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  • Résumé
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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

Résumé

Dans les neurones, l’orientation des microtubules a été un évaluateur clé pour identifier les axones qui ont des microtubules à extrémité plus et des dendrites qui ont généralement une orientation mixte. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. À l’aide de rapporteurs fluorescents génétiquement codés des pointes de microtubules, nous avons imagé les microtubules axonaux. Les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être quantifiés à l’aide de ce protocole. Ce test est adaptable à d’autres neurones et arrière-plans génétiques pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires.

Introduction

Les neurones ont une architecture élaborée avec des compartiments spécialisés comme les dendrites, les corps cellulaires, les axones et les synapses. Le cytosquelette neuronal est constitué des microtubules, microfilaments et neurofilaments et leur organisation distincte soutient structurellement et fonctionnellement les compartiments neuronaux1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Au fil des ans, l’organisation des microtubules a été identifiée comme un déterminant clé de la polarité et de la fonction neuronales. Au fur et à mesure que les neurones subissent un remodelage structurel au cours du développement ou de la régénération, la dynamique et l’orientation des microtubules déterminent l’identité, le transport polarisé, la croissance et le développement de divers compartiments neuronaux7. Il est donc impératif d’évaluer la dynamique et l’orientation des microtubules in vivo pour établir une corrélation avec le processus de remodelage neuronal.

Les microtubules sont composés de protofilaments de α et d’hétérodimères de β de tubuline avec des extrémités plus dynamiques et des extrémités moins relativement stables11,12. La découverte du complexe plus tip et des protéines de liaison aux extrémités associées a permis à une plateforme d’évaluer l’organisation des microtubules13. Les protéines de liaison finale (EBP) s’associent transitoirement aux extrémités plus en croissance du microtubule et leur dynamique d’association sont corrélées à la croissance des protofilaments du microtubule14,15. En raison de l’association et de la dissociation fréquentes du complexe de pointe plus avec le microtubule, la fonction d’étalement ponctuel de l’EBP marqué GFP apparaît comme une « comète » dans un film timelapse15,16. Depuis l’observation pionnière dans les neurones des mammifères16,les protéines de liaison d’extrémité marquées avec des protéines fluorescentes ont été utilisées pour déterminer la dynamique des microtubules à travers différents systèmes modèles et types de neurones17,18 , 19,20,21,22,23.

En raison de son système nerveux simple et de son corps transparent, C. elegans s’est avéré être un excellent système modèle pour étudier le remodelage neuronal pendant le développement et la régénération in vivo. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. En utilisant EBP-2::GFP génétiquement codé, nous avons imagé les microtubules dans le neurone PLM, ce qui nous a permis de déterminer la polarité des microtubules dans deux neurites différents de ce neurone24. Cette méthode permet l’observation et la quantification des comètes EBP comme mesure de la dynamique des microtubules dans différents contextes cellulaires, par exemple, les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être évalués à l’aide de notre protocole. Ce test peut être adapté pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires dans divers types de cellules et de milieux génétiques.

Protocole

1. Souche du rapporteur : Culture et entretien

REMARQUE: Pour mesurer la dynamique et l’orientation des microtubules dans les neurones PLM, nous avons utilisé la souche de ver exprimant EBP-2::GFP sous le promoteur spécifique du neurone tactile mec-4 (allèlejuIs338) 18,25,26. Nous utilisons des méthodes standard de culture et d’entretien des vers pour cette souche27.

  1. Préparer le milieu de croissance des nématodes (3,0 g/L de chlorure de sodium, 2,5 g/L de peptone, 20,0 g/L de gélose, 10 mg/L de cholestérol (dilué à partir d’une solution stock de 10 mg/mL)) dans de l’eau et autoclaver le mélange.
  2. Refroidir brièvement le mélange pendant 10-15 min avant de le compléter avec 1 mM de chlorure de calcium, 1 mM de sulfate de magnésium et 25,0 mM de phosphate de potassium pH monobasique 6,0.
  3. Verser environ 9 mL du mélange dans des boîtes de Petri de 60 mm à l’aide d’un distributeur stérile, puis entreposage à température ambiante et dans des conditions stériles pendant une journée et stockage ultérieur à 4 °C.
  4. Préparer 50 mL de bouillon B (5,0 g/L de chlorure de sodium, 10,0 g/L de bacto-tryptone), l’autoclave et le refroidir avant d’inoculer avec une seule colonie d’Escherichia coli (souche OP50).
  5. Culturez la bactérie à 37 °C pendant 12 heures. Amenez les plaques de NGM réfrigérées à température ambiante pour l’ensemencement et à l’aide d’un épandeur de verre stérilisé, faites un frottis de bactéries OP50 sur la plaque de NGM.
  6. Conserver les plaques de NGM inoculées à 37 °C pendant 12 heures, ce qui permettra la formation d’une pelouse bactérienne pour la culture de C. elegans. Ces plaques peuvent être stockées dans un incubateur à 20 °C jusqu’à utilisation.
  7. Élever la souche transgénique sur les plaques de NGM ensemencées.
  8. Stérilisez un pic en fil de platine sur flamme et cueillez 20 à 25 hermaphrodites adultes gravides à transférer dans une assiette fraîchement ensemencée.
  9. Une fois transférée, déplacez la plaque dans un incubateur à 20 °C pendant 1 h. Ensuite, extrayez les adultes de ces plaques. Ces plaques contiendront maintenant des œufs qui correspondent à l’âge.
  10. Déplacez les plaques vers l’incubateur à 20 °C pour l’élevage jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de développement d’intérêt qui, dans ce cas, est le stade L4 à 43,5 heures après la ponte. Pour plus de vers, reculez plusieurs plaques pour éviter l’encombrement.
  11. Au stade de développement souhaité, ces vers peuvent être montés pour l’imagerie des comètes EBP-2::GFP.

2. Préparation de l’échantillon : Montage de vers pour l’imagerie des comètes EBP-2

REMARQUE: Pour permettre l’observation en direct des comètes EBP dans les neurones PLM, nous avons monté les vers sur des coussinets d’agarose pour minimiser leur mobilité sans compromettre la physiologie du neurone. Parmi les différentes méthodes d’immobilisation, nous avons choisi une solution de billes de polystyrène de 0,1 μm facilement disponible dans le commerce. Nous avons décrit la procédure de montage utilisée spécifiquement pour l’observation EBP-2::GFP.

  1. Préparer une solution d’agarose à 10 % en faisant fondre 0,2 g d’agarose dans 2 mL de tampon 1x M9 (0,02 M KH2PO4,0,02 M Na2HPO4,0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) dans un tube à essai en verre de 5 mL sur une flamme. Ce tube à essai peut facilement s’insérer dans un bloc chauffant qui maintient l’agarose à l’état fondu jusqu’à son utilisation.
  2. À l’aide d’un compte-gouttes à large bouche, distribuer une goutte (environ 100 μL) de cette agarose fondue sur une lame de verre propre de dimensions de 35 mm x 25 mm.
  3. Pendant qu’il est à l’état fondu, appuyez sur la goutte avec une autre lame de verre pour créer un mince film de l’agarose entre les lames de verre. L’agarose se solidifie sous la forme d’un film d’environ 0,5 à 1,0 mm d’épaisseur en environ 30 secondes.
  4. Une fois que l’agarose se solidifie, tenez la glissière inférieure dans la main non dominante et la glissière supérieure dans la main dominante. Retournez la glissière supérieure tout en maintenant la glissière inférieure stable, ce qui fait que le coussinet d’agarose adhère à l’une des deux glissières.
  5. Si le tampon d’agarose formé est plus grand que la taille du couvercle (18 mm x 18 mm), coupez les bords du tampon pour obtenir les dimensions requises afin d’assurer un placement correct du couvercle. Ces tampons d’agarose sont destinés à une utilisation immédiate et ne doivent pas être stockés.
  6. Inspectez visuellement le tampon d’agarose pour obtenir une surface lisse, humide et adaptée au montage. Si le tampon d’agarose est exposé à l’air et se dessèche, la surface du tampon d’agarose semble ridée. Dans un tel scénario, préparez un tampon d’agarose frais comme mentionné aux étapes 2 à 6 de cette section.
  7. Sur le tampon d’agarose, mettre 2 μL de solution de billes de polystyrène de 0,1 μm comme support de montage.
  8. Choisissez 3-4 vers à l’aide d’un pic à fil de platine et déplacez-les sur une plaque NGM non enseinée. Ce processus assure l’élimination des bactéries de surface qui entravent l’immobilisation pendant le montage.
  9. Une fois que les vers sortent de leurs bactéries de surface, ramassez-les pour les monter à l’aide d’un pic à fil de platine et ressuspendez-les dans la goutte de perles de polystyrène sur le tampon d’agarose.
  10. Placez soigneusement un couvercle de 18 mm x 18 mm sur les vers. Pour éviter l’éviscération des vers montés, ne déplacez pas le couvercle après le placement.
  11. Montez la lame préparée sur le microscope pour l’imagerie.

3. Configuration et acquisition d’imagerie

REMARQUE: Les comètes EBP voyagent avec une vitesse approximative de 0,22 μm / s observée dans les neurones mammifères et PLM de C. elegans16,18. Pour échantillonner de manière optimale les événements dans une acquisition en accéléré selon les critères de Nyquist28,des échelles spatiales et temporelles de 0,09 μm et 0,43 s, respectivement, sont nécessaires. Pour la prévention de la phototoxicité ou du photobleaching, nous avons utilisé l’acquisition Spinning Disk. Nous avons décrit nos paramètres de configuration et d’acquisition d’imagerie ci-dessous.

  1. Capturez les images à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une unité de disque rotatif et d’une caméra. Activez la configuration conformément aux instructions du fabricant.
  2. Activez le logiciel qui contrôle la configuration.
  3. Comme il s’agit d’un microscope inversé, placez la lame avec les vers montés sur la scène avec un objectif de faible grossissement (5x ou 10x) avec le couvercle tourné vers le bas.
  4. Configurez le chemin de la lumière vers le mode œil ou visible qui utilise l’éclairage de la lampe halogène pour la lumière transmise et de la lampe à arc au mercure pour la lumière réfléchie.
  5. Focalisation et centrer un ver dans le champ de vue sous le champ lumineux.
  6. Mettez l’huile d’immersion et changez le grossissement à 63x (1,4NA / huile) et recentrez la queue du ver dans le champ lumineux pour les neurones PLM.
  7. Allumez la fluorescence de la lampe à arc au mercure pour un bref recentrage des neurones PLM. Placez le bon jeu de réflecteurs (AF488) dans le chemin de la lumière pour la visualisation de GFP.
  8. Réglez le microscope sur l’acquisition de la caméra en dirigeant le chemin de la lumière vers la caméra.
    REMARQUE: Le contrôle des étapes 4 à 7 mentionnées ci-dessus via l’écran À transistor à couche mince (TFT) du microscope est rapide et empêche une exposition inutile à l’éclairage. Alternativement, contrôlez l’éclairage, le réflecteur via le logiciel.
  9. Après la mise au point du neurone PLM dans le champ de vision, sélectionnez dans l’interface logicielle l’éclairage du laser 488 nm avec une puissance de 30% et une exposition de 300 ms pour la caméra avec la valeur de gain de multiplication d’électrons (EM) 70. Selon l’expression du rapporteur, variez ces paramètres selon vos besoins. Stockez les paramètres en tant que configuration pour les sessions d’imagerie suivantes.
  10. L’onglet Canaux stocke les pistes avec chacune un éclairage et un réglage de caméra spécifiques. La piste en surbrillance permet une visualisation en direct alors que pour acquérir une image, la piste doit être cochée. Mettez en surbrillance un canal avec un champ lumineux (DIC) pour une visualisation en direct de la queue du ver dans l’espace de travail. L’échantillon est focalé et centré dans la fenêtre d’imagerie en direct de l’espace de travail.
  11. Mettez en surbrillance le canal avec une excitation laser de 488 nm pour une mise au point rapide du neurone PLM dans la fenêtre d’imagerie en direct. Une fois la mise au point, commencez l’acquisition en accéléré en définissant les paramètres de la série chronologique comme mentionné à l’étape suivante.
  12. En utilisant l’éclairage laser 488 nm, configurez une expérience avec des séries chronologiques de 2 minutes et aucun intervalle de temps entre les images. Pour maintenir les échelles temporelles de l’acquisition d’images, nous n’avons acquis que la fluorescence GFP uniquement.
  13. À l’aide de l’onglet Démarrer l’expérience, commencez l’acquisition. L’utilisation d’un grossissement de 63x limite la résolution spatiale à 0,21 μm qui est échantillonnée par la caméra à la taille de pixel de 0,09 μm. Acquérez un laps de temps à 3,3 images/s pour échantillonner l’événement de manière optimale. L’image en accéléré avait 396 périodes acquises sur une durée de 2 min. Après l’acquisition, enregistrez l’image dans le format par défaut, auquel le logiciel par défaut ou ImageJ peut accéder ultérieurement.

4. Observation et analyse

  1. Prévisualisez l’acquisition timelapse dans le logiciel par défaut ou ouvrez-la dans Image J via son plug-in Bioformats.
    REMARQUE: Nous avons décrit le processus d’analyse d’image dans l’image J.
  2. Installez le plug-in Bioformats dans ImageJ.
    1. Vous pouvez également exporter le fichier de format par défaut dans .tif pour la compatibilité des fichiers dans ImageJ. La fonction d’exportation dans ZEN2 permet d’afficher des images individuelles de l’image sous forme de fichiers .tif discrets. Nous évitons cette méthode pour éviter la formation d’un grand nombre de fichiers.
  3. Ouvrez l’image au format '.czi' directement dans Image J via son plugin 'Bioformats'. L’image s’ouvre sous la forme d’une pile multi-images. Si vous utilisez la fonction « export » du logiciel par défaut, reconstituez les images en tant que pile multi-images à l’aide du flux de travail suivant dans ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stack.
  4. Prévisualisez l’image en tant que film à l’aide de l’icône Lecture dans le coin inférieur gauche de la fenêtre d’image. Les comètes peuvent être considérées comme des ponctuations mobiles brillantes dans le corps cellulaire et les processus du neurone PLM. Si les comètes sont clairement visibles, passez à l’étape 8 sinon suivez les étapes 5 à 7 de cette section.
  5. Convertissez le profil colorimétrique de l’image à l’aide de la table de choix (LUT) en une image en niveaux de gris : programme ImageJ > menu Image > sous-menu Tables de choix > Sélectionner les gris.
  6. Inverser le profil LUT de l’image pour une visualisation facile : le programme ImageJ > menu Image > sous-menu Tables de choix > Inverser LUT.
  7. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour voir les comètes : programme ImageJ > menu Image > Ajuster le sous-menu > Luminosité/Contraste.
    1. Déplacez les curseurs Minimum, Maximum, Luminosité et Contraste pour la mise à l’échelle souhaitée des intensités sur l’image. Nous avons quantifié les images avec des comètes visibles distinctement.
  8. La version de base d’ImageJ comporte des outils de démarrage représentés sous forme d’icônes. Recherchez et cliquez avec le bouton droit sur l’icône avec une ligne pour ouvrir un menu déroulant et sélectionnez la ligne segmentée. Tracez la ligne segmentée sur les régions d’intérêt (ROI) avec son origine sur ou près du corps cellulaire du neurone.
    1. Pour des considérations ultérieures, enregistrez le retour sur investissement de la ligne segmentée via le gestionnaire de retour sur investissement à l’aide du flux de travail suivant : ImageJ > Analyser les outils > > gestionnaire de retour sur investissement > Sélectionnez la trace dessinée dans l’image et cliquez sur Ajouter dans la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement > Plus dans la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement > Enregistrer.
  9. Avant de générer le kymographe, comme les échelles spatiale et temporelle sont différentes, retirez la mise à l’échelle pour obtenir les mesures en pixels en utilisant les éléments suivants :
    ImageJ > Analyser > Définir l’échelle > Cliquez pour supprimer l’échelle > Ok.
  10. À l’aide de la fonction Reslice (Reslice) du menu déroulant Image > Stacks (Piles d’images), générez un kymographe. Le kymographe est une représentation du ROI segmenté dans le temps. L’axe horizontal représente la distance et l’axe vertical représente le temps. Les traces diagonales représentent les comètes en mouvement. Généralement, le kymographe prend le profil de couleur de l’image sinon attribuer un profil de couleur comme décrit dans les étapes précédentes 5-6 pour la visualisation des traces diagonales.
  11. À l’aide de la fonction Ligne droite du menu déroulant de l’outil Ligne (reportez-vous à l’étape 9 de cette section), tracez des lignes droites sur chacune des traces diagonales et ajoutez-les dans le gestionnaire de retour sur investissement.
  12. Sous l’onglet Analyser, accédez à Définir les mesures et sélectionnez Intensité moyenne et Paramètres rectangle englobant pour mesurer les traces.
  13. Dans la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Mesure qui ouvrira une fenêtre de résultats qui donnera l’intensité moyenne du retour sur investissement, les coordonnées X et Y des traces de ligne, la largeur, la hauteur, l’angle et la longueur des traces de ligne. Cette fenêtre peut être enregistrée au format .csv et importée ultérieurement dans un programme d’analyse de données.
  14. Dans le tableur, la fenêtre de résultats s’ouvre avec les valeurs distribuées en lignes et en colonnes. Les valeurs pertinentes sont la largeur, la hauteur et l’angle des traces. La largeur donne le déplacement de la trace, la hauteur donne la durée et l’angle représente le vecteur. Comme les valeurs de largeur et de hauteur sont en pixels, multipliez-les avec les échelles spatiale et temporelle, respectivement, pour obtenir les paramètres mesurables standard.
  15. Comme le côté gauche du kymographe est proximal au corps cellulaire, selon l’angle, classez les comètes en extrémité plus ou moins (c’est-à-dire loin du corps cellulaire ou vers le corps cellulaire, respectivement). Classez les angles entre 1° à -89° et -91° à -179° comme plus-end-out et minus-end-out, respectivement. Rassemblez les données de plusieurs kymographes dans une feuille de calcul pour une étude et représentez statistiquement.

Résultats

À titre d’exemple représentatif, nous avons décrit l’observation in vivo des comètes EBP à l’état d’équilibre et des axones régénérants des neurones PLM. Les neurones PLM sont situés dans la région de la queue du ver avec un long processus antérieur qui forme une synapse et un court processus postérieur. Les neurones PLM se développent dans la direction antérieure-postérieure près de l’épiderme et sont responsables de la sensation de toucher doux chez les vers. En raison de leur structure sim...

Discussion

La compréhension de la dynamique des microtubules a été un objectif clé dans le domaine de la recherche sur le cytosquelette au fil des ans. Les microtubules subissent une nucléation et une catastrophe ainsi qu’un processus continu d’instabilité dynamique44,45,46,47. Une grande partie de cette information a été obtenue par des essais in vitro tels que de...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Yishi Jin et Andrew Chisholm pour le soutien initial et la souche utilisée dans l’étude. La souche bactérienne OP50 a été utilisée commercialement par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous remercions également Dharmendra Puri pour la standardisation des procédures expérimentales. L’étude est financée par la subvention de base du National Brain Research Centre (soutenu par le Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Subvention # IA / E / 18/1/504331) à S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Subvention # IA / I / 13/1/500874) à A.G.-R et une subvention du Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) à A.G.-R.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
CZ18975 worm strainYishi Jin labCZ18975Generated by Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Mounting worms
Dry bath with heating blockNeolabMounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)Blue StarMounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)Polysciences Inc.00876Mounting worms
Test tubesMounting worms
OP50 bacterial strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Worm handling
60mm petri platesPraveen Scientific20440Worm handling
Aspirator/CapillaryVWR53432-921Worm handling
IncubatorPanasonicMIR554EWorm handling
Platinum wireWorm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachmentLeicaM165FCWorm handling
0.3% Sodium ChlorideSigma71376Nematode Growth Medium
0.25% PeptoneT M Media1506Nematode Growth Medium
10mg/mL CholesterolSigmaC8667Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrateSigma223506Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrateSigmaM2773Nematode Growth Medium
2% AgarT M Media1202Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP9791Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP97911X M9 buffer
0.04M Sodium chlorideSigma713761X M9 buffer
0.1M Ammonium chlorideFisher Scientific214051X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrateSigmaS93901X M9 buffer
Glass bottlesBorosilBuffer storage
488 nm laserZeissImaging
5X objectiveZeissImaging
63X objectiveZeissImaging
CameraPhotometricsEvolve 512 DeltaImaging
Computer system for Spinning Disk unitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
Epifluorescence microscopeZeissObserver.Z1Imaging
Halogen lampZeissImaging
Mercury Arc LampZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 softwareZeissImaging
Image J (Fiji Version)Image analysis and processing
Adobe Creative CloudAdobeImage analysis and processing
Computer system for Image AnalysisDellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHzImage processing/Representation

Références

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