Estudando terapia aprimorada da cavitação

Resumo

O protocolo experimental apresentado pode ser usado para realizar medições em tempo real da atividade de cavitação em um dispositivo de cultura celular com o objetivo de permitir a investigação das condições necessárias para a entrega bem sucedida de medicamentos e/ou outros efeitos biológicos.

Resumo

O interesse pelas aplicações terapêuticas do ultrassom é significativo e crescente, com potenciais alvos clínicos que vão do câncer à doença de Alzheimer. A cavitação - a formação e o movimento subsequente de bolhas dentro de um campo de ultrassom - representa um fenômeno-chave que sustenta muitos desses tratamentos. Permanece, no entanto, uma incerteza considerável em relação aos mecanismos detalhados de ação pelos quais a cavitação promove efeitos terapêuticos e há a necessidade de desenvolver técnicas de monitoramento confiáveis que possam ser implementadas clinicamente. Em particular, há uma variação significativa entre os estudos nos parâmetros de exposição relatados como com sucesso, fornecendo efeitos terapêuticos e as emissões acústicas correspondentes. O objetivo deste artigo é fornecer diretrizes de design e um protocolo experimental utilizando componentes amplamente disponíveis para a realização de estudos de biofeitos mediados pela cavitação, e incluir monitoramento acústico em tempo real. Espera-se que o protocolo possibilite a incorporação mais difundida do monitoramento acústico em experimentos de ultrassom terapêutico e facilite a comparação entre estudos de condições de exposição e sua correlação com biofes relevantes.

Introdução

O ultrassom (EUA) tem sido amplamente utilizado como técnica de diagnóstico por imagem devido à sua natureza segura e não invasiva, à sua facilidade de implementação ao lado do paciente e ao seu custo efetivo¹. Ao lado de suas capacidades de diagnóstico e monitoramento, os EUA têm um potencial considerável para aplicações terapêuticas. Os primeiros trabalhos exploraram seu uso em trombílise, A transfecção de DNA e o fornecimento de medicamentos^2,3,4 e os EUA terapêuticos representam agora uma área muito ativa de pesquisa, com aplicações incluindo tratamento tumoral^5,6,7, imunoterapia^8,9, barreira hematoencefálica (BBB) interrupção^10,11,12, trombolise^13,14,15, e tratamento de infecção bacteriana^16,17. Um fenômeno-chave que sustenta essas aplicações é a cavitação: a nucleação, o crescimento e a oscilação das cavidades gasosas devido a alterações na pressão do fluido^18,19.

Há uma gama de mecanismos pelos quais a cavitação produz efeitos biológicos. Por exemplo, a natureza altamente não linear das oscilações de bolhas sob a influência de um campo aplicado nos EUA pode gerar microstreaming no líquido circundante que pode tanto melhorar a convecção de drogas²⁰ e exercer tensões de cisalhamento no tecido nas proximidades das bolhas. Isso é particularmente prevalente quando as bolhas estão nas proximidades de um limite, fazendo com que as bolhas oscilem não esfericamente, e podem potencialmente promover a absorção de drogas através da permeabilização induzida por tesoura^21,22,23,24. Em pressões mais altas, são observadas oscilações de amplitude maiores e rápido colapso da bolha, transmitindo estresse mecânico direto²⁵ e frequentemente gerando ondas de choque, e consequentemente grandes gradientes de pressão que podem interromper e permeabiliar tecidos^26,27. O colapso de bolhas perto de uma superfície também pode resultar na formação de microjatos líquidos de alta velocidade^28,29,30. Esses microjatos podem penetrar no tecido, potencialmente criando poros ou induzindo ondas de estresse^{secundárias 31,32}. A permeabilização das membranas biológicas nos níveis tecidual e celular é várias vezes referida como sonoforese, utilizada principalmente no contexto do aprimoramento induzido pelos EUA na permeabilidade da pele^33,34e sonoporação, utilizada principalmente para descrever a permeabilização reversível da membrana celular devido à formação de poros de membrana^35,36.

A absorção viscosa no líquido imediatamente em torno da bolha oscilante pode produzir um efeito de aquecimento substancial³⁷. Além disso, as oscilações altamente não lineares produzem radiação acústica em frequências superiores ao campo norte-americano. Isso leva a um aumento da absorção no tecido circundante e um aquecimento adicional^{de 38}. O colapso da bolha também pode ser acompanhado por efeitos químicos devido às altas temperaturas e pressões transitórias no núcleo da bolha, como a geração de espécies altamente reativas e radiação eletromagnética, conhecida como sonoluminescência³². Esses efeitos têm sido investigados para avaliar danos potenciais e/ou ativação de vias celulares relevantes para entrega³⁹ e explorados na ativação local de drogas sensíveis à luz em uma abordagem conhecida como terapia sonodinâmica^40,41,42,43.

Muitos biofeitos mediados pelos EUA podem ser iniciados apenas através do controle dos parâmetros de campo dos EUA (amplitude de pressão, frequência, comprimento do pulso e frequência de repetição e duração da exposição), mas gerar de forma confiável na cavitação no tecido biológico muitas vezes requer altas energias de entrada e, portanto, carrega um risco elevado de dano. A introdução de núcleos de cavitação exógena ou artificial pode reduzir substancialmente a energia de entrada necessária para produzir a ampla gama de efeitos discutidos acima e introduz ainda efeitos adicionais que podem não ser possíveis apenas com os EUA. Os núcleos de cavitação incluem bolhas de gás^26,44, gotículas líquidas^45,46,47 e partículas sólidas^48,49,50, com núcleos de cavitação nanoescala sendo uma área emergente de investigação para seus benefícios em termos de tempo de circulação prolongada, extravasação melhorada e atividade de cavitação prolongada^49,51,52,53.

Os núcleos mais utilizados são microbolhas de gás (MBs), originalmente utilizadas como agentes de contraste em imagens de diagnóstico. Eles são tipicamente de 1-2 micrômetros de diâmetro e contêm um núcleo de um gás de alto peso molecular com baixa solubilidade aquosa no meio circundante. O núcleo é cercado por um lipídio protetor, proteína ou concha de polímero mais comumente consistindo de fosfolipídios⁵⁴. Quando expostos a um campo norte-americano, a compressão dos MBs faz com que eles passem por oscilações volumosas, consequentemente produzindo forte dispersão acústica, responsável pelo sucesso dos MBs como agente de contraste. Como mencionado, essas oscilações também levam aos efeitos mecânicos, térmicos e químicos acima mencionados que podem ser aproveitados em aplicações terapêuticas. O processo de revestimento MB também oferece um mecanismo para encapsular drogas dentro da estrutura MB e para anexar drogas e/ou direcionar espécies à superfície MB. Essa técnica facilita a liberação desencadeada de medicamentos para reduzir a toxicidade sistêmica⁵⁵. Também foi demonstrado recentemente que o material da superfície mb pode ser transferido para estruturas biológicas, aumentando a entrega de medicamentos através da chamada "sonoimpressão"^56,57,58.

O monitoramento da atividade de cavitação mediada pelos EUA pode fornecer insights sobre os efeitos biológicos resultantes, tanto in vitro quanto in vivo, e potencialmente permite a sintonia e otimização desses efeitos. Os dois métodos mais amplamente aplicados para monitorar a atividade de cavitação são i) ópticos, que usam microscopia de vídeo de ultra alta velocidade e geralmente não são viáveis in vivo; e ii) acústico, que registram os campos de som re-irradiados produzidos por bolhas oscilantes e/ou em colapso. Tanto os componentes de amplitude quanto de frequência do sinal acústico contêm informações sobre o comportamento da bolha. Baixas concentrações de bolhas em baixas amplitudes dos EUA têm sido demonstradas para produzir emissões predominantemente harmônicas (múltiplos inteiros da frequência de condução)⁵⁹. À medida que as pressões de condução aumentam, o espectro de emissões de bolhas também pode conter componentes fracionados conhecidos como subharmônicas e ultraharmônicas⁶⁰ que indicam comportamento não linear mais forte, bem como ruído de banda larga, que é indicativo de cavitação inercial. Harmônicos inteiros são um indicador primário da oscilação da bolha, mas também podem ser causados por não linearidades em qualquer lugar de um sistema experimental, por exemplo, devido à propagação não linear. Em contraste, harmônicos fracionados e ruídos de banda larga estão fortemente correlacionados com a dinâmica das bolhas.

A relação entre o comportamento das bolhas e as emissões acústicas detectadas pode ser complicada por fatores como o campo dos EUA incidente, o ambiente de nucleação e as características da via de detecção⁶⁰. No entanto, informações importantes sobre o comportamento das bolhas e suas interações com as células podem ser obtidas por tendências criteriosas de frequência e energia no espectro acústico. Esses dados também podem fornecer informações valiosas que podem ser usadas para formar a base para técnicas de monitoramento de tratamento clínico. Para explorar plenamente essas informações, é necessário o desenvolvimento de métodos experimentais robustos, traduzíveis e reprodutíveis.

Atualmente, há uma variação substancial nos protocolos relatados para a concepção de sistemas e a realização de estudos para apoiar o desenvolvimento de terapias assistidas por cavitação. Em termos do aparelho, uma série de abordagens de design foi realizada. Vários grupos fizeram uso de câmaras de placas paralelas^56,61,62,63, construídas sob medida ou comercialmente disponíveis (por exemplo, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) desenvolveram uma câmara celular juntamente com um módulo de sônica dos EUA e imagem confocal em tempo real⁶⁴, Carugo et al. (2015) utilizou um sistema composto por um prato de cultura celular comercialmente disponível com uma tampa PDMS personalizada para permitir a submersão em um banho de água durante a exposição dos EUA⁶⁵, e Pereno et al. (2018) utilizaram um dispositivo composto por ressonadores acoustofluidos em camadas que permitem a caracterização óptica e acústica simultânea da dinâmica das bolhas e das interações^{bubble-cell 66}. O uso de projetos personalizados e específicos de aplicativos complica a caracterização do campo dos EUA e outras condições de exposição ambiental, tornando as comparações de estudos cruzados desafiadoras. Por exemplo, há uma variação considerável nos parâmetros dos EUA identificados para alcançar a sonoporação bem sucedida, que incluem frequências centrais que variam de 0,02 a 15 MHz, ciclos de impostos variando de 1% a ondas contínuas, e pressões de 0,1 a 20 MPa^{23,64,67,68,69,70} ( Tabela1). Há uma variação igualmente considerável nos componentes espectrais (harmônicos, sub-harmônicos etc.) que foram identificados como associados a efeitos biológicos particulares.

O objetivo deste trabalho, portanto, é fornecer uma estrutura de design e implementação de sistema facilmente reprodutível para o estudo in vitro de biofeitos celulares induzidos pela cavitação com a inclusão específica de uma capacidade de monitoramento de cavitação.

Protocolo

1. Princípios de Design de Sistemas

NOTA: Esta seção apresenta os princípios de design usados para criar sistemas para exposição e monitoramento de cavitação dos EUA. Esses princípios são ilustrados com dois sistemas existentes de transfecção acústica (SAT) (mostrado na Figura 1). Cada sistema consiste em um compartimento de exposição celular, uma fonte dos EUA, e um único transdutor de elementos funcionando como um detector de cavitação passiva (PCD), todos integrados em uma câmara de teste benchtop. Esses projetos baseiam-se no desenvolvimento do sistema anterior descrito em Carugo et al. (2015)⁶⁵.

1. Maximize a facilidade de uso.
   1. Torne o compartimento de exposição celular compatível com as técnicas de cultura existentes e sistemas de imagem usando dispositivos de cultura celular comercial existentes como substratos de semeadura/crescimento.
      1. Para o SAT2, utilize um prato de cultura (35 mm de diâmetro, dos quais uma área de 21 mm de diâmetro é observável, ver Tabela de Materiais).
      2. Para SAT3, utilize uma pastilha Transwell (6,5 mm de diâmetro, consulte Tabela de Materiais). Os Transwells têm uma membrana permeável e, portanto, precisam ser colocados em mídia celular em vez de água.
2. Habilite o carregamento e a vedação rápidos do compartimento de exposição celular.
   1. Forme o compartimento de exposição celular SAT2 por pressione a montagem de uma tampa flexível de polímero sobre o prato de cultura (Carugo et al. 2015⁶⁵). Como visto na Figura 1C,a tampa tem um par de orifícios de 1,2 mm de diâmetro que permitem encher o compartimento com uma seringa de agulha cega de 18 G. Após o enchimento, sele estas portas de enchimento com hastes plásticas curtas (Tabela de Materiais).
   2. Encha o compartimento SAT3 por seringa ou pipeta e vedação por pressione uma rolha de borracha/bung.
   3. Habilite o carregamento rápido do compartimento de exposição celular selada na câmara de teste. Os suportes para os compartimentos de exposição celular foram incorporados nas tampas da câmara, onde uma prensa de luz é suficiente para garantir o alinhamento adequado. Com os sistemas mostrados na Figura 1,o tempo para alterações amostrais pode ser tão curto quanto 20 segundos quando vários compartimentos de exposição celular foram preparados com antecedência.
   4. Minimize o volume interno da câmara para que o sistema seja portátil e a quantidade de água/mídia necessária possa ser minimizada. Isso também acelera a recuperação de derramamentos acidentais ou vazamentos de agentes de cavitação fora do compartimento de exposição celular.
      NOTA: O volume interno sat2 é de aproximadamente 0,8 L. O volume interno SAT3 é de aproximadamente 7,6 L – maior para acomodar fácil carregamento e mudança de transdutor de origem ou sua configuração. Uma câmara interna de 0,3 L foi adicionada para minimizar o volume descartável e permitir que fluidos biologicamente relevantes que não a água de enchimento do tanque (por exemplo, mídia de cultura celular) sejam usados. O fundo interno da câmara é feito de folha mylar de 30 μm de espessura para permitir a transmissão acústica máxima.
   5. Faça com que a câmara e os componentes internos de materiais opticamente limpos quando possível, de modo que quaisquer problemas (por exemplo, vazamentos, macrobolhas aprisionadas) possam ser rapidamente observados e corrigidos.
3. Maximize a transmissibilidade acústica do compartimento de exposição.
   1. Maximize a transmissibilidade através das escolhas de materiais de parede e espessuras. Sob a suposição de que os líquidos de ambos os lados de uma parede são essencialmente os mesmos (por exemplo, água), a magnitude do coeficiente de transmissão de pressão de incidência normal⁷¹ é:
      , onde λ é o comprimento de onda na parede de espessura L, e z _L e z_o são as impedâncias características (produtos de densidade e velocidade sonora) para o material da parede e líquido, respectivamente. T = 1 indica transmissão perfeita.
   2. Para o monitoramento de amplo espectro da cavitação (por exemplo, 1-8 MHz), a maioria dos polímeros de laboratório (por exemplo, PDMS, PTFE, poliestireno) alterará a pressão transmitida em não mais de 10% se a espessura do material for inferior a 1/10 de um comprimento de onda no material. Essa condição pode ser difícil de atender com suprimentos padrão em altas frequências (por exemplo, #1,5 cobre deslizamento a 8 MHz), por isso é uma boa prática prever ou calibrar diretamente a resposta da frequência de transmissão.
   3. Para uma transmissão estreita de banda do sinal de origem dos EUA no compartimento de exposição celular, permita uma camada mais espessa se for aproximadamente um múltiplo inteiro de meio comprimento de onda no material de camada. Por exemplo, a tampa PDMS no SAT2 é usada com uma espessura de 2,0 mm (~2 comprimento de onda a 1MHz, c_PDMS ~ 1000 m/s).
4. Maximize a região de exposição através da seleção do ambiente de origem e celular.
   1. Para maximizar o número de células expostas, torne a área de fixação celular o mais ampla possível, mantendo a compatibilidade com equipamentos de cultivo e imagem disponíveis.
   2. Use uma fonte norte-americana com um campo que abrange a área de fixação celular com variabilidade espacial mínima usando a região pré-focal de uma grande fonte focada (SAT2) ou uma fonte focada ou com lentes com uma largura principal do lobo que corresponda ao diâmetro da área de fixação celular (SAT3). Consulte a Tabela de Materiais para obter fontes específicas.
   3. Minimize a complexidade do campo introduzida pelo suporte do compartimento celular, apoiando mecanicamente o compartimento celular bem longe da parte mais forte do campo incidente, minimizando a seção transversal de dispersão do suporte ou colocando material absorvente no suporte. Exemplos são mostrados nas Figuras 1A e 1D.
5. Certifique-se de condições de exposição repetíveis.
   1. Final termine o campo acústico em um limite fixo para eliminar a variabilidade que pode surgir de interfaces ar-água em câmaras parcialmente preenchidas. No SAT2 e 3, isso é realizado com a instalação de um absorvedor acústico (ver Tabela de Materiais) na tampa da câmara com um benefício adicional de reduzir a complexidade do campo que pode surgir de reflexos de limites.
   2. Monitore e regise a tensão da unidade de origem na entrada de saída/fonte do amplificador para que uma pequena variabilidade ou um grande defeito possa ser detectado rapidamente. Use uma sonda de tensão ou outro dispositivo seguro para usar sobre a faixa de tensão de acionamento. Verifique periodicamente a calibração da sonda de tensão usando uma fonte bem conhecida, como um gerador de forma de onda.
   3. Controle, monitore e regise a temperatura da câmara e seu conteúdo. Respostas de células, transdutores e meio de propagação podem ser todas sensíveis à temperatura. No SAT2, o monitoramento e o controle são realizados com um par de portas de circulação conectadas a um sistema de condicionamento de água, enquanto o SAT3 emprega um aquecedor de aquário (não mostrado). Defina a temperatura da água conforme necessário para imitar as condições fisiológicas relevantes para a aplicação terapêutica.
      NOTA: as temperaturas internas podem mudar tanto como resultado de fatores externos quanto do aquecimento gerado pelos EUA do transdutor e do meio.
   4. Desgas cuidadosamente o líquido da câmara para minimizar a probabilidade de cavitação não intencional e/ou dispersão de bolhas pré-existentes no caminho de propagação.
      NOTA: se a desgaseamento não for realizada, por exemplo, devido ao impacto negativo nas células, haverá um nível de fundo aprimorado de atividade de bolha, para o qual se adequa.
6. Calibrar o sistema totalmente montado.
   1. Inclua um meio de medir o incidente do campo de pressão sobre as células expostas quando todos os componentes do sistema estiverem no lugar, incluindo o compartimento de exposição celular. No SAT2 e 3, isso é realizado com uma abertura na tampa da câmara através da qual uma agulha ou hidrofone de fibra óptica poderia ser inserido sem perturbar o campo a ser medido. Faça as medições o mais perto possível de onde as células estão localizadas.
   2. Escolha um hidrofone com um raio sensível (um_rcv) é pequeno o suficiente para que ele não reporte mal o campo de pressão que está sendo medido. O tamanho aceitável é uma função de frequência de origem (f) e raio(a_src), bem como a distância entre a fonte e a varredura de campo(z_rcv). Um critério geral para a seleção do tamanho do hidrofone é: , levando a: , onde c é a velocidade sonora⁷².
   3. Certifique-se de que o hidrofone esteja calibrado nas condições utilizadas na caracterização do sistema, incluindo a temperatura especificada na seção 1.6. Especificamente, se o hidrofone é mantido em um ângulo em relação ao plano de varredura, o hidrofone deve ser calibrado nesse ângulo, pois os efeitos de frantividade podem diferir significativamente daqueles esperados com base puramente na geometria. A mudança na sensibilidade hidrofone em relação à temperatura deve estar disponível pelo fabricante.
   4. Escaneie toda a região em que as células podem ser expostas. Para capturar um nível adequado de detalhes de campo, use um espaçamento de varredura não mais grosseiro do que 1/5^de um comprimento de onda na maior frequência de interesse. Se for observada uma complexidade de campo inesperada, considere o uso de sinais de explosão curto (por exemplo, ciclos 1-3) para permitir a identificação e quantificação de contribuições diretas e de campo dispersas.
7. Incorpore um recurso de monitoramento de cavitação.
   1. Determine o tipo de transdutor de monitoramento e a colocação como parte do projeto do sistema geral, e não como um retrofit. Na prática, isso leva a um sistema que é extremamente compacto sem sacrificar a capacidade de alinhar de forma confiável os componentes críticos do sistema.
   2. Coloque um dispositivo de monitoramento de cavitação no sistema de forma que ele possa ser repetidamente posicionado com tempo mínimo de configuração adicional ou perturbação ao fluxo de trabalho. No SAT2, isso é realizado com um transdutor piezoelétrico de um único elemento atuando como um PCD instalado na tampa da câmara, enquanto o SAT3 integra o PCD na base de origem usando um refletor de 90°.
   3. Selecione a forma PCD de acordo com os objetivos dos experimentos. Na Figura 2,os cálculos dos contornos de meia amplitude de dispositivos desfocados (esquerda) e focados (direita) mostram as profundas diferenças na sensibilidade espacial em relação à frequência. O dispositivo desfocado é mais adequado para monitoramento de grandes volumes com variação espacial modesta em relação à frequência, enquanto o dispositivo focado é mais adequado para medições mais compactas radialmente nas frequências de interesse.
   4. Selecione a frequência central pcd e largura de banda para atender às necessidades do experimento. A frequência central é tipicamente escolhida para ser pelo menos cinco vezes maior que a da fonte dos EUA, a fim de minimizar a sensibilidade às emissões diretas de fontes. A largura de banda é normalmente maximizada para observar uma ampla gama de comportamentos de bolhas (ruído harmônico e de banda larga).
   5. Selecione métodos de condicionamento, gravação e processamento para permitir a análise dos dados de cavitação, conforme descrito na próxima seção.

2. Instrumentação e Processamento para Monitoramento de Cavitação

NOTA: Esta seção apresenta os componentes e funções de fluxo de sinal recomendados para coleta de dados de monitoramento de cavitação e o processamento de dados que leva a avaliações qualitativas e quantitativas da atividade de cavitação.

1. Instrumentação (Ver também Figura 3).
   1. A menos que o aplicativo exorcizar um dispositivo personalizado, selecione um PCD da ampla gama de transdutores de elemento único disponíveis comercialmente, normalmente comercializados para testes não destrutivos de alvos submersos. Esses fornecedores também possuem cabeamento e acessórios (por exemplo, o refletor de espelho em SAT3).
   2. Minimize a resposta do PCD à fonte dos EUA. Isso pode ser feito tanto através da seleção do PCD (frequência central e largura de banda) quanto usando um entalhe ou filtro de passagem alta. Este último é implementável tanto como um módulo autônomo ou como parte de um dispositivo de condicionamento de sinal.
   3. Use um digitalizador com uma grande faixa dinâmica (pelo menos 12 bits) para capturar o máximo de dados possível com a mínima probabilidade de corte de sinal alto e relação de sinal máximo para ruído (SNR) dos menores sinais. Ao comparar dispositivos, revise as especificações do sinal para ruído e distorção e/ou número efetivo de bits, pois estas são descrições mais completas do alcance dinâmico alcançável. Considere também se o tamanho do buffer de memória é suficiente para o comprimento e taxa de captura de dados desejados.
   4. Otimize o uso do alcance dinâmico do digitalizador. Os sinais PCD podem cobrir várias ordens de magnitude, tanto por causa de uma longa exposição (como bolhas são eliminadas) e se executando experimentos em diferentes níveis de unidade dos EUA. Portanto, é necessário verificar se a cadeia de condicionamento de sinal dimensiona todos os sinais para que possam ser devidamente registrados.
   5. Inclua um preamplificador na cadeia de sinal, para que os menores sinais esperados possam ser adequadamente capturados. Em nossa experiência, o auto-ruído PCD está bem abaixo do da maioria dos digitalizadores, então um grau modesto de preamplificação (por exemplo, <100x) ainda pode melhorar o SNR do resultado final.
   6. Filtre a frequência de origem dos EUA antes da pré-amplificação para evitar saturar o amplificador.
   7. Se um pulser/receptor dos EUA for usado para fornecer recursos de ganho e/ou filtragem, use-o no modo pulser para confirmar o comprimento/alinhamento do caminho ou verificar se há dispersores inesperados no caminho de propagação entre o PCD e o compartimento de exposição celular.
   8. Habilite o fluxo de dados em tempo real para o armazenamento. Os sistemas SAT2 e SAT3 empregam osciloscópios USB de 12 bits (ver Tabela de Materiais),que têm as conveniências de portabilidade e interfaces de usuário bem construídas.
   9. Confirme a correspondência adequada de impedância na cadeia de sinal para evitar erros de ganho ou largura de banda. Os dispositivos PCD normalmente têm impedâncias de saída perto de 50 ohms, então um processo adequado é substituir o PCD por um sinal conhecido de um gerador de forma de onda (com impedância de saída de 50 ohm) e confirmar que o tamanho do sinal que aparece no digitador corresponde às expectativas, escala linearmente quando o sinal injetado é alterado, e nenhum recorte é observado para o maior sinal de interesse.
2. Pré-processamento
   1. Corrija os sinais de tensão bruta para todos os ganhos e sensibilidades conhecidos no caminho do sinal que se relacionam com o processamento de dados na faixa de frequência de interesse.
   2. Se os dados foram registrados com acoplamento de entrada DC ou de outra forma mostrar um deslocamento DC, remova este deslocamento por subtração direta ou com um filtro de passagem alta.
3. Calcule o espectro de energia P de cada sinal gravado.
   1. Defina o comprimento de transformação Fourier N_ft de modo que a frequência fundamental da fonte norte-americana f₀ seja um grande inteiro múltiplo da largura da lixeira de transformação: N_ft =   nf_s/f₀, onde n é um inteiro e f_s é a frequência amostra dos dados digitalizados. Definir n ≥ 50 para captura clara de recursos espectrais. Para o exemplo de um fundamental de 1 MHz amostrado a 50 MHz, N_ft é de 2500 e a largura da lixeira é de 0,02 MHz.
   2. Como o comprimento de transformação N_ft é geralmente menor do que a duração do sinal registrado, use um estimador de densidade espectral de potência(PSD),como o método de Welch⁷³. Potência em uma faixa de frequência que abrange f₁-f₂ é, onde dF é a largura da lixeira de transformação.
   3. Para caracterizar a atividade bolha durante cada exposição, estime as contribuições para o espectro de energia de múltiplos inteiros de f₀ (harmônicos), múltiplos inteiros inteiros ímpares de f_0/2(ultraharmônicos) e ruído de banda larga (cavitação inercial).
   4. O conteúdo harmônico e ultraharmônico é mais simplesmente estimado selecionando os valores do espectro de energia em frequências específicas. No entanto, grandes respostas tonais de amplitude podem se espalhar em um pequeno número de caixas de frequência adjacentes (por exemplo, f0 ± 2-3), de modo que estes devem ser incluídos nos cálculos de energia de banda estreita e excluídos dos cálculos de banda larga.
   5. Estimar o poder de cavitação da banda de banda larga por subtração das contribuições harmônicas e ultraharmônicas do espectro de energia total. Alternativamente, essas contribuições podem ser estimadas utilizando-se um pré-processamento mais sofisticado⁷⁴.
   6. Estime a energia acumulada do sinal de cavitação ao longo da duração da exposição, de preferência de acordo com o tipo de atividade de característica de espectro/bolha.
   7. Supondo que todos os registros de dados tivessem duração igual T_r,a energia cumulativa nos dados registrados é, onde M indica o número de registros.
   8. Se houver lacunas entre as gravações, como pode acontecer quando a exposição é contínua, e os arquivos salvos capturam uma fração da duração total da exposição T_e, a energia cumulativa pode ser estimada como
   9. Estime a medição SNR em comparação dos níveis de espectro com os de ruído de fundo registrados na ausência dos EUA.

3. Protocolo Experimental

1. Preparação do SAT
   1. Minimize a probabilidade de cavitação no caminho de propagação, desgaseando o líquido de enchimento (água tipicamente filtrada) sob uma pressão de -10⁵ Pa por pelo menos duas horas. Recomenda-se a confirmação com uma sonda de oxigênio dissolvida de que a pressão parcial do oxigênio está abaixo de 10 kPa.
   2. Encha lentamente a câmara de teste para minimizar a reintrodução do ar no líquido desgaseado. Continue desgaseando a câmara cheia, se necessário.
   3. Limpe todas as bolhas residuais das superfícies do transdutor e do recipiente de mídia imediatamente após o enchimento e novamente pouco antes de iniciar experimentos de exposição.
   4. Certifique-se de que a temperatura da câmara e seu conteúdo se estabilizaram antes de iniciar os experimentos de exposição.
   5. Permita que o amplificador de energia de origem dos EUA aqueça (por recomendação do fabricante) para que o ganho e a saída sejam estáveis em relação ao tempo.
2. Preparação do compartimento de exposição
   1. Suspensão do agente de cavitação
      1. Ao diluir o agente de cavitação, mexa suave e continuamente para fazer uma suspensão uniforme sem prender macrobolhas ou destruir o agente (especialmente se forem bolhas descascadas).
      2. Ao trabalhar com MBs, retire e dispense lentamente usando a maior agulha de bitola disponível para minimizar a destruição durante o processo de carregamento⁷⁵. Uma agulha de enchimento sem corte de 18 G tem sido usada regularmente com os sistemas SAT.
3. Preparação sat2
   1. Esterilize a tampa PDMS antes de ser usada em experimentos com células vivas.
   2. Forme o compartimento de exposição celular pressionando a tampa PDMS ao prato de cultura.
   3. Prepare uma seringa com uma agulha cega de 18 G e encha com aproximadamente 10 mL de líquido (por exemplo, suspensão MB ou controle de água).
   4. Insira a agulha através de um dos orifícios de preenchimento do PDMS e encha lentamente a câmara, inclinando-se para que as macrobolhas possam escapar pelo orifício de preenchimento aberto. Para obter melhores resultados, incline a câmara para que o orifício aberto esteja acima do orifício de enchimento.
   5. Quando preenchido, feche o orifício aberto inserindo uma haste de polímero curta (4-5 mm). Coloque o conjunto para que ambos os orifícios sejam horizontais.
   6. Remova a agulha de enchimento sem corte enquanto injeta fluido extra para que o ar não seja atraído. Feche o orifício com outra haste de polímero. Este processo completa a vedação do compartimento de exposição celular.
   7. Verifique visualmente o compartimento em busca de evidências de macrobolhas aprisionadas e, se houver, repita 3.3.3.-3.3.6.
   8. Pressione colocar o compartimento de exposição celular no porta-compartimento. Instale a tampa da câmara no lugar em cima da câmara. Baixar a tampa com um ângulo para horizontal desencoraja macrobolhas de descansar sobre as partes submersas (absorvente, suporte).
   9. Considere a flutuação das partículas em suspensão ao decidir a orientação do compartimento de exposição celular (por exemplo, bolhas flutuantes ou nanopartículas afundando) e como isso afetará seu contato com as células.
   10. Em todas as operações, use o mínimo de força possível para minimizar a flexão da superfície de crescimento celular e o descolamento das células.
4. Preparação sat3
   1. Encha o Transwell com aproximadamente 150 μL de líquido (por exemplo, suspensão MB ou controle de água).
   2. Forme o compartimento de exposição celular selando cuidadosamente o transwell com um plugue de borracha, removendo qualquer líquido de transbordamento com uma toalha de papel limpa ou limpe. Antes de usar em experimentos com células vivas, esterilize o plugue de borracha.
   3. Verifique visualmente o compartimento em busca de evidências de macrobolhas aprisionadas e, se algum for encontrado, remova o plugue, remova as macrobolhas e repita 4.4.2.
   4. Pressione colocar o compartimento de exposição celular no porta-compartimento. Instale a tampa da câmara no lugar em cima da câmara. Baixar a tampa com um ângulo para horizontal desencoraja macrobolhas de descansar sobre as partes submersas (absorvente, suporte).
      NOTA: Como observado acima, macrobubbles podem causar uma variedade de efeitos não repetitivos e potencialmente prejudiciais em experimentos de exposição dos EUA. Mais criticamente, macrobolhas presas no compartimento de exposição celular podem causar respostas pcd e biofeitos celulares locais que não são representativos do tratamento pretendido. Inspecione sempre visualmente todos os componentes do sistema para encontrar e remover macrobolhas antes de iniciar experimentos nos EUA.

4. Coleta de dados

1. Estabeleça níveis de resposta pcd de fundo realizando experimentos iniciais com um compartimento de exposição celular preenchido com líquido de controle (por exemplo, água desgaseada ou mídia celular).
2. Grave dados PCD sem levar a fonte dos EUA a estabelecer níveis de ruído eletrônicos em segundo plano.
3. Registo os dados do PCD enquanto conduz a fonte dos EUA na gama completa de níveis de unidade planejados. Esses dados indicarão quais partes da resposta acústica não estão relacionadas com os agentes de cavitação a serem testadas posteriormente.
   NOTA: Líquidos de laboratório comuns (por exemplo, PBS ou mídia celular) apresentarão cavitação a pressões moderadas (por exemplo, 0,5 MPa a 0,5 MHz) se não forem desgaseados.
4. Antes de iniciar as medições, dê tempo para que a suspensão se equilibre termicamente com a temperatura da câmara. Um termopar de agulha fina pode ser útil para este fim.
5. Monitore os experimentos em tempo real nos domínios de tempo e frequência.
   1. O monitoramento do domínio de tempo do PCD revela se os sinais são dimensionados adequadamente para as configurações de instrumentação atuais. Especificamente, o recorte de sinal deve ser evitado, uma vez que aparecerá no domínio de frequência como resposta harmônica de vários tons.
   2. O monitoramento do domínio de tempo do PCD também mostra se os sinais de cavitação são vistos antes do esperado com base no tempo de propagação da fonte dos EUA para o compartimento de exposição ao PCD. Se tais sinais forem vistos, isso pode indicar vazamento de agente de cavitação na câmara de teste.
   3. O monitoramento de domínio de frequência do PCD indica o tipo de comportamento da bolha e pode ser usado para ajustar os níveis de acionamento conforme necessário para alcançar o estímulo celular desejado (por exemplo, níveis de acionamento mais baixos para excitação harmônica).
6. Para garantir que as primeiras exposições não sejam perdidas, inicie o processo de coleta de dados antes de ligar o sinal de unidade de origem dos EUA.
7. Monitore o sinal de saída do amplificador que impulsiona a fonte dos EUA (em oposição à saída do gerador de forma de onda) durante todo o experimento para garantir que a exposição esteja acontecendo como esperado. Use uma sonda de alta tensão para esta medição e certifique-se de que o osciloscópio está definido para compensar a atenuação da sonda.
8. Depois de expor uma amostra, remova-a cuidadosamente da câmara de teste.
   1. Remova e limpe a tampa PDMS (SAT2)/plugue de borracha (SAT3) em preparação para qualquer uso subsequente.
   2. Transfira o prato de cultura (SAT2)/Transwell (SAT3) conforme necessário para análise subsequente (por exemplo, microscopia, imagem de fluorescência).
   3. Após um pequeno número de exposições (por exemplo, 3-5), é uma boa prática reaprpor sinais de cavitação de linha de base (na ausência de agente de cavitação) e comparar com o conjunto de dados original para garantir que a mídia da câmara não tenha sido contaminada.

Resultados

A Figura 4 mostra exemplos de respostas pcD de domínio de tempo e frequência, ilustrando três comportamentos distintos de cavitação. Todos os dados foram coletados no SAT3 utilizando MBs SonoVue diluídos 5x na PBS, com uma concentração final de ~2*10⁷ MBs/ml. A temperatura para todos os exemplos nesta seção foi de 19 ± 1 °C. A fonte norte-americana foi conduzida com um pulso de 2,0 ms a 0,5 MHz para atingir o pico de rajadas de pressão negativa de 0,20(Figura 4A e 4B),0,30(Figura 4C e 4D),e 0,70 MPa(Figura 4E e 4F). As gravações de sinal começaram 1,4 ms antes do t = 0 início do pulso dos EUA. Os traços de entrada mostram o sinal como gravado (vermelho) e com um filtro de passagem de 2 MHz (azul) para uma janela de tempo centrada no momento do voo de fonte para compartimento de exposição celular para PCD. A resposta de baixo nível antes deste tempo deve-se à radiação recebida diretamente da fonte, o que é comum em configurações onde o PCD está por trás da fonte dos EUA.

Na menor pressão incidente, a resposta do PCD consiste inteiramente de harmônicos inteiros da frequência fundamental dos EUA de 0,5 MHz. O aumento de 0,20 para 0,30 MPa resulta em ultraarmônicas pronunciadas no espectro, além de harmônicos inteiros ainda mais elevados. As formas de onda de domínio de tempo nessas duas pressões são semelhantes, embora os resultados de 0,30 MPa mostrem mais variabilidade durante a duração do pulso. Na maior pressão, a amplitude de forma de onda do domínio do tempo cresceu quase perto das pressões mais baixas como resultado de ruído de banda larga claramente elevado visível no espectro. Esse ruído é comumente considerado como resultado de cavitação inercial e, neste exemplo, corresponde à destruição de MBs.

Para ver isso com mais clareza, as respostas do PCD em função do tempo são mostradas na Figura 5. No painel esquerdo(Figura 5A),os espectros completos são mostrados ao longo de um tempo de exposição de 50 segundos, durante o qual a fonte emitiu pulsos de 2,0 ms a cada 0,20 segundos. Os poderes totais, harmônicos e de banda larga correspondentes são mostrados no painel direito(Figura 5B). Os EUA foram ligados em t =3.0 s, momento em que foram vistas respostas de banda larga de grande amplitude. Acredita-se que o pico inicial corresponda à destruição das maiores bolhas na suspensão (SonoVue é polidisperse) e é uma observação comum em experimentos de cavitação com bolhas descascadas e até mesmo com mídia não desgaseada (por exemplo, PBS).

Após alguns segundos, a resposta da banda larga diminuiu rapidamente, aparentemente devido à destruição da bolha, e o sinal é predominantemente composto de harmônicos. Isso sugere que o gás liberado e os MBs restantes estão vibrando de forma estável e não inertimente. Na década de 50, o componente de banda larga caiu para o nível do ruído de fundo original. Testes de exposição como este são, portanto, importantes ao tentar entender as escalas de tempo durante as quais diferentes efeitos de bolha podem estar agindo sobre as células na câmara.

É provável que as bolhas se traduzam em resposta às forças de radiação geradas durante a exposição e o movimento dos MBs nos EUA dentro e fora do campo de visão PCD pode levar a uma maior variabilidade no sinal de cavitação monitorado, especialmente quando se lida com suspensões diluídas. A região sensível do PCD deve, portanto, abranger o máximo possível da superfície de exposição celular. Uma comparação das respostas focadas e pcds desfocados com frequências centrais idênticas (ver Figura 2) é mostrada na Figura 6, usando uma diluição de 20:1 de MBs em PBS normal é SAT2. O espectro de tempo e média de amostra no painel Figura 6A mostra que o PCD desfocado contém uma resposta de banda larga mais forte, acompanhada de variabilidade amostral-amostra reduzida tanto em poderes harmônicos(Figura 6B) quanto ultraharmônicos(Figura 6C).

É importante reconhecer que as mídias usadas para trabalhos in vitro não são desgaseadas e podem apresentar um nível de fundo aprimorado de atividade bolha. A Figura 7 mostra a resposta no SAT2 da PBS usada em sua forma fornecida pelo fornecedor e após duas horas de desgaseamento sob vácuo, após a qual a saturação do ar foi reduzida de 92% para 46% conforme determinado com um sensor óptico (PreSens, Alemanha). Os espectros na Figura 7A foram mediados ao longo do tempo de exposição e repetições com cinco amostras independentes, e mostram claramente ultraharmônicas claramente elevadas na PBS normal. Os poderes somados ao longo de três harmônicos (Figura 7B) estão bem dentro do desvio padrão de cada saída experimental. Em contraste, as somas ultraharmônicas na Figura 7C mostram que o PBS normal tem quase uma ordem de magnitude de maior nível e variabilidade substancialmente maior entre as amostras. Esses exemplos indicam que um meio comum compatível com células pode apresentar comportamentos que podem ser (incorretamente) atribuídos à presença de MBs. Uma vez que geralmente é impraticável para o meio de cultura desgas devido ao impacto negativo sobre as células e/ou estabilidade do agente de cavitação, é fundamental realizar controles adequados em qualquer estudo relacionado à cavitação.

Figura 1: Ilustrações de dois projetos do sistema de exposição dos EUA incorporando o monitoramento da cavitação: SAT3 (D-F). (A) Montagem anotada SAT2 com parede lateral removida para clareza. (B) SAT2 com parede lateral intacta. (C) Compartimento de exposição celular SAT2, desmontado. (D) Montagem anotada SAT3. (E) SAT3 em configurações normais (esquerda) e lentes (direita) para correspondência de largura do feixe em diferentes frequências. (F) Compartimento de exposição celular SAT3, desmontado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Cálculos de contornos de campo de pressão de meia amplitude para transdutores de campo de 12,7 mm de diâmetro desfocados (esquerda) e esfericamente focados (direita). Frequências de 2, 4 e 8 MHz são mostradas como contornos vermelhos, azuis e verdes, respectivamente, para um elemento PCD na origem coordenada (0,0). Os contornos mais externos do dispositivo desfocado são relativamente insensíveis à frequência, mas a estrutura interna é dependente da frequência. Os contratos de campo esferoticamente focados à medida que a frequência aumenta, mas dentro dos contornos, os campos variam suavemente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Instrumentação para condicionamento e gravação de sinal de cavitação (setas azuis), excitação de origem dos EUA (linhas vermelhas) e acionamento de aquisição de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Respostas de PCD de domínio (esquerda) e frequência (direita) registradas com MBs diluídos 5x no PBS. As pressões negativas de pico incidente foram (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, todas em 0,5 MHz. As gravações de sinal começam em 1,4 ms antes do início do t=0 do pulso de ultrassom de duração de 2,0 ms. (A, C, E) Os sinais de domínio de tempo (vermelho) são mostrados em uma escala vertical fixa, indicando como o nível de resposta muda com a pressão do incidente. Os traços de entrada mostram o sinal como gravado (vermelho) e com um filtro de passagem de 2 MHz (azul) para uma janela de tempo centrada no momento do voo de fonte para compartimento de exposição celular para PCD. (B, D, F) As densidades espectrais de ruído e potência do sinal são calculadas para t<0 e t>0, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Históricos de espectro sobre uma exposição de 50 segundos de uma suspensão de MBs diluídos 5x em PBS. (A) Espectro completo e (B) total, harmônico e poderes de sinal de banda larga, tudo em função do tempo. As condições de acionamento foram de 0,5 MHz, 0,7 MPa de pressão negativa máxima, duração de pulso de 2,0 ms, período de repetição de pulso de 200 ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Efeito da geometria focalizante do PCD registrada com diluição de 20:1 de microbolhas em PBS normal. As condições de acionamento foram: 1,0 MHz, 0,50 MPa de pressão negativa máxima, duração de pulso de 3,0 ms, período de repetição de pulso de 10 ms. (A) Espectro completo mediado ao longo do tempo de exposição e três repetições de amostra independente. (B) Potência em harmônicos de 3, 4 e 5 MHz, e(C) potência em ultraharmônicas de 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Linhas grossas são meios amostrais, áreas sombreadas indicam +/- 1 desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Efeito da mídia desgaseada gravada com PBS. (A) Espectro completo mediado ao longo do tempo de exposição e cinco repetições de amostra independente. (B) Potência em harmônicos de 3, 4 e 5 MHz, e(C) potência em ultraharmônicas de 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Linhas grossas são meios amostrais, áreas sombreadas indicam +/- 1 desvio padrão. As condições de acionamento foram de 1,0 MHz, 0,50 MPa de pressão negativa máxima, duração de pulso de 1,0 ms, período de repetição de pulso de 200 ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

parâmetro	unidade	mínimo	máximo
frequência	Mhz	0.02	15
pressão (pico negativo)	Mpa	0.1	20
comprimento de pulso	Ciclos	1	Cw
ciclo de dever	%	1	Cw
tempo de exposição	s	10	1000

Tabela 1: Resumo da gama de parâmetros relatados facilitando a sonoporação in vitro.

Discussão

Os passos críticos para qualquer medição acústica foram encapsulados pela Apfel em 1981⁷⁶ como "conheça seu líquido, conheça seu campo sonoro, saiba quando algo acontece". No contexto deste protocolo, estes englobam a calibração e alinhamento do transdutor e as etapas de preparação e manuseio de bolhas. Em primeiro lugar, é essencial que o hidrofone usado para calibrar o transdutor de condução e/ou o PCD seja calibrado com precisão através de manutenção externa regular ou comparação interna com um padrão de referência. Da mesma forma, a resposta tanto do transdutor de condução quanto do PCD precisa ser regularmente caracterizada para verificar se há qualquer alteração na saída e/ou perda de sensibilidade. Se as condições de condução e receber sensibilidade do sistema são desconhecidas, então será impossível inferir qualquer relação significativa entre condições de exposição, bioefeitos e emissões acústicas. Diretamente relacionados a isso, o alinhamento dos transdutores entre si e a câmara amostral precisa ser cuidadosamente verificado para garantir que as condições de exposição dentro da câmara sejam como esperado e que o volume amostral para o PCD corresponda à região de interesse. Como indicado, o teor de temperatura e gás do meio suspenso pode afetar significativamente os resultados finais e a consistência é extremamente importante neste sentido^77,78. Da mesma forma, a preparação, caracterização e manuseio da suspensão do agente de cavitação requerem muita atenção para garantir que a distribuição e concentração de tamanho esperados das partículas esteja presente dentro da amostra. Por exemplo, se a concentração de bolhas for muito alta, haverá uma proteção eficaz do volume amostral do campo dos EUA incidente. Os agentes mb são particularmente suscetíveis à destruição e à coalescência e mais orientações sobre seu manuseio podem ser encontradas em Mulvana et. al. (2012)⁷⁹.

Um problema muito comum com a detecção de sinais de cavitação é alcançar um SNR adequado. Isso se deve, em parte, à natureza do sinal em si, como descrito, mas também pode ser devido a fontes de ruído elétrico dentro da configuração experimental. Verificar as conexões entre os componentes do sistema, em particular aqueles que envolvem cabos coaxiais, pode ajudar a eliminar alguns deles. Pode ser necessário substituir ou reparar cabos coaxiais. Identificar e remover ou desativar outros equipamentos em laboratório, como bombas que podem causar ruídos elétricos, também pode ajudar. A má impedância elétrica entre os componentes do sistema pode ser uma outra causa de má relação sinal/ruído e também potencialmente de danos ao equipamento e deve ser cuidadosamente verificada. As configurações de acionamento do gerador de sinal e do osciloscópio devem ser verificadas da mesma forma para confirmar se estão configuradas adequadamente para o experimento e não reverteram para as configurações padrão do fabricante. Se houver destruição significativa de bolhas durante o manuseio, no caso do SAT2, pode ser útil anexar uma segunda seringa à porta de saída e usá-la para extrair suavemente o fluido da câmara, desenhando assim a suspensão. Isso também pode ajudar na eliminação de macrobolhas ou na habilitação do fluxo durante a exposição dos EUA, se desejar.

Não é possível eliminar completamente os reflexos acústicos dentro da câmara de amostra e, portanto, o campo de incidentes não será completamente uniforme sobre todo o volume amostral. Como mencionado nas etapas 1.3.2 e 1.3.3, a transmissibilidade das janelas acústicas será dependente da frequência e, portanto, deve ser cuidadosamente considerada a largura de banda desejada para medições de emissão acústica. Em particular, pode haver reflexos múltiplos significativos de componentes de maior frequência. Esta é outra razão pela qual a calibração do campo dentro do sistema totalmente montado é tão importante para minimizar a incerteza na pressão incidente. O exemplo adequado dos sinais registrados também deve ser considerado para minimizar os efeitos de múltiplas reflexões. O uso de dispositivos comerciais para conveniência e a necessidade de transparência acústica significa que alguma transparência óptica deve ser sacrificada. Isso pode afetar a qualidade da imagem subsequente, por exemplo, para avaliar a viabilidade celular ou a absorção de drogas. Algumas das membranas utilizadas em dispositivos comerciais também são porosas e, portanto, ocorre um isolamento imperfeito entre a câmara de amostra e o banho de água circundante. Como acima, o risco correspondente de contaminação pode ser mitigado usando uma subdálida menor, cujo conteúdo pode ser regularmente substituído. Os dispositivos de cultura celular indicados na Tabela de Materiais são adequados principalmente para monocamadas celulares que podem não ser representativas de tecidos em termos de todos os biofeitos mediados pelos EUA/cavitação. A proximidade das células com uma superfície sólida também afetará a dinâmica do MB de uma forma que pode não refletir as condições in vivo, por exemplo, promovendo microstreaming e microjetagem, como descrito na introdução. Essas limitações podem ser abordadas, no entanto, através de uma simples substituição de modelos de tecidos alternativos.

O objetivo de propor os SATs é fornecer um meio de melhorar a reprodutibilidade das condições de exposição acústica e as emissões acústicas entre estudos de biofeitos mediados pelos EUA, facilitando assim uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de técnicas de monitoramento de tratamento para melhorar a segurança e a eficácia. Os sistemas são projetados para serem compatíveis com dispositivos de cultura celular disponíveis comercialmente, permitindo que uma ampla gama de ensaios biológicos sejam realizados de acordo com a aplicação de interesse e permitindo o desempenho de experimentos de alto rendimento, removendo a necessidade de procedimentos de alinhamento demorados entre as corridas. Ao padronizar protocolos para a caracterização das condições de exposição e a captura de emissões acústicas, a variabilidade dependente do sistema pode ser reduzida. A gama de parâmetros que devem ser explorados para um determinado experimento dependerá da aplicação (bio-efeito desejado, tipo celular, profundidade do tecido alvo se in vivo etc.) e da natureza de qualquer agente de cavitação sendo utilizado. Dado o grande número de variáveis (frequência dos EUA, amplitude de pressão, comprimento do pulso, frequência de repetição de pulso etc.) explorar completamente todo o espaço do parâmetro é improvável que seja viável. Uma vantagem do protocolo proposto é que permite que alguns limites neste espaço de parâmetro sejam rapidamente estabelecidos. Por exemplo, permite a determinação da pressão mínima na qual um sinal de cavitação é gerado, a pressão máxima ou o comprimento do pulso que pode ser usado antes do descolamento/morte celular ocorrer, e a pressão na qual harmônicos fracionados ou ruído de banda larga são produzidos. Recomenda-se que tal conjunto de medições de escopo sejam realizadas como um primeiro passo em qualquer estudo.

Como apresentado, os SATs são projetados para monitoramento em tempo real das emissões acústicas, com ensaios biológicos sendo realizados fora do experimento. Seria relativamente simples, no entanto, modificar o SAT para permitir a observação óptica direta da câmara amostral através de um objetivo de microscópio. Isso poderia, por sua vez, ser acoplado a um sistema de fluorescência e/ou microscopia de alta velocidade para permitir a observação da absorção de drogas e dinâmica de bolhas, por exemplo. A saída de PCD apresentada atualmente em termos de tensão indica: i) os tipos de comportamento de cavitação e suas proporções relativas; ii) quanto tempo esses comportamentos de cavitação persistem; iii) se as características de exposição tempo-cumulativa observadas estão correlacionadas a um determinado efeito bioeffeito; e iv) se os níveis relativos e comportamentos dependentes do tempo são consistentes com experimentos anteriores no sistema de exposição. Embora a sensibilidade de recebimento do PCD possa ser quantificada, a fim de caracterizar de forma confiável as emissões acústicas em termos de energia absoluta, são necessárias informações espaciais adicionais. Isso poderia ser conseguido substituindo o PCD por um teste de matriz para implementar o mapeamento acústico passivo (PAM)⁸⁰. Isso aumentaria, no entanto, a complexidade do processamento de sinais e o tempo e o poder computacionais necessários.

Outras instrumentações para medição da resistência elétrica da membrana ou aplicação de métodos de segmentação física, por exemplo, campos magnéticos, também poderiam ser incorporadas. Também seria possível usar estruturas de tecidos tridimensionais, como esferoides tumorais, organoides ou mesmo amostras de tecido ex vivo em substratos de gel acústico "macios" no lugar das monocamadas celulares para estudar os efeitos mediados pelos EUA e pela cavitação em ambientes teciduais mais realistas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorber	Precision Acoustics	APTFlex F28 panel	1.0 cm standard thickness
Amplifier (power)	E&I Ltd.	1040L	400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre)	Stanford Research Systems	SR445A	Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater	Aquael	Ultra 50W	Different models for different tank sizes.
Digitizer	TiePie Engineering	HS5-110-XM	Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone	Precision Acoustics	FOH	0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles	Bracco	SonoVue	FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3)	Olympus NDT	F-102	90 degree beam reflection
PCD transducer	Olympus NDT	V320-SU	Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable	Olympus NDT	BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid)	Corning	Sylgard 184	See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal)	Zeus	PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal)	VWR	391-2101	6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator	Agilent	33250	Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2	Ibidi	µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3	Corning	Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3)	Sonic Concepts	H107 with central hole	Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage