キャビテーション強化療法の研究

要約

提示された実験プロトコルは、薬物送達および/または他の生物効果の成功に必要な条件の調査を可能にすることを目的として、細胞培養装置におけるキャビテーション活性のリアルタイム測定を行うために使用することができる。

要約

超音波の治療用途への関心は有意で、成長しており、癌からアルツハイマー病に至るまでの潜在的な臨床標的である。キャビテーション - 超音波分野内の気泡の形成とその後の動き - これらの治療の多くを支える重要な現象を表しています。しかし、キャビテーションが治療効果を促進する詳細な作用機序に関しては、かなりの不確実性が残っており、臨床的に実施できる信頼性の高いモニタリング技術を開発する必要がある。特に、治療効果の正常な伝達とそれに対応する音響放出として報告される暴露パラメータの研究との間には有意な変動がある。本稿の目的は、キャビテーション媒介生物効果の研究を行うための広く利用可能なコンポーネントを用いた設計ガイドラインと実験プロトコルを提供すること、およびリアルタイムの音響モニタリングを含む。このプロトコルは、治療的超音波実験への音響モニタリングのより広範な組み込みを可能にし、暴露条件の研究とその関連するバイオ効果との相関関係をまたいで容易に比較することを可能にすることが期待される。

概要

超音波(US)は、その安全で非侵襲的な性質、患者のベッドサイドでの実装の容易さ、およびその費用対効果¹のために、画像診断技術として広く使用されている。その診断および監視機能の次に、米国は治療の適用のためのかなりの潜在性を持っている。初期の研究は、血栓溶解、DNAトランスフェクション、および薬物送達^2、3、4および治療米国におけるその使用を探求し、現在、腫瘍治療^5、6、7、免疫療法^8、9、血液脳関門(BBB)破壊10、11、12、血栓溶解^{13、14、15、}および細菌^{感染治療を}含むアプリケーションで、研究の非常に活発な領域を表しています。これらの用途を支える重要な現象は、流体圧^18,19の変化による気体腔の核形成、成長^、振動である。

キャビテーションが生物学的効果を生み出すメカニズムはさまざまです。例えば、適用された米国のフィールドの影響下でのバブル振動の非常に非線形な性質は、両方の薬物対流²⁰を増強し、気泡の近くの組織にせん断応力を及ぼすことができる周囲の液体にマイクロストリーミングを生成することができます。これは、気泡が境界の近くにあり、泡が球状でない振動を引き起こし、せん断誘発性透過性^{21、22、23、24}を介して薬物取り込みを促進する可能性がある場合に特に流行している。より高い圧力では、大きな振幅振動および急速な気泡崩壊が観察され、直接的な機械的応力²⁵を与え、頻繁に衝撃波を発生させ、結果的に組織^26,27を破壊し、浸透させる可能性のある大きな圧力勾配を与える。表面近くの気泡の崩壊はまた、高速液体マイクロジェット^28、29、30の形成をもたらすことができます。これらのマイクロジェットは、組織に浸透し、毛穴を作り出したり、二次応力波^31,32を誘導したりする可能性がある。組織および細胞レベルの両方における生体膜の透過化は、様々にソノフォレスと呼ばれ、主に皮膚透過性^33、34、およびソノポレーションにおける米国誘発増強の文脈で使用され、主に膜孔^35、36の形成に伴う細胞膜の可逆的透過性を記述するために使用^される。

発振気泡を取り囲む液体の粘性吸収は、実質的な加熱効果³⁷を生み出すことができる。さらに、非線形振動が高い場合、米国の走行分野よりも高い周波数で音響放射を生成します。これは、周囲の組織の吸収を増加させ、さらに加熱^38.気泡崩壊はまた、過渡的な高温や気泡コアの圧力に起因する化学的効果を伴い得る、例えば高反応性種および電磁放射の発生、ソノルミネッセンス³²として知られている。これらの効果は^、送達のための潜在的な損傷および/または関連する細胞経路の活性化を評価するために調査され、ソノダイナミック療法40、41、42、43として知られているアプローチで光感受性薬物の局所活性化において利用された。

米国が媒介する多くの生物効果は、米国のフィールドパラメータ(圧力振幅、周波数、パルス長および繰り返し周波数、および暴露の持続時間)の制御によってのみ開始される可能性がありますが、生体組織でキャビテーションを確実に発生させるには高い入力エネルギーが必要な場合が多いため、損傷のリスクが高くなります。外因性または人工キャビテーション核の導入は、上記で議論された幅広い効果を生み出すために必要な入力エネルギーを大幅に削減し、さらに米国だけでは不可能な追加の効果を導入する可能性がある。キャビテーション核は、気泡^26、44、液体液滴^45、46、47および固体粒子48、49、50を含み^、ナノスケールキャビテーション核は、長期の循環時間、改善された外挿および長期キャビテーション活性^{49、51、52、53}の点でそれらの利点の調査の出現領域である。

最も一般的に使用される核は、もともと画像診断において造影剤として使用されたガスマイクロバブル(MB)である。それらは典型的には直径1〜2マイクロメートルであり、周囲の媒体の水溶性が低い高分子量ガスの中心を含んでいる。コアは、保護脂質、タンパク質、または最も一般的にリン脂質⁵⁴からなるポリマーシェルに囲まれている。米国のフィールドに曝露すると、MBの圧縮性が原因で体積振動が起き、その結果、造影剤としてのRBの成功を担う強力な音響散乱が生じてしまう。前述のように、これらの振動はまた、治療用途で利用することができる前述の機械的、熱的、および化学的効果につながります。MBコーティングプロセスはまた、MB構造内で薬物をカプセル化し、薬物を取り付けたり、種を標的とする場合に、MB表面に薬を取り付けるメカニズムを提供します。この技術は、全身毒性⁵⁵を低減する薬剤の誘発放出を促進する。また、最近では、MB表面からの物質が生物学的構造に移され、いわゆる「ソノプリンティング^{」56、57、58}を介して薬物送達を増強することが示されている。

米国が媒介するキャビテーション活性のモニタリングは、インビトロおよびインビボの両方で生じる生物学的効果に関する洞察を提供し、潜在的にこれらの効果の調整および最適化を可能にする。キャビテーション活性を監視するための2つの最も広く適用される方法は、i)光、超高速ビデオ顕微鏡を使用し、一般的にvivoで実現不可能である; とii)音響、振動および/または崩壊気泡によって生成された再放射音場を記録する。音響信号の振幅と周波数の両方の成分には、気泡の挙動に関する情報が含まれています。低入射米国の振幅での気泡の低濃度は、主に高調波放射(駆動周波数の整数倍⁾⁵⁹を生成することが示されている。駆動圧力が増加するにつれて、気泡放出スペクトルは、より強い非線形挙動を示すサブハーモニクスおよび超高調波⁶⁰ と呼ばれる分数成分、および慣性キャビテーションを示すブロードバンドノイズを含むことがある。整数高調波は、バブル振動の主要な指標ですが、非線形伝播などにより、実験システムのどこでも非線形性によって引き起こされる可能性があります。対照的に、分数高調波とブロードバンドノイズは、バブルダイナミクスと非常に強く相関しています。

気泡挙動と検出された音響放出との関係は、米国の入射分野、核生成環境、および検出経路⁶⁰の特性を含む要因によって複雑になり得る。しかし、気泡の挙動や細胞との相互作用に関する重要な情報は、音響スペクトルの周波数とエネルギーの傾向を見極めることによって得ることができます。これらのデータは、臨床治療のモニタリング技術の基礎となる貴重な情報を提供することもできます。この情報を十分に活用するには、堅牢で翻訳可能で再現可能な実験手法の開発が必要です。

現在、システムを設計し、キャビテーション支援療法の開発を支援するための研究を行うための報告されたプロトコルに大きなばらつきがあります。装置の面では、様々な設計アプローチが行われている。いくつかのグループは、並列プレートチャンバー^{56、61、62、63}のいずれかを使用して、カスタム構築または市販(例えば、オプティセル、サーモフィッシャーサイエンティフィック)。Hu et al. (2013) は、米国の超音波処理モジュールとリアルタイム共焦点イメージング⁶⁴、Carugo らと結合したセルチャンバーを開発した。 (2015)は、米国露光⁶⁵中に水浴中に水没を可能にするカスタムメイドのPDMS蓋を備えた市販の細胞培養皿を含むシステムを使用し、ペレノら(2018)は、ダイナミクスバブルと気泡細胞相互作用の同時光学的および音響特性を可能にする層状のアキソ流体共振器からなる装置を使用した^66。カスタムで製作されたアプリケーション固有の設計を使用すると、米国のフィールドやその他の環境暴露条件の特徴付けが複雑になり、クロススタディの比較が困難になります。例えば、0.02~15MHzの中心周波数、1%から連続波までのデューティサイクル、0.1~20 MPa^{23、64、67、68、69、70(}表1)を含む、ソノポレーションを成功させるために同定された米国パラメータにはかなりのばらつきがあります。スペクトル成分(高調波、副高調波など)にも同様にかなりの変動があり、特定の生物効果に関連していると同定されています。

したがって、この研究の目的は、キャビテーションモニタリング機能の特異的包含を伴うキャビテーション誘導細胞生物効果のインビトロ研究のための容易に再現可能なシステム設計および実施フレームワークを提供することである。

プロトコル

1. システム設計原則

注: このセクションでは、米国の露出およびキャビテーション監視用のシステムを作成するために使用される設計原則を示します。これらの原則は、音響トランスフェクション(SAT)用の既存の2つのシステム( 図1を参照)で示されています。各システムは、セル露出コンパートメント、米国のソース、および受動キャビテーション検出器(PCD)として機能する単一の要素トランスデューサで構成され、そのすべてがベンチトップ試験室に統合されています。これらの設計は、Carugoら(2015)⁶⁵に記載されている以前のシステム開発に基づいて構築されます。

1. 使いやすさを最大限に引き出します。
   1. 既存の市販の細胞培養デバイスを播種/増殖基材として使用することにより、既存の培養技術やイメージングシステムと相性の高い細胞暴露コンパートメントを作ります。
      1. SAT2の場合は、培養皿(直径35mm、直径21mmの面積が観察可能)を使用して、 材料表を参照してください。
      2. SAT3 の場合は、トランスウェル挿入物を使用します(直径 6.5 mm、 表を参照)。トランスウェルズは透過性膜を有するため、水ではなく細胞培地に入れなければなりません。
2. セル露出コンパートメントの迅速なローディングとシールを可能にします。
   1. 培養皿の上に柔軟なポリマー蓋を取り付けてSAT2細胞露光コンパートメントを形成する(Carugo et al. 2015^65)。図1Cに見られるように、蓋には直径1.2mmの穴があり、コンパートメントに18Gの鈍い針の注射器を充填することができます。充填後、これらの充填ポートを短いプラスチック棒(材料表)で密封してください。
   2. SAT3コンパートメントをシリンジまたはピペットで充填し、ゴム栓/バンを押し付け、シールします。
   3. 試験室への密閉された細胞露出のコンパートメントの急速なローディングを可能にする。セル露出コンパートメント用のホルダーは、適切な位置合わせを確保するために軽いプレスフィットで十分であるチャンバーの蓋に組み込まれました。 図 1に示すシステムでは、複数のセルエクスポージャーコンパートメントが事前に用意されている場合、サンプルの変更時間は 20 秒ほど短くなります。
   4. システムがポータブルであり、必要な水/媒体の量を最小限に抑えることができるように、チャンバー内部の容積を最小限に抑えます。そうすることで、細胞暴露コンパートメントからの偶発的な流出やキャビテーション剤の漏出からの回復も加速します。
      注: SAT2 内部ボリュームは約 0.8 L です。SAT3の内部容積はおよそ7.6 Lである– 容易なローディングおよびソーストランスデューサーまたはその構成の変更に対応するために大きくなった。0.3 Lの内部チャンバーを加えて、使い捨て体積を最小限に抑え、タンク充填水(例えば細胞培養媒体)以外の生物学的に関連する液体を使用できるようにした。内部の部屋の底は最大の音響伝達を可能にするために30のμm厚いマイラーシートからなされる。
   5. 可能な場合は、チャンバーと内部コンポーネントを光学的に透明な材料から取り出し、問題(例えば、漏れ、閉じ込められたマクロバブル)を迅速に観察し、改善することができるようにします。
3. 露出コンパートメントの音響透過性を最大化します。
   1. コンパートメントの壁材と厚みの選択によって透過性を最大化します。壁の両側の液体が本質的に同じであるという仮定(例えば、水)の下で、通常の入射圧力伝達係数⁷¹ の大きさは次のとおりです。
      ここで、λは厚さL、z _Lおよび_zoの壁の波長であり、それぞれ壁材と液体の特性インピーダンス(密度と音速の積)である。T = 1 は、完全な伝送を示します。
   2. キャビテーションの広域スペクトルモニタリング(例えば、1〜8MHz)では、ほとんどの実験用ポリマー(例えば、PDMS、PTFE、ポリスチレン)は、材料の厚さが材料の波長の1/10分の1^より 小さい場合、10%以下で透過圧力を変えます。この条件は、高周波数(例えば、8 MHzで#1.5カバースリップ)で標準的な電源を満たすことが困難な場合があるため、伝送周波数応答を予測または直接較正することをお勧めします。
   3. 米国のソース信号をセル露光コンパートメントに狭帯域伝送する場合、層材料内の半波長の倍数の整数である場合は、より厚い層を可能にする。例えば、SAT2のPDMS蓋は、厚さ2.0mm(1MHzでは〜2波長、cPDMS~1000 m/s)で使用される。
4. ソースとセル環境の選択により、露出領域を最大化します。
   1. 露出した細胞の数を最大化するには、利用可能な培養およびイメージング装置との互換性を維持しながら、細胞の取り付け面積を可能な限り広くします。
   2. 大きな焦点を合わせるソース(SAT2)の事前焦点領域またはセルアタッチメント領域の直径に一致する主葉幅を持つ焦点またはレンズソースを使用して、空間変動を最小限に抑えてセル接続領域にまたがるフィールドを持つ米国ソースを使用します(SAT3)。特定のソースについては、 材料表 を参照してください。
   3. 入射フィールドの最も強い部分から離れた場所でセルコンパートメントを機械的に支え、ホルダーの散乱断面を最小限に抑えたり、ホルダーに吸収材料を配置したりすることで、セルコンパートメントホルダによってもたらされるフィールドの複雑さを最小限に抑えます。例は図 1A および 図 1Dに示されています。
5. 繰り返し露光条件を確認します。
   1. 部分的に満たされたチャンバ内の空気と水の界面から生じる変動性を排除するために、固定境界内の音響場を終了します。SAT2および3では、これは、境界反射から生じる可能性のあるフィールドの複雑さを軽減するというさらなる利点を持つチャンバー蓋に音響吸収器( 材料表を参照)を設置することによって達成される。
   2. 小さな変動や大きな誤動作を素早く検出できるように、アンプ出力/ソース入力でソース駆動電圧を監視および記録します。目的の駆動電圧範囲を超えて安全に使用できる電圧プローブまたはその他のデバイスを使用します。波形発生器などの既知のソースを用いて、電圧プローブのキャリブレーションを定期的にチェックします。
   3. チャンバの温度とその内容を制御、監視、および記録します。細胞、トランスデューサ、および伝搬媒体の応答は、すべて温度感受性であり得る。SAT2では、監視と制御は、水の調整システムに接続された循環ポートのペアで達成され、SAT3は、(図示せず)、水族館ヒーターを採用しています。必要に応じて水温を設定して、治療用途に関連する生理学的条件を模倣します。
      注: 内部温度は、外部要因の結果として、およびトランスデューサおよび媒体の米国で生成された加熱の結果として変化する可能性があります。
   4. チャンバー液体を慎重に脱気して、伝搬経路内の既存の気泡から意図しないキャビテーションや散乱の可能性を最小限に抑えます。
      注:脱ガスが行われなかった場合、例えば細胞への悪影響のために、適切なバブル活動の背景レベルが高くなります。
6. 完全に組み立てられたシステムを調整します。
   1. 細胞露出コンパートメントを含め、すべてのシステムコンポーネントが所定の位置にあるときに、露出した細胞に入射する圧力場を測定する手段を含む。SAT2および3では、これは測定される分野を妨げることなく針または光ファイバーハイドロフォンを挿入することができるチャンバー蓋の開口部で達成される。セルが配置されている場所にできるだけ近い値を測定します。
   2. 敏感な半径_(rcv)が測定される圧力フィールドを誤って報告しないほど小さいハイドロフォンを選択してください。許容サイズは、ソース周波数(f)と半径_(src)の関数と、ソースとフィールドスキャンの間の距離(z_rcv)です。ハイドロフォンサイズ選択の一般的な基準は: に導きます: cは音速⁷²です。
   3. セクション 1.6 で指定された温度を含め、システム特性評価に使用される条件の下でハイドロフォンが較正されていることを確認します。具体的には、ハイドロフォンがスキャン面に対して角度で保持されている場合、ダイレクト性効果は純粋に幾何学に基づいて予想されるものと大きく異なる可能性があるため、ハイドロフォンはその角度で較正されなければならない。温度に関するハイドロフォン感度の変化は、メーカーから入手可能である必要があります。
   4. セルが露出する領域全体をスキャンします。適切なレベルのフィールドディテールをキャプチャするには、対象となる最高周波数の波長の 1/5^分 の 1 よりも粗いスキャン間隔を使用します。予期しないフィールドの複雑さが観察される場合は、短いバースト信号(例えば、1~3サイクル)を使用して、直接的なフィールド寄与と散乱フィールド寄与の特定と定量化を可能にすることを検討してください。
7. キャビテーション監視機能を組み込みます。
   1. システム全体の設計の一部として、システム全体の設計の一部として監視トランスデューサのタイプと配置を決定します。実際には、重要なシステムコンポーネントを確実に整列する能力を犠牲にすることなく、最大限にコンパクトなシステムを実現します。
   2. キャビテーション監視装置をシステムに配置し、最小限の段取り時間やワークフローの妨害を繰り返し配置できます。SAT2では、これはチャンバリッドに取り付けられたPCDとして機能する単一の要素圧電トランスデューサで達成され、SAT3は90°反射器を使用してPCDをソースベースに統合します。
   3. 実験の目的に応じてPCD形状を選択します。 図2では、非焦点(左)デバイスと焦点を合わせられていない(右)デバイスの半振幅輪郭の計算は、周波数に関する空間感度の大きな違いを示しています。焦点を合わせられていないデバイスは、周波数に関しては適度な空間変動を伴う大音量監視に適していますが、焦点を合わせたデバイスは、対象周波数でより放射状にコンパクトな測定に適しています。
   4. 実験のニーズに合わせて、PCDの中心周波数と帯域幅を選択します。中心周波数は、通常、直接のソース放出に対する感度を最小限に抑えるために、米国のソースの少なくとも5倍に選択されます。帯域幅は、一般に、広範囲のバブル動作(高調波およびブロードバンドノイズ)を観察するために最大化されます。
   5. 次のセクションで説明するように、キャビテーション データの分析を可能にするコンディショニング、記録、および処理方法を選択します。

2. キャビテーションモニタリングのための計測と処理

注: このセクションでは、キャビテーション監視データの収集に推奨される信号フローコンポーネントと機能、およびキャビテーションアクティビティの定性的および定量的評価につながるデータ処理について説明します。

1. インストルメンテーション ( 図 3も参照してください)。
   1. アプリケーションがカスタマイズされたデバイスを必要としない限り、市販の単一要素トランスデューサの広い範囲からPCDを選択し、通常、水没したターゲットの非破壊試験のために販売される。これらのサプライヤーには、ケーブル配線とアクセサリ(例えば、SAT3のミラーリフレクター)もあります。
   2. 米国のソースに対する PCD 応答を最小限に抑えます。これは、PCD(中心周波数と帯域幅)の選択とノッチまたはハイパスフィルタの使用の両方で行うことができます。後者は、スタンドアロン モジュールとして、または信号調節デバイスの一部として実装できます。
   3. 大きなダイナミックレンジ(少なくとも12ビット)のデジタイザを使用して、最小信号の高い信号クリッピングと最大信号対雑音比(SNR)の可能性を最小限に抑えて、できるだけ多くのデータをキャプチャします。デバイスを比較する場合、信号とノイズの仕様、ノイズの歪み、および/または有効なビット数を確認します。また、メモリ バッファのサイズが、データ キャプチャの目的の長さと速度に十分かどうかを検討します。
   4. デジタイザーのダイナミックレンジの使用を最適化します。PCD信号は、(気泡が除去される)長時間の露出と、様々な米国のドライブレベルで実験を実行している場合の両方のために、いくつかの桁をカバーすることができます。したがって、シグナルコンディショニングチェーンがすべての信号を適切に記録できるようにスケーリングすることを確認する必要があります。
   5. 信号チェーンにプリアンプを含めるため、予想される最小の信号を適切にキャプチャできます。私たちの経験では、PCD自己ノイズはほとんどのデジタイザーのそれより大きく低いので、適度な予水率(例えば、<100x)は、最終的な結果のSNRを改善することができます。
   6. 増幅器を飽和させないために、事前増幅の前に米国のソース周波数をフィルタリングします。
   7. 米国のパルサー/レシーバを使用してゲインおよび/またはフィルタリング機能を提供する場合は、パルサーモードでパスの長さ/位置合わせを確認するか、PCDとセルエクスポージャーコンパートメント間の伝搬経路で予期しない散乱を確認します。
   8. ストレージへのデータのリアルタイムストリーミングを有効にします。SAT2 と SAT3 の両方のシステムは、移植性と適切に構築されたユーザー インターフェイスの利便性を持つ 12 ビット ストリーミング USB オシロ スコープ ( 資料表を参照) を採用しています。
   9. ゲインまたは帯域幅のエラーを避けるために、信号チェーン内の適切なインピーダンスマッチングを確認します。PCDデバイスは通常、50オーム付近の出力インピーダンスを持つため、PCDを波形発生器からの既知の信号(50オーム出力インピーダンス)に置き換え、デジタイザに表示される信号サイズが期待に一致することを確認し、注入された信号が変更されたときに直線的にスケーリングし、関心のある最大の信号に対してクリッピングが観察されない。
2. 前処理
   1. 対象の周波数範囲でのデータの処理に関連する信号経路内のすべての既知のゲインと感度の生電圧信号を修正します。
   2. データが DC 入力カップリングで記録されたか、DC オフセットを示している場合は、直接減算または高パス フィルターを使用してこのオフセットを削除します。
3. 各記録信号のパワースペクトル P を計算します。
   1. 米国のソースf₀の基本周波数が変換ビン幅の大きな整数倍になるようにフーリエ変換長N_ftを設定します: N_ft =   nf_s/f_0、nは整数、f_sはデジタル化されたデータのサンプル周波数です。 スペクトルフィーチャを明確にキャプチャするためにn ≥ 50 を設定します。50 MHz でサンプリングされた 1 MHz の基本サンプルの例では、N_ftは 2500、ビン幅は 0.02 MHz です。
   2. 変換長の_Nftは通常、記録された信号の持続時間よりも小さいので、ウェルチの方法⁷³のようなパワースペクトル密度(PSD)推定器を使用する。周波数帯の f₁-f₂をスパンする電力は 、dFは変換ビン幅です。
   3. 各露出の間に気泡活動を特徴付けるには 、f₀₍高調波)の整数倍 、f_0/2(超高調波)の奇数倍数、および広帯域ノイズ(慣性キャビテーション)から電力スペクトルへの寄与を推定する。
   4. 高調波および超高調波含有量は、特定の周波数でのパワースペクトル値を選択することで、最も単純に推定されます。しかし、大きな振幅の音色応答は、隣接する少数の周波数ビン(例えば、f0 ± 2-3)に広がる可能性があるため、これらは狭帯域電力計算に含まれ、広帯域計算から除外されるべきである。
   5. 全電力スペクトルからの高調波および超調和寄与の減算により広帯域バンドキャビテーション電力を推定する。あるいは、これらの寄与度は、より高度な前処理⁷⁴を用いて推定することができる。
   6. 曝露の持続時間にわたる累積キャビテーション信号エネルギーを推定し、好ましくはスペクトル特徴/気泡活性タイプに従う。
   7. すべてのデータ レコードの継続時間が等しいと仮定すると、記録されたデータの累積エネルギーは 、 Mはレコード数を示します。
   8. 露出が連続している場合に発生する可能性があり、保存されたファイルが総露出時間 T_eの一部をキャプチャする場合、記録間にギャップがある場合、累積エネルギーは次のように推定されます。
   9. 米国の不在時に記録されたバックグラウンドノイズのスペクトルレベルとを比較して、測定SNRを推定します。

3. 実験プロトコル

1. サット準備
   1. 充填液(通常はろ過水)を-10⁵ Paの圧力下で少なくとも2時間脱気することにより、伝搬経路におけるキャビテーションの可能性を最小限に抑える。酸素の分圧が10kPa以下であることを溶存酸素プローブで確認することが推奨されます。
   2. 試験室をゆっくりと充填して、脱気液への空気の再導入を最小限に抑えます。必要に応じて、充填されたチャンバーの脱気を続けます。
   3. 充填直後と露光実験を開始する直前に、トランスデューサとメディア容器表面からすべての残留気泡をクリアします。
   4. 暴露実験を開始する前に、チャンバーの温度とその内容物が安定していることを確認してください。
   5. 米国の電源パワーアンプが(メーカーの推奨ごとに)ウォームアップして、ゲインと出力が時間に対して安定するようにします。
2. 露出コンパートメントの準備
   1. キャビテーション剤懸濁液
      1. キャビテーション剤を希釈する場合、マクロバブルを包み込んだり、薬剤を破壊したりすることなく、穏やかにかつ継続的に攪拌して均一な懸濁液を作ります(特に殻付き気泡の場合)。
      2. MB を使用する場合は、読み込みプロセス⁷⁵の間に破壊を最小限に抑えるために利用可能な最大のゲージ針を使用してゆっくりと撤退し、分配します。18 G鈍充満針はSATシステムと定期的に使用されている。
3. SAT2 準備
   1. 生細胞の実験で使用する前にPDMSのふたを殺菌する。
   2. PDMS蓋を培養皿に合わせてプレスにより細胞露光コンパートメントを形成する。
   3. 18Gの鈍い針で注射器を準備し、液体の約10 mL(例えば、MB懸濁液または水制御)で満たします。
   4. PDMSの穴の1つを通して針を挿入し、ゆっくりとチャンバーを満たし、マクロバブルが開いた穴を通って逃げることができるように傾けます。最良の結果を得るには、開いた穴が充填孔の上になるようにチャンバーを傾けます。
   5. 充填したら、短い(4-5 mm)ポリマーロッドを挿入して開いた穴を閉じます。両方の穴が水平になるようにアセンブリを設定します。
   6. 空気が引き込まれないように余分な液体を注入しながら鈍い充填針を取り除きます。別のポリマーロッドで穴を閉じます。このプロセスは細胞露出のコンパートメントのシールを完了する。
   7. 囲み込みマクロバブルの証拠をコンパートメントで視覚的に確認し、見つかった場合は 3.3.3.-3.3.6 を繰り返します。
   8. コンパートメントホルダーのセル露出コンパートメントを押します。チャンバーの蓋をチャンバーの上に設置します。水平に角度で蓋を下げると、マクロバブルが水没した部分(吸収体、ホルダー)に置かないようにします。
   9. 細胞暴露コンパートメント(例えば、浮遊気泡または沈むナノ粒子)の向きを決定する際の懸濁液中の粒子の浮力と、これが細胞との接触にどのように影響するかを考慮してください。
   10. すべての操作において、細胞の成長表面および剥離の屈曲を最小にするためにできるだけ少ない力を使用する。
4. SAT3 準備
   1. トランスウェルに約150 μLの液体(例えば、MBの懸濁液または水の制御)を充填します。
   2. 慎重にゴム製プラグでトランスウェルを密封し、きれいなペーパータオルまたはワイプでオーバーフロー液体を除去することによって、セル露出コンパートメントを形成します。生きた細胞の実験で使用する前に、ゴム栓を殺菌する。
   3. 囲まれているマクロバブルの証拠をコンパートメントを視覚的に確認し、もし見つかった場合は、プラグを取り外し、マクロバブルを取り外し、4.4.2を繰り返します。
   4. コンパートメントホルダーのセル露出コンパートメントを押します。チャンバーの蓋をチャンバーの上に設置します。水平に角度で蓋を下げると、マクロバブルが水没した部分(吸収体、ホルダー)に置かないようにします。
      注: 前述のように、マクロバブルは米国の暴露実験に対して、再現不可能な、潜在的に有害な影響を引き起こす可能性があります。最も重要なのは、細胞暴露コンパートメントに閉じ込められたマクロバブルが、意図した治療の代表ではないPCD応答および局所細胞の生物効果を引き起こす可能性がある。米国の実験を開始する前に、すべてのシステムコンポーネントを常に目視で調べて、マクロバブルを見つけて除去してください。

4. データ収集

1. 制御液(例えば、脱気水または細胞媒体)で満たされた細胞暴露コンパートメントで初期実験を行うことによって、バックグラウンドPCD応答レベルを確立する。
2. バックグラウンドの電子ノイズレベルを確立するために、米国のソースを駆動せずにPCDデータを記録します。
3. 計画されたドライブレベルの全範囲で米国のソースを駆動しながらPCDデータを記録します。このデータは、音響応答のどの部分が、その後テストされるキャビテーション剤と無関係であるかを示します。
   注: 一般的な実験室の液体(例えば、PBSまたは細胞媒体)は、脱気しない場合、適度な圧力(例えば0.5 MHzで0.5 MPa)でキャビテーションを示します。
4. 測定を開始する前に、懸濁液がチャンバー温度と熱的に平衡化する時間を与える。細かい針熱電対は、この目的のために有用である可能性があります。
5. 時間領域と周波数領域の両方でリアルタイムで実験を監視します。
   1. PCDのタイムドメインモニタリングは、信号が現在の計測設定に適しているかどうかを明らかにします。具体的には、信号クリッピングは、周波数領域に多音調和応答として現れるため、避けるべきである。
   2. PCDの時間領域モニタリングはまた、米国のソースからPCDへの暴露区画への伝搬時間に基づいてキャビテーション信号が予想よりも早く見られるかどうかを示す。そのような信号が見られる場合、これは試験室へのキャビテーション剤の漏れを示し得る。
   3. PCDの周波数領域モニタリングは、気泡の挙動の種類を示し、所望の細胞刺激を達成するために必要に応じて駆動レベルを調整するために使用することができる(例えば、高調波励起のための低い駆動レベル)。
6. 最初の露出が見逃されないようにするには、米国のソースドライブ信号をオンにする前にデータ収集プロセスを開始します。
7. 実験全体を通して(波形発生器出力とは対照的に)米国のソースを駆動するアンプ出力信号を監視し、露光が期待どおりに進行していることを確認します。この測定には高電圧プローブを使用し、プローブの減衰を補正するようにオシロスコープが設定されていることを確認します。
8. サンプルを露出させた後、慎重に試験室から取り出します。
   1. PDMSの蓋(SAT2)/ゴムプラグ(SAT3)を取り外し、その後の使用に備えて清掃します。
   2. 培養皿(SAT2)/トランスウェル(SAT3)を、その後の分析(例えば、顕微鏡、蛍光イメージング)のために必要に応じて移します。
   3. 少量の暴露(例えば、3-5)の後、ベースラインキャビテーション信号を再取得し(キャビテーション剤が存在しない場合)、元のデータセットと比較して、チャンバーメディアが汚染されていないかどうかを確認することをお勧めします。

結果

図4は、時間および周波数領域のPCD応答の例を示し、3つの異なるキャビテーション挙動を示す。すべてのデータは、ソノヴューMBを使用してSAT3上で収集され、PBSで5倍希釈され、最終的な濃度は〜2*10⁷ MB/mlであった。このセクションのすべての例の温度は19±1 °Cでした。 米国のソースは、0.20(図4Aおよび4B)、0.30(図4Cおよび4D)、0.70MPa(図4Eおよび4F)のインシデントピーク負圧を達成するために0.5 MHzで2.0 msのパルスで駆動された。 信号記録は、米国パルスのt = 0開始の前に1.4 msを開始しました。差し込みトレースは、信号が記録された信号(赤)と、2 MHz ハイパス フィルタ(青)を備え、ソースからセルエクスポータメントから PCD への飛行時間を中心としたタイム ウィンドウを示します。この時間以前の低レベル応答は、PCDが米国のソースの背後にある構成で一般的であるソースから直接放射線を受け取ったことによるものです。

最も低い入射圧力では、PCD応答は0.5 MHzの基本的な米国周波数の整数高調波から完全に構成されています。0.20から0.30 MPaに増加すると、さらに高い整数高調波に加えて、スペクトルの顕著な超高調波をもたらします。この2つの圧力におけるタイムドメイン波形は似ていますが、0.30 MPaの結果はパルス持続時間に対してより多くの変動性を示しています。最高圧力では、スペクトルに明らかに上昇した広帯域ノイズの結果として、時間領域波形振幅は低い圧力に対して非線形に成長しています。このノイズは慣性キャビテーションの結果であると考えられ、この例では、MBの破壊に対応しています。

これをより明確に見るために、PCD応答を時間の関数として 図5に示します。左側のパネル (図 5A)では、50 秒間の露光時間に完全なスペクトルが表示され、その間、ソースは 0.20 秒ごとに 2.0 ms パルスを出力します。対応する合計、高調波、およびブロードバンドのパワーは、右側のパネルに示されています(図5B)。米国はt =3.0 sでオンにされ、その時点で大振幅ブロードバンド応答が見られました。初期スパイクは、懸濁液中の最大気泡の破壊に対応すると考えられている(SonoVueは多分散)、殻付き気泡を用いたキャビテーション実験や非脱気媒体(例えば、PBS)でのキャビテーション実験で一般的な観察である。

数秒後、ブロードバンド応答は急速に減少し、明らかにバブル破壊のために、信号は主に高調波で構成されています。これは、解放されたガスおよび残りのMBが安定して非慣性に振動していることを示唆している。t〜50sでは、ブロードバンドコンポーネントは元のバックグラウンドノイズのレベルに落ちています。したがって、このような暴露テストは、異なる気泡効果がチャンバー内の細胞に作用する可能性のあるタイムスケールを理解しようとする際に重要です。

気泡は、米国の暴露中に発生する放射線力に応じて変換され、PCD分野の中およびPCD分野外でのMBの移動は、特に希薄懸濁液を扱う場合、監視されたキャビテーション信号の変動性の増加につながる可能性があります。したがって、PCD の敏感な領域は、できるだけ多くの細胞露出面に及ぶ必要があります。同じ中心周波数を持つ焦点を合わせた非焦点のPCDと非焦点のPCDの比較(図2を参照)は、通常のPBSでの20:1のMB希釈を用いたSAT2です。パネル図6Aの時間およびサンプル平均スペクトルは、非焦点PCDが高調波(図6B)と超調和力の両方におけるサンプル対サンプル変動性の低下を伴う、より強い広帯域応答を含み、かつ超調和力を有することを示している(図6C)。

インビトロ細胞の働きに使用される培地は脱ガスされず、気泡活性の背景レベルが高まる可能性があることを認識することが重要である。 図7 は、サプライヤー提供の形態で使用されるPBSのSAT2の応答を示し、真空下で2時間の脱気後、その後、空気飽和度は光学センサーで決定された92%から46%に減少した(ドイツのPreSens)。 図7A のスペクトルは、5つの独立したサンプルで露光時間と反復で平均化され、通常のPBSで明らかに高い超高調波を示す。3つの高調波(図7B)を合計したパワーは、各実験出力の標準偏差の範囲内にあります。対照的に、 図7C の超調和的な合計は、通常のPBSがサンプル間でほぼ桁違いに高いレベルと実質的に高い変動性を有することを示している。これらの例は、一般的なセル互換メディアが、MB の存在に起因する (誤った) 動作を示すことを示しています。細胞および/またはキャビテーション剤の安定性に悪影響を及ぼすため、培養培地を脱ガスすることは通常実用的でないため、キャビテーション関連の研究において適切な制御を行うことが重要です。

図1:キャビテーションモニタリングを組み込んだ2つの米国露光システム設計の図:SAT3(D-F)。(A) わかりやすくするためにサイドウォールを取り外した SAT2 のアノート付きアセンブリ。(B)サイドウォールをそのまま使用した SAT2。(C)SAT2細胞露光コンパートメント、分解。(D) SAT3 アセンティット アセンブリ。(E)SAT3 を通常(左)とレンズ(右)構成で、異なる周波数でビーム幅をマッチングします。(F)SAT3細胞露光コンパートメント、分解。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:直径12.7mmの非焦点(左)および球状に焦点を合わせる(右)トランスデューサの半振幅圧力フィールド輪郭の計算。座標原点(0,0)のPCD要素に対して、2、4、8MHzの周波数はそれぞれ赤、青、緑の輪郭として表示されます。焦点を合っていないデバイスの最も外側の輪郭は周波数に対して比較的無神経ですが、内部構造は周波数に依存します。球状に焦点を合わせるフィールドは周波数が増加するにつれて収縮しますが、輪郭の内側ではフィールドがスムーズに変化します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:キャビテーション信号調節および記録(青い矢印)、米国のソース励起(赤線)、およびデータ取得トリガのための計装。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:時間(左)と周波数(右)ドメインPCD応答は、PBSで5倍希釈されたMBで記録された。入射ピーク陰圧は(A, B) 0.2 MPa, (C, D) 0.4 MPa, (E, F) 0.7 MPa, すべて 0.5 MHz で. 信号記録は 2.0 ms 持続時間超音波パルスの t=0 開始前に 1.4 ms 開始した。(A、C、E)時間領域信号(赤)は、応答レベルがインシデント圧力でどのように変化するかを示す固定の垂直スケールで示されます。差し込みトレースは、信号が記録された信号(赤)と、2 MHz ハイパス フィルタ(青)を備え、ソースからセルエクスポータメントから PCD への飛行時間を中心としたタイム ウィンドウを示します。(B、D、F)ノイズと信号の出力スペクトル密度は、それぞれ t<0 と t>0 について計算されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:PBSで5倍希釈されたMBの懸濁液の50秒間の暴露に対するスペクトル履歴。(A)完全なスペクトルと(B)合計、高調波およびブロードバンド信号のパワー、すべて時間の関数として。駆動条件は0.5MHz、0.7 MPaピーク陰圧、2.0 msパルス持続時間、200 msパルス繰り返し期間であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:PCDの焦点を合わせる幾何学の効果は、通常のPBSにおけるマイクロバブルの20:1希釈で記録された。駆動条件は、1.0 MHz、0.50 MPaピーク陰圧、3.0 msパルス持続時間、10msパルス繰り返し期間であった。(A)完全スペクトルは、暴露時間と3つの独立したサンプル反復にわたって平均化。(B)3、4、5 MHz高調波の電力、および2.5、3.5、4.5MHzの超高調波での(C)電力。太い線はサンプル平均で、シェーディングされた領域は+/- 1標準偏差を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:PBSで記録された脱気媒体の効果(A)完全スペクトルは、暴露時間と5つの独立したサンプル反復にわたって平均化。(B)3、4、5 MHz高調波の電力、および2.5、3.5、4.5MHzの超高調波での(C)電力。太い線はサンプル平均で、シェーディングされた領域は+/- 1標準偏差を示します。駆動条件は1.0 MHz、0.50 MPaピーク陰圧、1.0 msパルス持続時間、200 msパルス繰り返し期間であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

パラメーター	単位	最低限	最大
周波数	メガヘルツ	0.02	15
圧力(ピーク陰性)	MPa	0.1	20
パルス長さ	サイクル	1	右回り
デューティサイクル	%	1	右回り
露光時間	s	10	1000

表1: 報告されたパラメータの範囲の概要 vitro でのソノポレーションを促進する .

ディスカッション

音響測定の重要なステップは、1981⁷⁶年にApfelによって「あなたの液体を知り、音場を知り、何かが起こったときを知る」としてカプセル化されました。このプロトコルのコンテキストでは、これらはトランスデューサのキャリブレーションとアライメントと水の準備と気泡処理のステップを包含する。まず、駆動トランスデューサおよび/またはPCDを較正するために使用されるハイドロフォンは、それ自体が通常の外部サービスまたは参照規格との社内比較を通じて正確に較正することが不可欠です。同様に、駆動トランスデューサとPCDの両方の応答は、出力の変化および/または感度の損失をチェックするために定期的に特徴付けられる必要があります。駆動条件とシステムの受け取り感度が不明な場合、暴露条件、生体効果および音響放出の間の意味のある関係を推測することは不可能です。これに直接関連して、トランスデューサ同士とサンプルチャンバの位置合わせを慎重にチェックして、チャンバー内の露光条件が期待通りであり、PCDのサンプリング量が対象領域に対応していることを確認する必要があります。示されるように、懸濁媒体の温度およびガス含有量は、最終的な結果に大きく影響し、この点で一貫性が極めて重要である^77,78。同様に、キャビテーション剤懸濁液の調製、特性評価、および取り扱いは、期待されるサイズ分布および粒子の濃度がサンプル内に存在することを確実にするために非常に細心の注意を必要とする。例えば、気泡の濃度が高すぎる場合、インシデントUSフィールドからのサンプル体積の効果的なシールドが発生します。MB剤は、特に破壊および合体の影響を受けやすく、その取り扱いに関するさらなるガイダンスは、Mulvana etで見つけることができます。al. (2012)⁷⁹.

キャビテーション信号の検出に関する非常に一般的な問題は、適切なSNRを達成することです。これは、説明したように、信号自体の性質の一部によるものですが、実験セットアップ内の電気的ノイズの発生源によるものでもあります。システムコンポーネント間の接続、特に同軸ケーブルを含む接続を確認すると、これらの一部を排除するのに役立ちます。同軸ケーブルの交換または修理が必要な場合があります。電気的な騒音を引き起こす可能性のあるポンプなど、実験室内の他の機器を特定および除去または非アクティブ化することも助けになります。システムコンポーネント間の電気インピーダンスの一致性が悪いと、信号対ノイズ比が低下し、機器の損傷の可能性がある場合にも、慎重にチェックする必要があります。信号発生器とオシロスコープのトリガー設定も同様にチェックして、実験に適した構成で、製造元のデフォルト設定に戻していないことを確認する必要があります。取扱い時に気泡が著しく破壊される場合、SAT2の場合には、第2の注射器を出口口に取り付け、これを使用してチャンバーから静かに流体を抽出し、懸濁液中に引き出すのが有用である。また、これは、必要に応じて、マクロバブルを排除したり、米国の露出中に流れを可能にするのに役立ちます。

サンプルチャンバー内の音響反射を完全に排除することはできないため、入射フィールドはサンプルボリューム全体にわたって完全に均一ではありません。ステップ1.3.2および1.3.3で述べたように、音響窓の透過性は周波数に依存するため、音響放射測定に必要な帯域幅を慎重に考慮する必要があります。特に、高周波成分の多重反射が大きく存在する可能性がある。これは、完全に組み立てられたシステム内のフィールドのキャリブレーションが、入射圧力の不確実性を最小限に抑えるために非常に重要であるもう一つの理由です。また、記録された信号の適切な格数は、複数の反射の影響を最小限に抑えるために考慮されるべきである。利便性と音響透過性の必要性のために商用機器を使用することは、光透過性を犠牲にしなければならないことを意味します。これは、細胞の生存率または薬物取り込みの評価を行う、その後のイメージングの品質に影響を与える可能性がある。市販装置に用いられる膜の一部は多孔質であり、したがって、試料室と周囲の水浴との間に不完全な分離が起こる。上記のように、対応する汚染のリスクは、より小さなサブチャンバを使用することによって軽減することができ、その内容物は定期的に交換することができる。 材料表 に示されている細胞培養装置は、主に、米国/キャビテーション媒介生物効果の観点から組織を代表しない細胞単層に適しています。固体表面への細胞の近接性は、生体内の条件を反映しない可能性のある方法でMBダイナミクスに影響を及ぼすもの、例えば、導入で説明したようにマイクロストリーミングおよびマイクロジェットを促進する。しかし、これらの制限は、代替組織モデルの単純な置換によって対処することができる。

SAを提案する目的は、米国が媒介する生物効果の研究の間で音響暴露条件と音響放出の再現性を向上させる手段を提供し、その基盤となるメカニズムのより良い理解と安全性と有効性を向上させるための治療モニタリング技術の開発を促進することを期待する。このシステムは、市販の細胞培養デバイスと互換性があるように設計されており、目的のアプリケーションに従って幅広い生物学的アッセイを実行し、高スループット実験のパフォーマンスを可能にし、実行間の時間のかかるアライメント手順の必要性を排除します。露光条件の特性評価と音響放出のキャプチャのためのプロトコルを標準化することにより、システム依存の変動性を減らすことができればと思います。特定の実験のために検討すべきパラメータの範囲は、用途(所望のバイオ効果、細胞タイプ、インビボの場合は標的組織の深さ)および使用されているキャビテーション剤の性質によって異なります。多数の変数(US周波数、圧力振幅、パルス長、パルス繰り返し周波数など)を考えると、パラメータ空間全体を完全に探索することは、実用的である可能性は低い。提案されたプロトコルの利点は、このパラメーター・スペースのいくつかの境界を迅速に確立できる点です。例えば、キャビテーション信号が生成される最小圧力、細胞の剥離/死が起こる前に使用できる最大圧力またはパルス長さ、および分数高調波または広帯域ノイズが発生する圧力を決定することができます。このような一連のスコープ測定は、あらゆる研究の第一歩として実施することが推奨されます。

提示されているように、SASは音響放出のリアルタイムモニタリングのために設計され、生物学的アッセイは実験の外で行われる。しかし、顕微鏡目的を介してサンプルチャンバーの直接光学観察を可能にするためにSATを改変することは比較的簡単であろう。これは、例えば、薬物取り込みおよび気泡動態の観察を可能にするために、蛍光および/または高速顕微鏡システムに結合することができる。現在電圧で示されているPCD出力は、i)キャビテーションの動作の種類とその相対的な割合を示しています。ii) これらのキャビテーション動作が持続する期間。iii) 観察された時間累積露光特性が特定の生物効果に相関しているかどうか。そしてiv)相対レベルおよび時間依存行動が暴露系における以前の実験と一致しているかどうか。PCDの受信感度を定量化できる一方で、絶対エネルギーの観点から音響放出を確実に特徴付けるためには、追加の空間情報が必要です。これは、パッシブ音響マッピング^(PAM)80を実装するために、PCDをアレイプローブに置き換えることで達成できます。しかし、これは信号処理の複雑さと計算時間と必要な電力を増加させます。

膜電気抵抗の測定や物理的な標的化方法の適用のための他の計装、例えば磁場も組み込むことができる。また、腫瘍スフェロイド、オルガノイド、さらには細胞単層の代わりに音響的に「柔らかい」ゲル基質上のエキソウビボ組織サンプルなどの3次元組織構造を使用して、より現実的な組織環境における米国およびキャビテーション媒介効果を研究することもできる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorber	Precision Acoustics	APTFlex F28 panel	1.0 cm standard thickness
Amplifier (power)	E&I Ltd.	1040L	400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre)	Stanford Research Systems	SR445A	Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater	Aquael	Ultra 50W	Different models for different tank sizes.
Digitizer	TiePie Engineering	HS5-110-XM	Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone	Precision Acoustics	FOH	0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles	Bracco	SonoVue	FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3)	Olympus NDT	F-102	90 degree beam reflection
PCD transducer	Olympus NDT	V320-SU	Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable	Olympus NDT	BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid)	Corning	Sylgard 184	See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal)	Zeus	PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal)	VWR	391-2101	6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator	Agilent	33250	Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2	Ibidi	µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3	Corning	Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3)	Sonic Concepts	H107 with central hole	Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage