
7. בדוק באופן חזותי אם יש בתא ראיות למאקרו-בובלים לכודים, ואם נמצאו כאלה, חזור על 3.3.3.-3.3.6.
8. לחץ להתאים את תא החשיפה לתא במחזיק התא. התקן את מכסה התא במקום על גבי התא. הנמכת המכסה בזווית לאופקי מרתיעה את מקרובי המאקרו מלנוח על החלקים השקועים (בולם, מחזיק).
9. שקול את הציפה של החלקיקים בהשעיה בעת ההחלטה על הכיוון של תא החשיפה לתא (למשל, בועות צפות או חלקיקים שוקעים) וכיצד זה ישפיע על המגע שלהם עם תאים.
10. בכל הפעולות, להשתמש בכוח מועט ככל האפשר כדי למזער את הגמישות של משטח צמיחת התא וניתוק של תאים.
הכנת SAT3
1. מלא את Transwell עם כ 150 μL של נוזל (למשל, השעיה MB או בקרת מים).
2. יוצרים את תא החשיפה לתא על ידי איטום זהיר של הטרנסוול בתקע גומי, מסירים כל נוזל גדוש במגבת נייר נקייה או מנגבים. לפני השימוש בניסויים עם תאים חיים, לעקר את תקע הגומי.
3. בדוק באופן חזותי את התא לקבלת ראיות של macrobubbles לכודים, ואם כל נמצאו, להסיר את התקע, להסיר את macrobubbles ולחזור על 4.4.2.
4. לחץ להתאים את תא החשיפה לתא במחזיק התא. התקן את מכסה התא במקום על גבי התא. הנמכת המכסה בזווית לאופקי מרתיעה את מקרובי המאקרו מלנוח על החלקים השקועים (בולם, מחזיק).
  הערה: כפי שצוין לעיל, macrobubbles עלול לגרום למגוון של השפעות שאינן ניתנות לחזרה ועלולות להזיק על ניסויי חשיפה בארה"ב. באופן קריטי ביותר, macrobubbles לכודים בתא החשיפה לתא עלול לגרום תגובות PCD וביואפקטים הסלולר המקומי שאינם מייצגים את הטיפול המיועד. בדוק תמיד באופן חזותי את כל רכיבי המערכת כדי לחפש ולהסיר מקרופובלים לפני ייזום ניסויים בארה"ב.

4. איסוף נתונים

קבע רמות תגובה של PCD ברקע על-ידי ביצוע ניסויים ראשוניים עם תא חשיפה לתאים מלא בנוזל בקרה (למשל, מים דלים או מדיית תאים).
הקלט נתוני PCD מבלי להסיע את המקור האמריקאי כדי לקבוע רמות רעש אלקטרוניות ברקע.
הקלט נתוני PCD בעת נהיגה במקור האמריקאי בטווח המלא של רמות הכונן המתוכננות. נתונים אלה יציינו אילו חלקים של התגובה האקוסטית אינם קשורים לסוכני cavitation להיבדק לאחר מכן.
הערה: נוזלי מעבדה נפוצים (למשל, PBS או מדיית תאים) יציגו cavitation בלחצים מתונים (למשל 0.5 MPa ב 0.5 MHz) אם לא degassed.
לפני תחילת המדידות, לתת זמן ההשעיה כדי להשוות תרמית עם טמפרטורת התא. תרמוקופול מחט בסדר עשוי להיות שימושי למטרה זו.
נטר את הניסויים בזמן אמת הן בתחום הזמן והן בתחום התדירות.
1. ניטור תחום הזמן של ה- PCD מגלה אם האותות בגודל מתאים להגדרות המכשור הנוכחיות. באופן ספציפי, יש להימנע גזירת אותות, שכן הוא יופיע בתחום התדר כתגובה הרמונית מרובת צלילים.
2. ניטור תחום הזמן של PCD מראה גם אם אותות cavitation נראים מוקדם מהצפוי בהתבסס על זמן התפשטות מהמקור האמריקאי לתא החשיפה ל- PCD. אם אותות כאלה נראים, זה עשוי להצביע על דליפה של סוכן cavitation לתא הבדיקה.
3. ניטור תחום תדירות של PCD מציין את סוג התנהגות הבועה וניתן להשתמש בו כדי להתאים את רמות הכונן לפי הצורך כדי להשיג את גירוי התא הרצוי (למשל, רמות כונן נמוכות יותר עבור עירור הרמוני).
כדי להבטיח שהחשיפות הראשונות לא יחסרו, התחל את תהליך איסוף הנתונים לפני הפעלת אות כונן המקור בארה"ב.
נטר את אות יציאת המגבר המניע את המקור האמריקאי (בניגוד לתפוקת מחולל צורת הגל) לאורך כל הניסוי כדי להבטיח שהחשיפה מתקדמת כצפוי. השתמש בבדיקת מתח גבוה למדידה זו וודא כי oscilloscope מוגדר לפצות על הנחתת בדיקה.
לאחר חשיפת דגימה, להסיר אותו בזהירות מתא הבדיקה.
1. הסר ונקה את מכסה PDMS (SAT2)/תקע גומי (SAT3) כהכנה לכל שימוש עוקב.
2. העבר את צלחת התרבות (SAT2)/Transwell (SAT3) לפי הצורך לניתוח עוקב (למשל, מיקרוסקופיה, הדמיית פלואורסצנטיות).
3. לאחר מספר קטן של חשיפות (למשל, 3-5), מומלץ לרכוש מחדש אותות cavitation בסיסיים (בהיעדר סוכן cavitation) ולהשוות עם ערכת הנתונים המקורית כדי לוודא את התקשורת הקאמרית לא זוהם.

תוצאות

איור 4 מציג דוגמאות לתגובות PCD של תחום הזמן והתדירות, הממחישות שלוש התנהגויות שונות של cavitation. כל הנתונים נאספו על SAT3 באמצעות SonoVue MBs מדולל 5x ב PBS, עם ריכוז סופי של ~ 2 * 10⁷ MBs / מיליליטר. הטמפרטורה עבור כל הדוגמאות בסעיף זה היה 19 ± 1 °C (60 °F). המקור האמריקאי היה מונע עם פעימה של 2.0 אלפיות השנייה במהירות של 0.5 מגה-הרץ כדי להגיע לשיא הלחצים השליליים של 0.20 (איור 4A ו-4B),0.30 (איור 4C ו-4D)ו-0.70 MPa (איור 4E ו-4F). הקלטות האות החלו 1.4 ms לפני t = 0 תחילת הדופק בארה"ב. עקבות הכניסה מציגות את האות כפי שנרשם (אדום) ועם מסנן מעבר גבוה של 2 מגה-הרץ (כחול) לחלון זמן שבמרכזו בזמן הטיסה ממקור לתא חשיפה לתא ל- PCD. התגובה ברמה נמוכה לפני זמן זה היא בשל קרינה שהתקבלה ישירות מהמקור, אשר נפוץ תצורות שבו PCD הוא מאחורי המקור האמריקאי.

בלחץ האירוע הנמוך ביותר, תגובת PCD מורכבת כולה מהרמוניות מספר שלם של התדר האמריקאי הבסיסי של 0.5 מגה-הרץ. הגדלת מ 0.20 כדי 0.30 MPa תוצאות ultraharmonics בולטים בספקטרום בנוסף הרמוניות מספר שלם מוגבה עוד יותר. צורות הגל של תחום הזמן בשני הלחצים האלה נראות דומות, אם כי התוצאות של 0.30 MPa מראות שונות רבה יותר לאורך הדופק. בלחץ הגבוה ביותר, משרעת צורת הגל של תחום הזמן גדלה באופן לא ליניארי ביחס ללחצים הנמוכים יותר כתוצאה מרעש פס רחב גבוה בבירור שנראה בספקטרום. רעש זה נחשב בדרך כלל תוצאה של cavitation אינרציאלי בדוגמה זו, מתאים להרס של MBs.

כדי לראות זאת בצורה ברורה יותר, תגובות PCD כפונקציה של זמן מוצגות באיור 5. בלוח השמאלי (איור 5A),ספקטרום מלא מוצג על פני זמן חשיפה של 50 שניות, שבמהלכו המקור פלט פולסים של 2.0 אלפיות השנייה כל 0.20 שניות. סך הכל, כוחות הרמוניים ופס רחב מתאימים מוצגים בלוח הימני (איור 5B). ארה"ב הופעלה ב- t =3.0 s, אז נראו תגובות פס רחב של משרעת גדולה. ספייק הראשונית נחשבת תואמת את ההרס של הבועות הגדולות ביותר בהשעיה (SonoVue הוא polydisperse) והוא תצפית נפוצה בניסויים cavitation עם בועות פגז ואפילו עם מדיה ללא גזים (למשל, PBS).

לאחר מספר שניות, תגובת הפס הרחב פחתה במהירות, ככל הנראה עקב הרס בועה, והאות מורכב בעיקר מהרמוניות. הדבר מצביע על כך שהגז המשוחרר וה-MBs הנותרים רוטטים ביציבות ולא באופן לא-בלתי-התיר. ב- t ~ 50s, רכיב הפס הרחב ירד לרמה של רעש הרקע המקורי. בדיקות חשיפה כאלה חשובות אפוא כאשר מנסים להבין את צירי הזמן שבמהלכם השפעות בועה שונות עשויות לפעול על התאים בתא.

בועות עשויות לתרגם בתגובה לכוחות קרינה שנוצרו במהלך החשיפה בארה"ב ותנועה של MBs בתוך ומחוץ לשדה הראייה PCD יכול להוביל שונות מוגברת באות cavitation פיקוח, במיוחד כאשר מתמודדים עם מתלים מדוללים. האזור הרגיש של PCD ולכן צריך להתפרס על פני כמה שיותר משטח החשיפה לתאים ככל האפשר. השוואה בין התגובות לתדרי PCD ממוקדים ולא ממוקדים עם תדרי מרכז זהים (ראו איור 2)מוצגת באיור 6, תוך שימוש בדילול של 20:1 של MBS ב- PBS רגיל הוא SAT2. הספקטרום של הזמן והדגימה בלוח איור 6A מראים שה-PCD הלא ממוקד מכיל תגובת פס רחב חזקה יותר, המלווה בשונות מופחתת מדגם לדגימה הן בהרמונית (איור 6B)והן בכוחות אולטרה-הרמוניים (איור 6C).

חשוב להכיר בכך שמדיה המשמשת לעבודה בתאי חוץ גופיים אינה מתרוקנת ועשויה להציג רמת רקע משופרת של פעילות בועה. איור 7 מראה את התגובה ב-SAT2 של PBS המשמשת בצורתה המסופקת על-ידי הספק ולאחר שעתיים של פירוק גזים תחת ואקום, שלאחריה הופחתה רוויית האוויר מ-92% ל-46% כפי שנקבע בחיישן אופטי (PreSens, Germany). הספקטרום באיור 7A היה ממוצע לאורך זמן החשיפה וחוזר חלילה עם חמש דגימות עצמאיות, ונראה בבירור כי הם מראים אולטרה-הרמוניקה גבוהה בבירור ב-PBS רגיל. סמכויות המסוכמים על פני שלושה הרמוניות (איור 7B) נמצאות היטב בסטיית התקן של כל תפוקה ניסיונית. לעומת זאת, הסכומים האולטרה-הרמוניים באיור 7C מראים של-PBS רגיל יש כמעט סדר גודל גבוה יותר ושונות גבוהה משמעותית בין הדגימות. דוגמאות אלה מצביעות על כך שאמצעי אחסון משותף התואם לתאים עשוי להציג אופני פעולה שעשויים להיות מיוחסים (באופן שגוי) לנוכחות של MBs. מאז זה בדרך כלל לא מעשי כדי degas תרבות מדיום בשל ההשפעה השלילית על תאים ו / או יציבות סוכן cavitation, זה קריטי כדי לבצע פקדים מתאימים בכל מחקר הקשורות cavitation.

figure-results-4503
איור 1: איורים של שני עיצובי מערכת חשיפה בארה"ב המשלבים ניטור cavitation: SAT3 (D-F). (A) SAT2 מכלול מבואר עם קיר צד הוסר לבהירות. (B)SAT2 עם קיר צדדי שלם. (C)תא חשיפה לתאי SAT2, מפורק. (D)הרכבה מבוארת SAT3. (E) SAT3 בתצורות רגילות (משמאל) ועדשות (מימין) להתאמת רוחב קרן בתדרים שונים. (F) תא חשיפה לתאי SAT3, מפורק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5269
איור 2: חישובים של קווי מתאר של שדה לחץ משרעת למחצה עבור מתמרים לא ממוקדים (משמאל) בקוטר 12.7 מ"מ וממוקדים כדורית (מימין). תדרים של 2, 4 ו- 8 מגה-הרץ מוצגים כקווי מתאר אדומים, כחולים וירוקים, בהתאמה, עבור רכיב PCD במקור הקואורדינטות (0,0). קווי המתאר החיצוניים ביותר של המכשיר הלא ממוקד אינם תלויים יחסית בתדירות, אך המבנה הפנימי תלוי בתדירות. השדה הממוקד כדורית מתכווץ ככל שהתדירות גדלה, אך בתוך קווי המתאר, השדות משתנים בצורה חלקה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6007
איור 3: מכשור למיזוג והקלטה של אותות cavitation (חצים כחולים), עירור מקור אמריקאי (קווים אדומים) והפעלת רכישת נתונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6429
איור 4: תגובות PCD של תחום (משמאל) ותדירות (ימין) שנרשמו עם MBs מדוללים פי 5 ב- PBS. שיא האירוע לחצים שליליים היו (A, B) 0.2 MPa, (C, D) 0.4 MPa, (E, F) 0.7 MPa, כל ב 0.5 MHz. הקלטות אות להתחיל 1.4 ms לפני תחילת t = 0 של 2.0 ms אולטרסאונד משך הדופק. (A, C, E) אותות תחום זמן (אדום) מוצגים בקנה מידה אנכי קבוע, המציין כיצד רמת התגובה משתנה בלחץ האירוע. עקבות הכניסה מציגות את האות כפי שנרשם (אדום) ועם מסנן מעבר גבוה של 2 מגה-הרץ (כחול) לחלון זמן שבמרכזו בזמן הטיסה ממקור לתא חשיפה לתא ל- PCD. (B, D, F) צפיפות ספקטרלית של רעש ואות מחושבת עבור t<0 ו- t>0, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7296
איור 5: היסטוריות ספקטרום על חשיפה של 50 שניות של השעיה של MBs מדולל 5x ב- PBS. (A)ספקטרום מלא ו- (B) כוחות אות כוללים, הרמוניים ופס רחב, כולם כפונקציה של זמן. תנאי הנהיגה היו 0.5 מגה-הרץ, 0.7 MPa לחץ שלילי שיא, 2.0 ms משך הדופק, 200 ms תקופת חזרה על הדופק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7892
איור 6: ההשפעה של גיאומטריית מיקוד PCD נרשמה עם דילול של 20:1 של microbubbles ב- PBS רגיל. תנאי הנהיגה היו: 1.0 מגה הרץ, 0.50 MPa שיא לחץ שלילי, 3.0 ms משך הדופק, 10 ms תקופת חזרה על הדופק. (A)ספקטרום מלא בממוצע לאורך זמן החשיפה ושלוש חזרות מדגם עצמאיות. (B)הספק בהרמוניה של 3, 4 ו- 5 מגה-הרץ, ובהספקשל2.5, 3.5 ו- 4.5 מגה-הרץ. קווים עבים הם אמצעי דגימה, אזורים מוצללים מציינים +/- 1 סטיית תקן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8641
איור 7: השפעת המדיה המופחתת שהוקלטה באמצעות PBS. (A)ספקטרום מלא בממוצע לאורך זמן החשיפה וחמש חזרות מדגם עצמאיות. (B)הספק בהרמוניה של 3, 4 ו- 5 מגה-הרץ, ובהספקשל2.5, 3.5 ו- 4.5 מגה-הרץ. קווים עבים הם אמצעי דגימה, אזורים מוצללים מציינים +/- 1 סטיית תקן. תנאי הנהיגה היו 1.0 MHz, 0.50 MPa שיא לחץ שלילי, 1.0 ms משך הדופק, 200 ms תקופת חזרה על הדופק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטר	יחידה	מינימום	המרבי
תדירות	מגה-הרץ	0.02	15
לחץ (שיא שלילי)	MPa	0.1	20
אורך פולס	מחזורים	1	CW
מחזור עבודה	%	1	CW
זמן חשיפה	s	10	1000

טבלה 1: סיכום טווח הפרמטרים המדווחים המקלים על sonoporation במבחנה.

Discussion

השלבים הקריטיים לכל מדידה אקוסטית נעטפו על ידי אפפל בשנת 1981⁷⁶ כ"הכירו את הנוזל שלכם, הכירו את שדה הקול שלכם, דעו מתי קורה משהו". בהקשר של פרוטוקול זה, אלה מקיפים את כיול המתמר ואת היישור ואת הכנת המים ואת צעדי הטיפול בבועה. ראשית, חיוני שההידרופון המשמש לכיול מתמר הנהיגה ו/או ה-PCD עצמו מכויל במדויק באמצעות שירות חיצוני רגיל או השוואה פנימית לתקן ייחוס. באופן דומה, התגובה של מתמר הנהיגה ו PCD צריך להיות מאופיין באופן קבוע כדי לבדוק כל שינוי פלט ו / או אובדן רגישות. אם תנאי הנהיגה ולקבל רגישות של המערכת אינם ידועים, אז זה יהיה בלתי אפשרי להסיק כל קשר משמעותי בין תנאי חשיפה, ביו אפקטים ופליטות אקוסטיות. קשור ישירות לכך, היישור של המתמרים זה לזה ואת תא המדגם צריך להיבדק בקפידה כדי להבטיח כי תנאי החשיפה בתוך התא הם כצפוי ואת נפח הדגימה עבור PCD מתאים לאזור העניין. כפי שצוין, תכולת הטמפרטורה והגז של המדיום ההשעיה יכולה להשפיע על התוצאות הסופיות באופן משמעותי ועקביות חשובה ביותר בהקשר זה⁷⁷^,⁷⁸. באופן דומה, ההכנה, האפיון והטיפול בהשעיית סוכן cavitation דורשים תשומת לב רבה כדי להבטיח כי התפלגות הגודל הצפוי וריכוז החלקיקים נמצאים בתוך המדגם. לדוגמה, אם ריכוז הבועות גבוה מדי, יהיה מיגון יעיל של נפח המדגם מהשדה בארה"ב האירוע. סוכני MB רגישים במיוחד להרס והתמזגות והדרכה נוספת על הטיפול בהם ניתן למצוא Mulvana et. אל. (2012)^79.

בעיה נפוצה מאוד עם זיהוי אותות cavitation היא השגת SNR נאותה. זה נובע בחלקו מאופי האות עצמו, כמתואר, אך עשוי לנבוע גם ממקורות של רעש חשמלי בתוך ההגדרה הניסיונית. בדיקת החיבורים בין רכיבי מערכת, במיוחד אלה הכוללים כבלים ציריים משותפים, עשויה לסייע בהסרת חלק מהם. ייתכן שיהיה צורך בהחלפה או בתיקון של כבלים ציריים משותפים. זיהוי והסרה או השבתה של ציוד אחר במעבדה, כגון משאבות שעלולות לגרום לרעש חשמלי, יכולות גם הן לסייע. התאמת עכבה חשמלית ירודה בין רכיבי המערכת יכולה להיות סיבה נוספת ליחס אות לרעש לקוי וגם פוטנציאל לנזק לציוד ויש לבדוק אותה בקפידה. יש לבדוק באופן דומה את הגדרות ההפעלה במחולל האותות ובאוסצילוסקופ כדי לאשר שהן מוגדרות כראוי לניסוי ולא חזרו להגדרות ברירת המחדל של היצרן. אם יש הרס משמעותי של בועות במהלך הטיפול, במקרה של SAT2, זה עשוי להיות מועיל לחבר מזרק שני ליציאת היציאה ולהשתמש בזה כדי לחלץ בעדינות נוזלים מהתא, ובכך לצייר את ההשעיה. הדבר יכול גם לסייע בביטול מקרופובלים או בהפעלת זרימה במהלך החשיפה לארה"ב, אם תרצה בכך.

לא ניתן לבטל לחלוטין השתקפויות אקוסטיות בתוך תא הדגימה ולכן שדה האירוע לא יהיה אחיד לחלוטין על כל נפח המדגם. כפי שצוין בשלבים 1.3.2 ו-1.3.3, ההמרה של חלונות אקוסטיים תהיה תלוית תדר ולכן יש לשקול בזהירות את רוחב הפס הרצוי למדידות פליטה אקוסטית. בפרט, ייתכנו השתקפויות מרובות משמעותיות של רכיבי תדר גבוה יותר. זוהי סיבה נוספת לכך שכיול השדה בתוך המערכת המורכבת במלואה חשוב כל כך למזעור אי הוודאות בלחץ האירועים. גטינג מתאים של האותות המוקלטים צריך להיחשב גם כדי למזער את ההשפעות של השתקפויות מרובות. השימוש במכשירים מסחריים לנוחות והצורך בשקיפות אקוסטית פירושו שיש להקריב שקיפות אופטית מסוימת. זה עשוי להשפיע על איכות ההדמיה הבאה, למשל, כדי להעריך את הכדאיות של התא או ספיגת סמים. חלק מהקרומים המשמשים במכשירים מסחריים הם גם נקבוביים, ולכן, בידוד לא מושלם מתרחש בין תא הדגימה לבין אמבט המים שמסביב. כאמור, ניתן למתן את הסיכון המתאים לזיהום באמצעות תת-תא קטן יותר, שתוכנו ניתן להחלפה באופן קבוע. התקני תרבות התא המצוינים בטבלת החומרים מתאימים בעיקר עבור monolayers התא כי לא יכול להיות מייצג של רקמות במונחים של כל ארה"ב / cavitation בתיווך ביו אפקטים. הקרבה של התאים למשטח מוצק תשפיע גם על הדינמיקה של MB באופן שאולי לא משקף את התנאים ב- vivo, למשל, קידום microstreaming ו microjetting כמתואר במבוא. עם זאת, ניתן לטפל במגבלות אלה באמצעות החלפה פשוטה של מודלים חלופיים לרקמות.

המטרה בהצעת הפסיכומטרי היא לספק אמצעי לשיפור הרבייה של תנאי חשיפה אקוסטית ופליטות אקוסטיות בין מחקרים על ביו-יעילות בתיווך ארה"ב, ובכך בתקווה להקל על הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים ופיתוח טכניקות ניטור טיפול לשיפור הבטיחות והיעילות. המערכות מתוכננות להיות תואמות להתקני תרבית תאים זמינים מסחרית, המאפשרים לבצע מגוון רחב של מבחנים ביולוגיים בהתאם ליישום העניין ולאפשר ביצוע של ניסויי תפוקה גבוהה, תוך הסרת הצורך בהליכי יישור גוזלים זמן בין ריצות. על ידי סטנדרטיזציה של פרוטוקולים לאפיון תנאי החשיפה ותפיסת פליטות אקוסטיות, ניתן בתקווה להפחית את השונות התלויה במערכת. טווח הפרמטרים שיש לחקור לניסוי מסוים יהיה תלוי ביישום (האפקט הביולוגי הרצוי, סוג התא, עומק רקמת המטרה אם in vivo וכו ') ואת האופי של כל סוכן cavitation בשימוש. בהתחשב במספר הגדול של משתנים (תדר בארה"ב, משרעת לחץ, אורך הדופק, תדירות חזרה על הדופק וכו ') לחקור באופן מלא את כל שטח הפרמטרים לא סביר להיות מעשי. היתרון של הפרוטוקול המוצע הוא שהוא מאפשר לקבוע במהירות גבולות מסוימים במרחב פרמטרים זה. לדוגמה, הוא מאפשר קביעת הלחץ המינימלי שבו נוצר אות cavitation, הלחץ המרבי או אורך הדופק שניתן להשתמש בהם לפני ניתוק התא / מוות מתרחש, ואת הלחץ שבו הרמוניות שבר או רעש פס רחב מיוצרים. מומלץ לבצע קבוצה כזו של מדידות scoping כצעד ראשון בכל מחקר.

כפי שהוצג, הפסיכומטרי מיועד לניטור בזמן אמת של פליטות אקוסטיות, כאשר מבחנים ביולוגיים מבוצעים מחוץ לניסוי. זה יהיה פשוט יחסית, עם זאת, כדי לשנות את SAT כדי לאפשר תצפית אופטית ישירה של תא המדגם באמצעות מטרה מיקרוסקופ. זה יכול בתורו להיות מקשר פלואורסצנטי ו / או מערכת מיקרוסקופיה במהירות גבוהה כדי לאפשר תצפית של ספיגת סמים ודינמיקה בועה, למשל. יציאת PCD כפי שמוצג כיום במונחים של מתח מציין: i) סוגי התנהגות cavitation ואת הפרופורציות היחסיות שלהם; ii) כמה זמן נמשכות התנהגויות cavitation אלה; iii) האם מאפייני החשיפה המצטברת בזמן שנצפו מתואמים לביו-אפקט מסוים; ו-4) האם הרמות היחסיות וההתנהגויות תלויות הזמן עולות בקנה אחד עם ניסויים קודמים במערכת החשיפה. בעוד רגישות לקבל של PCD ניתן לכמת, על מנת לאפיין באופן אמין את הפליטות האקוסטיות במונחים של אנרגיה מוחלטת, מידע מרחבי נוסף נדרש. זה יכול להיות מושגת על ידי החלפת PCD עם בדיקה מערך ליישם מיפוי אקוסטי פסיבי (PAM)⁸⁰. עם זאת, הדבר יגדיל את המורכבות של עיבוד אותות ואת הזמן החישובי והעוצמה הנדרשים.

מכשור אחר למדידת עמידות חשמלית ממברנה או יישום של שיטות מיקוד פיזיות, למשל שדות מגנטיים, יכול גם להיות משולב. כמו כן ניתן יהיה להשתמש במבני רקמות תלת מימדיים כגון ספרואידים של גידולים, אורגנואידים, או אפילו דגימות רקמת ויוו אקס על מצעי ג'ל "רכים" אקוסטיים במקום המונוליירים של התאים כדי לחקור השפעות אמריקאיות בתיווך cavitation בסביבות רקמות מציאותיות יותר.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים למועצת המחקר להנדסה ולמדעי הפיזיקה על תמיכתה בעבודה זו באמצעות מענק EP/L024012/1. VB נתמך גם על ידי המועצה לחקר ההנדסה ומדעי הפיזיקה (EPSRC) והמועצה למחקר רפואי (MRC) (מענק EP/L016052/1). VB ו- AV מודים לקרן קלרנדון על מלגות לתואר שני. AV גם מודה אקסטר מכללה למלגת סנטנדר. המחברים חייבים לג'יימס פיסק ודיוויד סולסברי על עזרתם רבת הערך בייצור המנגנון. הם גם מודים בהכרת תודה על תרומתם של ד"ר דריו קארוגו וג'ושוע אוון בפיתוח של פסיכומטרי אב טיפוס קודמים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorber	Precision Acoustics	APTFlex F28 panel	1.0 cm standard thickness
Amplifier (power)	E&I Ltd.	1040L	400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre)	Stanford Research Systems	SR445A	Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater	Aquael	Ultra 50W	Different models for different tank sizes.
Digitizer	TiePie Engineering	HS5-110-XM	Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone	Precision Acoustics	FOH	0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles	Bracco	SonoVue	FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3)	Olympus NDT	F-102	90 degree beam reflection
PCD transducer	Olympus NDT	V320-SU	Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable	Olympus NDT	BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid)	Corning	Sylgard 184	See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal)	Zeus	PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal)	VWR	391-2101	6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator	Agilent	33250	Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2	Ibidi	µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3	Corning	Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3)	Sonic Concepts	H107 with central hole	Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage

References

Maier, A., Steidl, S., Christlein, V., Hornegger, J. Medical Imaging Systems - An Introductory Guide. Lecture Notes in Computer Science. , (2018).
Tachibana, K., Tachibana, S. Albumin microbubble echo-contrast material as an enhancer for ultrasound accelerated thrombolysis. Circulation. 92, 1148-1150 (1995).
Bao, S., Thrall, B. D., Miller, D. L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound in Medicine and Biology. 23 (6), 953-959 (1997).
Price, R. J., Skyba, D. M., Kaul, S., Skalak, T. C. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation. 98 (13), 1264-1267 (1998).
Theek, B., et al. Sonoporation enhances liposome accumulation and penetration in tumors with low EPR. Journal of Controlled Release. 231, 77-85 (2016).
Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
Snipstad, S., et al. Ultrasound Improves the Delivery and Therapeutic Effect of Nanoparticle-Stabilized Microbubbles in Breast Cancer Xenografts. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
Unga, J., Hashida, M. Ultrasound induced cancer immunotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 144-153 (2014).
Yang, C., Du, M., Yan, F., Chen, Z. Focused ultrasound improves NK-92MI cells infiltration into tumors. Frontiers in Pharmacology. 10, 326 (2019).
McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Ultrasound and microbubble-mediated blood-brain barrier disruption for targeted delivery of therapeutics to the brain. Methods in Molecular Biology. 1831, 111-119 (2018).
Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9, 321 (2019).
Ebben, H. P., Nederhoed, J. H., Lely, R. J., Wisselink, W., Yeung, K. Microbubbles and UltraSound-accelerated Thrombolysis (MUST) for peripheral arterial occlusions: Protocol for a phase II single-arm trial. BMJ Open. 7, 014365 (2017).
de Saint Victor, M., Barnsley, L. C., Carugo, D., Owen, J., Coussios, C. C., Stride, E. Sonothrombolysis with Magnetically Targeted Microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1151-1163 (2019).
Dixon, A. J., Li, J., Rickel, J. M. R., Klibanov, A. L., Zuo, Z., Hossack, J. A. Efficacy of Sonothrombolysis Using Microbubbles Produced by a Catheter-Based Microfluidic Device in a Rat Model of Ischemic Stroke. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
Horsley, H., et al. Ultrasound-activated microbubbles as a novel intracellular drug delivery system for urinary tract infection. Journal of Controlled Release. 301, 166-175 (2019).
Lattwein, K. R., et al. Sonobactericide: An Emerging Treatment Strategy for Bacterial Infections. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (2), 193-215 (2020).
Crum, L. A., Fowlkes, J. B. Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature. 319, 52-54 (1986).
Holland, C. K., Apfel, R. E. Thresholds for transient cavitation produced by pulsed ultrasound in a controlled nuclei environment. Journal of the Acoustical Society of America. 88, 2059-2069 (1990).
Rifai, B., Arvanitis, C. D., Bazan-Peregrino, M., Coussios, C. C. Cavitation-enhanced delivery of macromolecules into an obstructed vessel. The Journal of the Acoustical Society of America. 128, (2010).
Wu, J., Ross, J. P., Chiu, J. F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (3), 1460-1464 (2002).
Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
De Cock, I., et al. Ultrasound and microbubble mediated drug delivery: acoustic pressure as determinant for uptake via membrane pores or endocytosis. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 197, 20-28 (2015).
Pereno, V., Lei, J., Carugo, D., Stride, E. Microstreaming inside Model Cells Induced by Ultrasound and Microbubbles. Langmuir. 36, 6388-6398 (2020).
Chen, H., Brayman, A. A., Kreider, W., Bailey, M. R., Matula, T. J. Observations of translation and jetting of ultrasound-activated microbubbles in mesenteric microvessels. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (12), 2139-2148 (2011).
Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, 2161-2170 (2009).
Song, J. H., Moldovan, A., Prentice, P. Non-linear Acoustic Emissions from Therapeutically Driven Contrast Agent Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (8), 2188-2204 (2019).
Ohl, C., Arora, M., Ikink, R., De Jong, N., Versluis, M., Delius, M. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal. 91 (11), 4285-4295 (2006).
Li, Z. G., Liu, a. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
Wang, Q. X., Manmi, K. Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound. Physics of Fluids. 26, 032104 (2014).
Suslick, K. S. . Ultrasound: Its Chemical, Physical, and Biological Effects. Radiology. , (1988).
Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature reviews. Drug discovery. 4 (3), 255-260 (2005).
Mitragotri, S. Sonophoresis: Ultrasound-mediated transdermal drug delivery. Percutaneous Penetration Enhancers Physical Methods in Penetration Enhancement. , 3-14 (2017).
Park, J., Lee, , et al. Enhanced Transdermal Drug Delivery by Sonophoresis and Simultaneous Application of Sonophoresis and Iontophoresis. AAPS PharmSciTech. 20 (3), 96 (2019).
Lentacker, I., De Cock, I., Deckers, R., De Smedt, S. C., Moonen, C. T. W. Understanding ultrasound induced sonoporation: Definitions and underlying mechanisms. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 49-64 (2014).
Wawryka, P., Kiełbik, A., Iwanek, G. Microbubble based sonoporation - the basics into clinical implications. Medical Research Journal. 4 (3), 178-183 (2019).
Hilgenfeldt, S., Lohse, D., Zomack, M. Sound scattering and localized heat deposition of pulse-driven microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 107 (6), 3530-3539 (2000).
Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound Medical Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
Tan, J., Li, P., Xue, H., Li, Q. Cyanidin-3-glucoside prevents hydrogen peroxide (H 2 O 2 )-induced oxidative damage in HepG2 cells. Biotechnology Letters. 42 (11), 2453-2466 (2020).
Costley, D., et al. Treating cancer with sonodynamic therapy: A review. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 107-117 (2015).
You, D. G., et al. ROS-generating TiO2 nanoparticles for non-invasive sonodynamic therapy of cancer. Scientific Reports. 6, 23200 (2016).
Canavese, G., et al. Nanoparticle-assisted ultrasound: A special focus on sonodynamic therapy against cancer. Chemical Engineering Journal. 340, 155-172 (2018).
Beguin, E., et al. Direct Evidence of Multibubble Sonoluminescence Using Therapeutic Ultrasound and Microbubbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (22), 19913-19919 (2019).
Stride, E., et al. Microbubble Agents: New Directions. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1326-1343 (2020).
Rapoport, N., Gao, Z., Kennedy, A. Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute. 99 (14), 1095-1106 (2007).
Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
Zhang, L., et al. Mitochondria-Targeted and Ultrasound-Activated Nanodroplets for Enhanced Deep-Penetration Sonodynamic Cancer Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (9), 9355-9366 (2019).
Delogu, L. G., et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16612-16617 (2012).
Paris, J. L., et al. Ultrasound-mediated cavitation-enhanced extravasation of mesoporous silica nanoparticles for controlled-release drug delivery. Chemical Engineering Journal. 340, 2-8 (2018).
Mannaris, C., et al. Gas-Stabilizing Gold Nanocones for Acoustically Mediated Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1800184 (2018).
Kwan, J. J., et al. Ultrasound-induced inertial cavitation from gas-stabilizing nanoparticles. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 92 (2), (2015).
Kwan, J. J., et al. Ultrasound-Propelled Nanocups for Drug Delivery. Small. 11 (39), 5305-5314 (2015).
Mannaris, C., et al. Microbubbles, Nanodroplets and Gas-Stabilizing Solid Particles for Ultrasound-Mediated Extravasation of Unencapsulated Drugs: An Exposure Parameter Optimization Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 45, 954-967 (2019).
Roovers, S., et al. The Role of Ultrasound-Driven Microbubble Dynamics in Drug Delivery: From Microbubble Fundamentals to Clinical Translation. Langmuir. 35, 10173-10191 (2019).
Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and Evaluation of Doxorubicin-containing Microbubbles for Ultrasound-triggered Doxorubicin Delivery: Cytotoxicity and Mechanisms Involved. Molecular Therapy. 18 (1), 101-108 (2010).
De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
Stride, E. P., Coussios, C. C. Cavitation and contrast: The use of bubbles in ultrasound imaging and therapy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 224 (2), 171-191 (2010).
Stride, E., Coussios, C. Nucleation, mapping and control of cavitation for drug delivery. Nature Reviews Physics. 1, 495-509 (2019).
Dong, Y., et al. Antibiofilm effect of ultrasound combined with microbubbles against Staphylococcus epidermidis biofilm. International Journal of Medical Microbiology. 307 (6), 321-328 (2017).
Van Rooij, T., et al. Vibrational Responses of Bound and Nonbound Targeted Lipid-Coated Single Microbubbles. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (5), 785-797 (2017).
Duan, X., Yu, A. C. H., Wan, J. M. F. Cellular Bioeffect Investigations on Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Sonoporation: Platform Design and Flow Cytometry Protocol. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (9), 1422-1434 (2019).
Hu, Y., Wan, J. M. F., Yu, A. C. H. Membrane Perforation and Recovery Dynamics in Microbubble-Mediated Sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
Carugo, D., Owen, J., Crake, C., Lee, J. Y., Stride, E. Biologicallyand acoustically compatible chamber for studying ultrasound-mediated delivery of therapeutic compounds. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (7), 1927-1937 (2015).
Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterisation of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12 (3), 034109 (2018).
Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16486-16491 (2012).
Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2016).
Helfield, B. L., Chen, X., Qin, B., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Mechanistic Insight into Sonoporation with Ultrasound-Stimulated Polymer Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2678-2689 (2017).
Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the Role of Lipid Transfer in Microbubble-Mediated Drug Delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
Kinsler, L. E., Frey, A. R., Coppens, A. B., Sanders, J. V. . Fundamentals of Acoustics, 4th Edition. , (2000).
Wear, K. A. Considerations for Choosing Sensitive Element Size for Needle and Fiber-Optic Hydrophones-Part I: Spatiotemporal Transfer Function and Graphical Guide. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (2), 318-339 (2019).
Stoica, P., Moses, R. . Spectral Analysis of Signals. , (2005).
Lyka, E., Coviello, C., Kozick, R., Coussios, C. C. Sum-of-harmonics method for improved narrowband and broadband signal quantification during passive monitoring of ultrasound therapies. Journal of the Acoustical Society of America. 140 (1), 741-754 (2016).
Barrack, T., Stride, E. Microbubble Destruction During Intravenous Administration: A Preliminary Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (3), 515-522 (2009).
Apfel, R. E. Acoustic cavitation. Methods in Experimental Physics. 19, 355-411 (1981).
Mulvana, H., Stride, E., Tang, M. X., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. The Influence of Gas Saturation on Microbubble Stability. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (6), 1097-1100 (2012).
Mulvana, H., Stride, E., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. Temperature dependent behavior of ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (6), 925-934 (2010).
Mulvana, H., Eckersley, R. J., Tang, M. X., Pankhurst, Q., Stride, E. Theoretical and Experimental Characterisation of Magnetic Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (5), 864-875 (2012).
Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 Microbubbles Cavitation Sonoporation

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: