JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

Abstract

בתאי עצב, אוריינטציה microtubule היה מעריך מפתח לזהות אקסונים שיש להם פלוס סוף החוצה microtubules ו דנדריטים כי בדרך כלל יש אוריינטציה מעורבת. כאן אנו מתארים שיטות לתיוג, תמונה וניתוח הדינמיקה והצמיחה של המיקרוטובלים במהלך הפיתוח וההתחדשות של נוירוני מגע ב- C. elegans. באמצעות כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית של טיפים מיקרוטובולים, צילמנו את microtubules האקסוני. ניתן לכמת את השינויים המקומיים בהתנהגות המיקרוטובול היוזם התחדשות אקסון בעקבות אקסוטומיה באמצעות פרוטוקול זה. בדיקה זו ניתנת להתאמה לנוירונים אחרים ורקעים גנטיים כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת microtubule בתהליכים תאיים שונים.

Introduction

לנוירונים יש ארכיטקטורה משוכללת עם תאים מיוחדים כמו דנדריטים, גופי תאים, אקסונים וסינפסות. הציטוסקלטון העצבי מורכב מהמיקרוטובולות, המיקרופילמנטים והנוירופילמנטים והארגון הייחודי שלהם תומך בתאים העצביים מבחינה מבנית ותפקודית1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . במהלך השנים, ארגון microtubule זוהה כגורם מכריע של קוטביות עצבית ותפקוד. כאשר נוירונים עוברים שיפוץ מבני במהלך הפיתוח או ההתחדשות, הדינמיקה והכיוון של microtubule קובעים את הזהות, התחבורה המקוטבת, הצמיחה והפיתוח של תאים עצביים שונים7. לכן, חובה להעריך את הדינמיקה והכיוון של המיקרו-קוטביות ב-vivo כדי לתאם עם תהליך השיפוץ העצבי.

Microtubules מורכב פרוטופילמנטים של הטרודימרים α β טובולין עם קצוות פלוס דינמיים ומינוס יציב יחסית מסתיים11,12. גילוי קומפלקס הקצה פלוס וחלבונים מחייבים הקשורים לקצה אפשרו פלטפורמה להעריך את ארגון microtubule13. חלבונים מחייבים בסופו של דבר (EBP) מקשרים באופן ארעי עם הקצוות הגדלים פלוס של microtubule ואת הדינמיקה עמותה מתואמים לצמיחה של protofilaments microtubule14,15. בשל שיוך תכופים וניתוק של קומפלקס קצה פלוס עם microtubule, פונקציית התפשטות הנקודה של GFP מתויג EBP מופיע כמו "כוכב שביט" בסרט timelapse15,16. מאז התצפית החלוצית בתאי העצב של היונקים16, חלבונים מחייבים בסופו של דבר מתויגים עם חלבונים פלואורסצנטיים שימשו לקביעת דינמיקת microtubule על פני מערכות מודל שונות וסוגי נוירונים17,18,19,20,21,22,23.

בשל מערכת העצבים הפשוטה שלה הגוף השקוף, C. elegans הוכיח להיות מערכת מודל מעולה ללמוד שיפוץ עצבי במהלך פיתוח והתחדשות ב vivo. כאן אנו מתארים שיטות לתיוג, תמונה וניתוח הדינמיקה והצמיחה של המיקרוטובלים במהלך הפיתוח וההתחדשות של נוירוני מגע ב- C. elegans. באמצעות EBP-2::GFP מקודד גנטית, צילמנו את המיקרוטובולות בנוירון PLM, מה שאיפשר לנו לקבוע את הקוטביות של המיקרוטובולות בשני נוריטים שונים של הנוירון הזה24. שיטה זו מאפשרת התבוננות וכימות של שביט EBP כמדד לדינמיקת מיקרוטובול בהקשרים תאיים שונים, לדוגמה, ניתן להעריך את השינויים המקומיים בהתנהגות המיקרוטובלים היוזמת התחדשות אקסון בעקבות אקסוטומיה באמצעות הפרוטוקול שלנו. בדיקה זו יכולה להיות מותאמת כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת microtubule בתהליכים תאיים שונים בסוגי תאים מגוונים ורקעים גנטיים.

Protocol

1. זן עיתונאי: תרבות ותחזוקה

הערה: כדי למדוד את הדינמיקה microtubule ואת הכיוון נוירונים PLM, השתמשנו בזן התולעת מבטא EBP-2::GFP תחת נוירון מגע ספציפי מקדם mec-4 (juIs338 allele)18,25,26. אנו משתמשים בתרבית תולעים סטנדרטית ושיטות תחזוקה עבור זן זה27.

  1. הכן את מדיום הצמיחה של נמטודה (3.0 גרם/ליטר נתרן כלורי, פפטונה 2.5 גרם/ל', 20.0 גרם/ליטר אגר, 10 מ"ג/ל' כולסטרול (מדולל מתמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל)) במים ומחלק אוטומטית את התערובת.
  2. מצננים את התערובת בקצרה במשך 10-15 דקות לפני ההשלמה עם 1 mM סידן כלורי, 1 mM מגנזיום סולפט ו 25.0 mM אשלגן פוספט pH מונובסי 6.0.
  3. יוצקים סביב 9 מ"ל של התערובת לתוך 60 מ"מ פטרי מנות באמצעות מתקן סטרילי ואחריו אחסון בטמפרטורת החדר ותנאים סטריליים ליום ואחסון לאחר מכן ב 4 °C (50 °F).
  4. הכן 50 מ"ל של מרק B (5.0 גרם / L נתרן כלורי, 10.0 גרם / L Bacto-טריפטון), autoclave ולקרר אותו לפני חקינה עם מושבה אחת של Escherichia coli (זן OP50).
  5. תרבית החיידקים ב 37 °C (50 °F) במשך 12 שעות. הביאו את לוחות ה-NGM בקירור לטמפרטורת החדר לזריעה ושימוש בממרח זכוכית מעוקר הופכים את ההדבקה של חיידקי OP50 על צלחת ה-NGM.
  6. שמור על לוחות NGM מחוסנים ב 37 °C (50 °F) במשך 12 שעות, אשר יאפשר היווצרות של דשא חיידקי עבור culturing של C. elegans. צלחות אלה ניתן לאחסן בחממה 20 °C עד השימוש.
  7. תחלקו את הזן הטרנסגני על לוחות הגז הטבעיים.
  8. עקר תיל פלטינה על להבה ובחר 20-25 הרמפרודיטים בוגרים gravid להעברה לצלחת זרעים טריים.
  9. לאחר ההעברה, להעביר את הצלחת לאינקובטור 20 °C במשך 1 שעה. לאחר מכן, לחלץ את המבוגרים מן הצלחות האלה. צלחות אלה יכילו כעת ביצים המותאמות לגיל.
  10. להעביר את הצלחות לחממה 20 °C לגידול עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי של עניין אשר במקרה זה הוא שלב L4 ב 43.5 שעות לאחר הטלת ביצה. לתולעים נוספות, יש כוויות מרובות אחוריות כדי להימנע מצפיפות.
  11. בשלב ההתפתחותי הרצוי, תולעים אלה ניתן להרכיב עבור הדמיה של שביט EBP-2::GFP.

2. הכנת מדגם: הרכבה של תולעים להדמיה של שביט EBP-2

הערה: כדי לאפשר תצפית חיה של שביט EBP בתאי העצב PLM, הרכבנו את התולעים על רפידות אגרוז כדי למזער את הניידות שלהם מבלי להתפשר על הפיזיולוגיה של הנוירון. בין שיטות immobilization השונות, בחרנו 0.1 מיקרומטר פתרון חרוזים פוליסטירן זמין מסחרית. תיארנו את הליך ההרכבה המשמש במיוחד עבור EBP-2:: GFP תצפית.

  1. הכן פתרון של 10% אגרוז על ידי המסת 0.2 גרם של אגרוז ב 2 מ"ל של 1x M9 חוצץ (0.02 M KH2PO4, 0.02 M Na2HPO4, 0.008 M NaCl, 0.02 M NH4Cl) במבחנת זכוכית 5 מ"ל מעל להבה. מבחנה זו יכולה בקלות להתאים לבלוק חימום אשר שומר על agarose במצב מותך עד השימוש.
  2. באמצעות טפטפת רחבת פה, לחלק טיפה (סביב 100 μL) של אגרוז מותך זה מעל שקופית זכוכית נקייה של 35 מ"מ x 25 מ"מ מידות.
  3. בעוד זה במצב מותך, לחץ על הטיפה עם שקופית זכוכית אחרת כדי ליצור סרט דק של agarose בין שקופיות הזכוכית. האגורוז מתמצת כסרט בעובי של כ-0.5 עד 1.0 מ"מ בתוך כ-30 שניות.
  4. ברגע שהאגורז מתמצק, החזק את השקופית התחתונה ביד הלא דומיננטית ואת החלק העליון ביד הדומיננטית. הפוך את השקופית העליונה תוך החזקת השקופית התחתונה יציבה וכתוצאה מכך משטח האגורוז נדבק לאחת משתי השקופיות.
  5. אם כרית אגרוז שנוצר גדול יותר מגודל כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ), ואז לקצץ את הקצוות של כרית כדי לקבל את הממדים הנדרשים כדי להבטיח מיקום נכון של כיסוי. רפידות אגרוז אלה מיועדות לשימוש מיידי ולא להיות מאוחסנות.
  6. בדוק חזותית את כרית האגורוז למשטח חלק שהם לחים ומתאימים להרכבה. אם כרית האגורוז נחשפת לאוויר ומתייבשת, פני השטח של כרית האגורוז נראים מקומטים. בתרחיש כזה, להכין כרית אגרוז טרי כאמור בשלבים 2-6 של סעיף זה.
  7. על כרית אגרוז, לשים 2 μL של 0.1 מיקרומטר פתרון חרוז פוליסטירן כאמצעי הרכבה.
  8. בחר 3-4 תולעים באמצעות פיק חוט פלטינה ולהעביר אותם על צלחת NGM לא מנוצל. תהליך זה מבטיח הסרה של חיידקי פני השטח המעכבים את ההשתקה במהלך הרכבה.
  9. ברגע שהתולעים זוחלות מתוך חיידקי פני השטח שלהן, הרימו אותן להרכבה באמצעות תיל פלטינה וחילצו אותן מחדש בטיפת חרוזי פוליסטירן על כרית האגורוז.
  10. בזהירות, מניחים כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ על התולעים. כדי למנוע הוצאת המעיים של התולעים המותקנות, אל תזיז את כיסוי לאחר המיקום.
  11. הר את השקופית המוכנה על המיקרוסקופ להדמיה.

3. הגדרת ורכישה הדמיה

הערה: שביט EBP לנסוע במהירות משוערת של 0.22 מיקרומטר/s כפי שנצפו בנוירונים יונקים ו PLM של C. elegans16,18. כדי לדגום באופן אופטימלי את האירועים ברכישה בזמן לשגות לפי קריטריוני Nyquist28, סולמות מרחביים וטמפורליים של 0.09 מיקרומטר ו 0.43 s, בהתאמה, נדרשים. למניעת פוטוטוקסיה או להלבנה, השתמשנו ברכישת ספינינג דיסק. תיארנו את הגדרות הגדרת ההדמיה והרכישה שלנו להלן.

  1. לכוד את התמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד ביחידת דיסק מסתובבת ומצלמה. הפעל את ההתקנה בהתאם להוראת היצרן.
  2. הפעל את התוכנה השולטת בהתקנה.
  3. מכיוון שמדובר במיקרוסקופ הפוך, הנח את השקופית עם התולעים המותקנות על הבמה עם יעד הגדלה נמוך (פי 5 או 10x) כאשר כיסוי הפנים כלפי מטה.
  4. הגדר את נתיב האור לעין או מצב גלוי המשתמש בתאורה מנורת הלוגן עבור אור מועבר ומנורת קשת כספית לאור משתקף.
  5. התמקד ומרכז תולעת בשדה התצוגה מתחת לברייטפילד.
  6. שים את שמן הטבילה ושנה את ההגדלה ל-63x (1.4NA/שמן) ומיקד מחדש את זנב התולעת בשדה הבהיר עבור הנוירונים PLM.
  7. הפעל את הפלואורסצנטיות של מנורת קשת הכספית למיקוד מחדש קצר של נוירוני PLM. מקם את ערכת מחזירי ההשתקפות הנכונה (AF488) בנתיב האור להדמיה של GFP.
  8. הגדר את המיקרוסקופ לרכישת המצלמה על-ידי הפניית נתיב האור למצלמה.
    הערה: שליטה בשלבים הנ"ל 4-7 באמצעות מסך טרנזיסטור הסרט הדק (TFT) של המיקרוסקופ היא מהירה ומונעת חשיפה מיותרת לתאורה. לחלופין, לשלוט בתאורה, רפלקטור באמצעות התוכנה.
  9. לאחר המיקוד של נוירון PLM בשדה התצוגה, בממשק התוכנה לבחור את התאורה של לייזר 488 ננומטר עם 30% כוח וחשיפה 300 ms עבור המצלמה עם אלקטרון רבייה (EM) להשיג ערך 70. בהתאם לביטוי הכתב, שנה פרמטרים אלה כנדרש. אחסן את ההגדרות כתצורה עבור הפעלות הדמיה עוקבות.
  10. הכרטיסיה ערוצים מאחסנת את הרצועות כל אחת עם הגדרת תאורה ומצלמה ספציפית. הרצועה המסומנת מאפשרת תצוגה חזותית חיה ואילו לרכישת תמונה יש לסמן את הרצועה. סמן ערוץ עם Brightfield (DIC) להמחשה חזותית חיה של זנב התולעת בסביבת העבודה. המדגם ממוקד וממורכז בחלון ההדמיה החיה של סביבת העבודה.
  11. הדגש את הערוץ עם עירור לייזר 488 ננומטר למיקוד מהיר של נוירון PLM בחלון ההדמיה החיה. לאחר התמקדות, התחל את הזמן לשגות רכישה על ידי הגדרת הפרמטרים סידרת הזמן כפי שהוזכר בשלב הבא.
  12. באמצעות תאורת לייזר של 488 ננומטר, קבע ניסוי בסדרת זמן למשך 2 דקות וללא מרווח זמן בין מסגרות. כדי לשמור על סולמות הזמן של רכישת תמונה, רכשנו רק פלואורסצנטיות GFP בלבד.
  13. באמצעות הכרטיסיה התחלת ניסוי, התחל את הרכישה. שימוש בהגדלה של פי 63 מגביל את הרזולוציה המרחבית ל- 0.21 מיקרומטר הנדגמת על-ידי המצלמה בגודל פיקסל של 0.09 מיקרומטר. השג זמן לשגות ב 3.3 פריימים/s עבור דגימה אופטימלית של האירוע. לתמונת הזמן לשגות היו 396 מסגרות זמן שנרכשו במשך 2 דקות. לאחר הרכישה, שמור את התמונה בתבנית ברירת המחדל, שאליה ניתן לגשת מאוחר יותר על-ידי תוכנת ברירת המחדל או ImageJ.

4. התבוננות וניתוח

  1. הצג בתצוגה מקדימה את רכישת timelapse בתוכנת ברירת המחדל או פתח אותה בתמונה J באמצעות תוסף Bioformats שלה.
    הערה: תיארנו את תהליך ניתוח התמונה בתמונה J.
  2. התקן את יישום התוסף של Bioformats ImageJ.
    1. לחלופין, יצא את קובץ התבנית המוגדר כברירת מחדל .tif לתאימות קבצים ב- ImageJ. פונקציית הייצוא ב-ZEN2 גורמת למסגרות בודדות של התמונה כקבצי .tif נפרדים. אנו נמנעים משיטת זה כדי למנוע היווצרות של מספר רב של קבצים.
  3. פתח את התמונה בתבנית '.czi' ישירות בתמונה J באמצעות תוסף 'Bioformats' שלה. התמונה נפתחת כערימה מרובת תמונות. אם אתה משתמש בפונקציה "ייצוא" של תוכנת ברירת המחדל, ולאחר מכן ערוך מחדש את התמונות כערימה מרובת תמונות באמצעות זרימת העבודה הבאה ב- ImageJ: ImageJ Program > תפריט תמונה > תפריט המשנה ערימות > תמונות לערום.
  4. הצג את התמונה בתצוגה מקדימה כסרט באמצעות סמל הפעל בפינה הימנית התחתונה של חלון התמונה. שביט ניתן לראות כמו punctae נייד בהיר בגוף התא ותהליכים של נוירון PLM. אם כוכב השביט גלוי בבירור, המשך לשלב 8 אחרת בצע את שלבים 5-7 של סעיף זה.
  5. המרת פרופיל הצבע של התמונה באמצעות טבלת בדיקת מידע (LUT) לתמונה בגווני אפור: תוכנית ImageJ > תפריט תמונה > תפריט המשנה טבלאות בדיקת מידע > בחירת אפורים.
  6. היפוך פרופיל LUT של התמונה לפריט חזותי קל: תוכנית ImageJ > תפריט תמונה > תפריט המשנה טבלאות בדיקת מידע > הפוך LUT.
  7. כוונן את הבהירות ואת הניגודיות של התמונה לצפייה בסבכי: תוכנית ImageJ > תפריט תמונה > התאמת תפריט המשנה > בהירות/ניגודיות.
    1. הזז את המחוונים של מינימום, מקסימום, בהירות וניגודיות לקבלת קנה המידה הרצוי של החוצמות לאורך התמונה. כימתנו את התמונות עם שביטים הנראים בבירור.
  8. הגירסה הבסיסית של ImageJ כוללת כלי אתחול המיוצגים כסמלים. אתר את הסמל באמצעות שורה עם שורה ולחץ עליו באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לפתוח תפריט נפתח ולבחור את השורה 'מקוטעת'. צייר את הקו המפולח על אזורי העניין (ROI) עם מקורו על או ליד גוף התא של הנוירון.
    1. לשיקולים מאוחרים יותר, שמור את ההשערה על השורה המפולחת באמצעות מנהל ההשערות באמצעות זרימת העבודה הבאה: ImageJ > לנתח > > מנהל ההשערות > > בחר את המעקב המצויר בתמונה ולחץ על הוסף בחלון מנהל ההשערה > עוד בחלון מנהל ההשערה > שמור.
  9. לפני יצירת הקימפוגרף, כאשר הסולמות המרחביים והטמפורליים שונים להסיר את קנה המידה כדי להשיג את המדידות בפיקסלים באמצעות הבאים:
    > ניתוח > קבע קנה מידה > לחץ כדי להסיר > קנה מידה אישור.
  10. באמצעות הפונקציה Reslice תחת התפריט הנפתח תמונה > ערימות, צור קימוגרף. הקימוגרף הוא ייצוג של ההשערות המפולח בזמן. הציר האופקי מייצג את המרחק והציר האנכי מייצג את השעה. העקבות האלכסוניים מייצגים את כוכב השביט הנע. בדרך כלל, הקימולוגרפיה לוקחת את פרופיל הצבע של התמונה אחרת להקצות פרופיל צבע כמתואר בשלבים הקודמים 5-6 עבור תצוגה חזותית של עקבות אלכסוניים.
  11. באמצעות הפונקציה קו ישר בתפריט הנפתח של הכלי Line (עיין בשלב 9 של מקטע זה) צייר קווים ישרים מעל כל אחד מהמעקבות האלכסוניים וצרף אותם למנהל ההשערות.
  12. תחת הכרטיסיה ניתוח, עבור אל הגדרת מדידות ובחר פרמטרים של עוצמה ממוצעת ומלבן תוחם למדידת המעקבים.
  13. בחלון מנהל ההשערה, לחץ על מדידה שתפתח חלון תוצאה אשר יניב את העוצמה הממוצעת של ROI, קואורדינטות X ו- Y של עקבות הקו, רוחב, גובה, זווית ואורך של עקבות הקו. ניתן לשמור חלון זה כתבנית .csv ולאחר מכן לייבא אותו לתוכנית ניתוח נתונים.
  14. בתוכנית הגיליון האלקטרוני, חלון התוצאות נפתח עם הערכים המופצים בשורות ובעמודות. הערכים הרלוונטיים הם הרוחב, הגובה והזווית של המעקבים. הרוחב מעניק את ההעתקה של המעקב, הגובה נותן את משך הזמן והזווית מייצגת את הווקטור. כאשר ערכי הרוחב והגובה נמצאים בפיקסלים, הכפל אותם עם הסולמות המרחביים והטמפורליים, בהתאמה, לקבלת הפרמטרים הניתנים למדידה הסטנדרטיים.
  15. כמו הצד השמאלי של הקימוגרף הוא קרוב לגוף התא, בהתאם לזווית, לסווג שביט לתוך פלוס-סוף החוצה או מינוס סוף החוצה (כלומר, הרחק מגוף התא או לכיוון גוף התא, בהתאמה). לסווג זוויות בין 1° ל- -89° ו- -91° עד -179° כ- plus-end-out ו- minus-end-out, בהתאמה. איסוף נתונים מקימאוגרפים מרובים בגיליון אלקטרוני למחקר ומייצגים סטטיסטית.

תוצאות

כדוגמה מייצגת, תיארנו בהתבוננות ב- vivo של שביט EBP במצב יציב וחדשות האקסונים של נוירוני PLM. נוירונים PLM ממוקמים באזור הזנב של התולעת עם תהליך ארוך הקדמי היוצר סינפסה ותהליך אחורי קצר. נוירוני PLM גדלים בכיוון הקדמי-אחורי קרוב לאפידרמיס ואחראים לתחושת המגע העדינה בתולעים. בשל המבנה הפשוט שלהם, ו?...

Discussion

הבנת הדינמיקה של המיקרוטובלים הייתה מוקד מרכזי בתחום חקר הציטוסד לאורך השנים. Microtubules לעבור התגרענות וקטסטרופה יחד עם תהליך מתמשך של חוסר יציבות דינמית44,45,46,47. הרבה מידע זה הושג באמצעות מבינות כמו קריאות...

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו מודים לישי ג'ין ואנדרו צ'יזהולם על התמיכה הראשונית והמתח ששימש במחקר. זן החיידקים OP50 היה הועיל מסחרית מהמרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC) במימון משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים גם לדהרמנדרה פורי על התקינה של ההליכים הניסיוניים. המחקר ממומן על ידי מענק הליבה של המרכז הלאומי לחקר המוח (נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, הממשלה של הודו), מענק קריירה מוקדמת של ברית הודו DBT/Wellcome Trust India (מענק # IA/E/18/1/504331) ל- S.D., מענק הביניים של ברית ברית הודו של Wellcome Trust-DBT (מענק # IA / IA / I/13/1/500874) ל- A.G.-R ומענק מוועדת המחקר המדעי וההנדסי (SERB: CRG/2019/002194) ל-א.ג.-ר

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CZ18975 worm strainYishi Jin labCZ18975Generated by Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Mounting worms
Dry bath with heating blockNeolabMounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)Blue StarMounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)Polysciences Inc.00876Mounting worms
Test tubesMounting worms
OP50 bacterial strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Worm handling
60mm petri platesPraveen Scientific20440Worm handling
Aspirator/CapillaryVWR53432-921Worm handling
IncubatorPanasonicMIR554EWorm handling
Platinum wireWorm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachmentLeicaM165FCWorm handling
0.3% Sodium ChlorideSigma71376Nematode Growth Medium
0.25% PeptoneT M Media1506Nematode Growth Medium
10mg/mL CholesterolSigmaC8667Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrateSigma223506Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrateSigmaM2773Nematode Growth Medium
2% AgarT M Media1202Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP9791Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP97911X M9 buffer
0.04M Sodium chlorideSigma713761X M9 buffer
0.1M Ammonium chlorideFisher Scientific214051X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrateSigmaS93901X M9 buffer
Glass bottlesBorosilBuffer storage
488 nm laserZeissImaging
5X objectiveZeissImaging
63X objectiveZeissImaging
CameraPhotometricsEvolve 512 DeltaImaging
Computer system for Spinning Disk unitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
Epifluorescence microscopeZeissObserver.Z1Imaging
Halogen lampZeissImaging
Mercury Arc LampZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 softwareZeissImaging
Image J (Fiji Version)Image analysis and processing
Adobe Creative CloudAdobeImage analysis and processing
Computer system for Image AnalysisDellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHzImage processing/Representation

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021)
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8, (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  62. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  63. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  64. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  65. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  66. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  67. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  68. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved