Étude de la thérapie améliorée par cavitation

Résumé

Le protocole expérimental présenté peut être utilisé pour effectuer des mesures en temps réel de l’activité de cavitation dans un dispositif de culture cellulaire dans le but de permettre l’étude des conditions requises pour une administration réussie de médicaments et / ou d’autres bioeffets.

Résumé

L’intérêt pour les applications thérapeutiques de l’échographie est important et croissant, avec des cibles cliniques potentielles allant du cancer à la maladie d’Alzheimer. La cavitation - la formation et le mouvement ultérieur de bulles dans un champ d’ultrasons - représente un phénomène clé qui sous-tend bon nombre de ces traitements. Il reste cependant une incertitude considérable concernant les mécanismes d’action détaillés par lesquels la cavitation favorise les effets thérapeutiques et il est nécessaire de développer des techniques de surveillance fiables qui peuvent être mises en œuvre cliniquement. En particulier, il existe une variation importante entre les études sur les paramètres d’exposition déclarés comme produisant avec succès des effets thérapeutiques et les émissions acoustiques correspondantes. L’objectif de cet article est de fournir des lignes directrices de conception et un protocole expérimental utilisant des composants largement disponibles pour effectuer des études sur les bioeffets médiés par la cavitation, et d’inclure une surveillance acoustique en temps réel. On espère que le protocole permettra une intégration plus généralisée de la surveillance acoustique dans les expériences échographiques thérapeutiques et facilitera la comparaison entre les études des conditions d’exposition et de leur corrélation avec les effets biologiques pertinents.

Introduction

L’échographie (US) a été largement utilisée comme technique d’imagerie diagnostique en raison de sa nature sûre et non invasive, de sa facilité de mise en œuvre au chevet d’un patient et de sa rentabilité¹. En plus de ses capacités de diagnostic et de surveillance, les États-Unis ont un potentiel considérable pour des applications thérapeutiques. Les premiers travaux ont exploré son utilisation dans la thrombolyse, la transfection de l’ADN et l’administration demédicaments^2,3,4 et les États-Unis thérapeutiques représentent maintenant un domaine de recherche très actif, avec des applications comprenant le traitement tumoral^5,6,7,l’immunothérapie^8,9,la perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE)^10,11,12,la thrombolyse^13,14,15et le traitement des infections bactériennes^16,17. Un phénomène clé qui sous-tend ces applications est la cavitation: la nucléation, la croissance et l’oscillation des cavités gazeuses dues aux changements de pression du fluide^18,19.

Il existe une gamme de mécanismes par lesquels la cavitation produit des effets biologiques. Par exemple, la nature hautement non linéaire des oscillations de bulles sous l’influence d’un champ us appliqué peut générer un microstreaming dans le liquide environnant qui peut à la fois améliorer la convection^{médicamenteuse 20} et exercer des contraintes de cisaillement sur le tissu à proximité des bulles. Ceci est particulièrement répandu lorsque les bulles se trouvent à proximité d’une limite, provoquant l’oscillation non sphérique des bulles, et pouvant potentiellement favoriser l’absorption de médicaments par perméabilisation induite par cisaillement^21,22,23,24. À des pressions plus élevées, on observe des oscillations de plus grande amplitude et un effondrement rapide des bulles, conférant une contrainte mécanique directe²⁵ et générant fréquemment des ondes de choc, et donc de grands gradients de pression qui peuvent perturber et perméabiliser les tissus^26,27. L’effondrement de bulles près d’une surface peut également entraîner la formation de microjets liquides à grande vitesse^28,29,30. Ces microjets peuvent pénétrer dans les tissus, créant potentiellement des pores ou induisant des ondes de stress secondaires^31,32. La perméabilisation des membranes biologiques tant au niveau tissulaire qu’au niveau cellulaire est diversement appelée sonophorèse, utilisée principalement dans le contexte de l’amélioration induite par les États-Unis de la perméabilité de la peau^33,34,et de la sonoporation, utilisée principalement pour décrire la perméabilisation réversible de la membrane cellulaire due à la formation de pores membranaires^35,36.

L’absorption visqueuse dans le liquide entourant immédiatement la bulle oscillante peut produire un effet de chauffage substantiel^37. De plus, les oscillations hautement non linéaires produisent un rayonnement acoustique à des fréquences supérieures à celles du champ us de conduite. Cela conduit à une absorption accrue dans les tissus environnants et à un chauffage supplémentaire³⁸. L’effondrement de la bulle peut également s’accompagner d’effets chimiques dus aux températures et pressions élevées transitoires dans le noyau de la bulle, tels que la génération d’espèces hautement réactives et le rayonnement électromagnétique, connu sous le nom de sonoluminescence^32. Ces effets ont été étudiés pour évaluer les dommages potentiels et/ou l’activation des voies cellulaires pertinentes pour l’administration³⁹ et exploités dans l’activation locale de médicaments sensibles à la lumière dans une approche connue sous le nom de thérapie sonodynamique^40,41,42,43.

De nombreux bioeffets médiés par les États-Unis peuvent être initiés uniquement par le contrôle des paramètres de champ américains (amplitude de la pression, fréquence, longueur d’impulsion et fréquence de répétition, et durée de l’exposition), mais générer de manière fiable une cavitation dans les tissus biologiques nécessite souvent des énergies d’entrée élevées et comporte donc un risque élevé de dommages. L’introduction de noyaux de cavitation exogènes ou artificiels peut réduire considérablement l’énergie d’entrée nécessaire pour produire le large éventail d’effets discutés ci-dessus et introduit en outre des effets supplémentaires qui peuvent ne pas être possibles avec les États-Unis seuls. Les noyaux de cavitation comprennent les bulles de gaz^26,44,les gouttelettes liquides^45,46,47 et les particules solides^48,49,50,les noyaux de cavitation à l’échelle nanométrique étant un domaine d’investigation émergent pour leurs avantages en termes de temps de circulation prolongé, d’extravasation améliorée et d’activité de cavitation prolongée^49,51,52,53.

Les noyaux les plus couramment utilisés sont les microbulles gazeuses (MBs), utilisés à l’origine comme agents de contraste en imagerie diagnostique. Ils ont généralement un diamètre de 1 à 2 micromètres et contiennent un noyau de gaz de poids moléculaire élevé à faible solubilité aqueuse dans le milieu environnant. Le noyau est entouré d’une enveloppe protectrice lipidique, protéique ou polymère le plus souvent constituée de phospholipides^54. Lorsqu’ils sont exposés à un champ US, la compressibilité des MBs les fait subir des oscillations volumétriques, produisant par conséquent une forte diffusion acoustique, ce qui est responsable du succès des MBs en tant qu’agent de contraste. Comme mentionné, ces oscillations conduisent également aux effets mécaniques, thermiques et chimiques susmentionnés qui peuvent être exploités dans des applications thérapeutiques. Le procédé de revêtement mb offre également un mécanisme pour encapsulant des médicaments dans la structure mb et pour attacher des médicaments et/ou cibler des espèces à la surface mb. Cette technique facilite la libération déclenchée de médicaments pour réduire la toxicité systémique⁵⁵. Il a également été récemment démontré que le matériel de la surface du MB peut être transféré à des structures biologiques, améliorant l’administration de médicaments par ce qu’on appelle la « sonoimpression »^56,57,58.

La surveillance de l’activité de cavitation médiée par les États-Unis peut fournir des informations sur les effets biologiques qui en résultent in vitro et in vivo et permet potentiellement le réglage et l’optimisation de ces effets. Les deux méthodes les plus largement utilisées pour surveiller l’activité de cavitation sont i) optiques, qui utilisent la microscopie vidéo à très grande vitesse et ne sont généralement pas réalisables invivo; et ii) acoustiques, qui enregistrent les champs sonores re-rayonnés produits par les bulles oscillantes et/ou qui s’effondrent. Les composantes amplitude et fréquence du signal acoustique contiennent des informations sur le comportement des bulles. Il a été démontré que de faibles concentrations de bulles à de faibles amplitudes incidentes aux États-Unis produisent principalement des émissions harmoniques (multiples entiers de la fréquence de conduite)⁵⁹. À mesure que les pressions d’entraînement augmentent, le spectre d’émission de bulles peut également contenir des composants fractionnaires connus sous le nom de sous-harmoniques et d’ultraharmoniques⁶⁰ qui indiquent un comportement non linéaire plus fort, ainsi que du bruit à large bande, qui indique une cavitation inertielle. Les harmoniques entières sont un indicateur primaire de l’oscillation des bulles, mais peuvent également être causées par des non-linéarités n’importe où dans un système expérimental, par exemple, en raison d’une propagation non linéaire. En revanche, les harmoniques fractionnaires et le bruit à large bande sont très fortement corrélés avec la dynamique des bulles.

La relation entre le comportement des bulles et les émissions acoustiques détectées peut être compliquée par des facteurs tels que le champ us incident, l’environnement de nucléation, et les caractéristiques de la voie de détection^60. Néanmoins, des informations importantes sur le comportement des bulles et leurs interactions avec les cellules peuvent être obtenues en discernant les tendances de fréquence et d’énergie dans le spectre acoustique. Ces données peuvent également fournir des informations précieuses qui peuvent être utilisées pour former la base des techniques de surveillance du traitement clinique. Pour exploiter pleinement ces informations, le développement de méthodes expérimentales robustes, traduisibles et reproductibles est nécessaire.

À l’heure actuelle, il existe des variations substantielles dans les protocoles signalés pour la conception de systèmes et la réalisation d’études pour soutenir le développement de thérapies assistées par cavitation. En ce qui concerne l’appareil, une gamme d’approches de conception a été entreprise. Plusieurs groupes ont utilisé des chambres à plaques parallèles^56,61,62,63,construites sur mesure ou disponibles dans le commerce (par exemple, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et coll. (2013) ont développé une chambre cellulaire couplée à un module de sonication américain et à une imagerie confocale en temps réel^64,Carugo et coll. (2015) ont utilisé un système comprenant une boîte de culture cellulaire disponible dans le commerce avec un couvercle PDMS sur mesure pour permettre la submersion dans un bain-marie pendant l’exposition américaine⁶⁵, et Pereno et coll. (2018) ont utilisé un dispositif composé de résonateurs acoustofluidiques en couches qui permettent une caractérisation optique et acoustique simultanée de la dynamique des bulles et des interactions bulle-cellule⁶⁶. L’utilisation de conceptions fabriquées sur mesure et spécifiques à l’application complique la caractérisation du champ américain et d’autres conditions d’exposition environnementale, ce qui rend les comparaisons d’études croisées difficiles. Par exemple, il existe une variation considérable dans les paramètres américains identifiés pour obtenir une sonoporation réussie, qui comprennent des fréquences centrales allant de 0,02 à 15 MHz, des cycles de service variant de 1% à une onde continue et des pressions de fabrication rares allant de 0,1 à 20 MPa^{23,64,67,68,69,70} (tableau 1). Il existe également une variation considérable dans les composantes spectrales (harmoniques, sous-harmoniques, etc.) qui ont été identifiées comme étant associées à des bioeffets particuliers.

L’objectif de ce travail est donc de fournir un cadre de conception et de mise en œuvre de systèmes facilement reproductibles pour l’étude in vitro des bioeffets cellulaires induits par la cavitation avec l’inclusion spécifique d’une capacité de surveillance de la cavitation.