In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

Résumé

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

Résumé

Dans les neurones, l’orientation des microtubules a été un évaluateur clé pour identifier les axones qui ont des microtubules à extrémité plus et des dendrites qui ont généralement une orientation mixte. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. À l’aide de rapporteurs fluorescents génétiquement codés des pointes de microtubules, nous avons imagé les microtubules axonaux. Les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être quantifiés à l’aide de ce protocole. Ce test est adaptable à d’autres neurones et arrière-plans génétiques pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires.

Introduction

Les neurones ont une architecture élaborée avec des compartiments spécialisés comme les dendrites, les corps cellulaires, les axones et les synapses. Le cytosquelette neuronal est constitué des microtubules, microfilaments et neurofilaments et leur organisation distincte soutient structurellement et fonctionnellement les compartiments neuronaux^1,2,^{3,4,5,6,7,8,9,}

Protocole

1. Souche du rapporteur : Culture et entretien

REMARQUE: Pour mesurer la dynamique et l’orientation des microtubules dans les neurones PLM, nous avons utilisé la souche de ver exprimant EBP-2::GFP sous le promoteur spécifique du neurone tactile mec-4 (allèlejuIs338) ^18,25,26. Nous utilisons des méthodes standard de culture et d’entretien des vers pour cette souche²⁷.

1. Préparer le milieu de croissance des nématodes (3,0 g/L de chlorure de sodium, 2,5 g/L....

Résultats

À titre d’exemple représentatif, nous avons décrit l’observation in vivo des comètes EBP à l’état d’équilibre et des axones régénérants des neurones PLM. Les neurones PLM sont situés dans la région de la queue du ver avec un long processus antérieur qui forme une synapse et un court processus postérieur. Les neurones PLM se développent dans la direction antérieure-postérieure près de l’épiderme et sont responsables de la sensation de toucher doux chez les vers. En raison de leur structure sim.......

Discussion

La compréhension de la dynamique des microtubules a été un objectif clé dans le domaine de la recherche sur le cytosquelette au fil des ans. Les microtubules subissent une nucléation et une catastrophe ainsi qu’un processus continu d’instabilité dynamique^44,45,46,47. Une grande partie de cette information a été obtenue par des essais in vitro tels que de.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CZ18975 worm strain	Yishi Jin lab	CZ18975	Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose	Sigma	A9539	Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)	Zeiss	474030-9010-000	Mounting worms
Dry bath with heating block	Neolab		Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)	Blue Star		Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)	Polysciences Inc.	00876	Mounting worms
Test tubes			Mounting worms
OP50 bacterial strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Worm handling
60mm petri plates	Praveen Scientific	20440	Worm handling
Aspirator/Capillary	VWR	53432-921	Worm handling
Incubator	Panasonic	MIR554E	Worm handling
Platinum wire			Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment	Leica	M165FC	Worm handling
0.3% Sodium Chloride	Sigma	71376	Nematode Growth Medium
0.25% Peptone	T M Media	1506	Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol	Sigma	C8667	Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate	Sigma	223506	Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate	Sigma	M2773	Nematode Growth Medium
2% Agar	T M Media	1202	Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791	Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791	1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride	Sigma	71376	1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride	Fisher Scientific	21405	1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	Sigma	S9390	1X M9 buffer
Glass bottles	Borosil		Buffer storage
488 nm laser	Zeiss		Imaging
5X objective	Zeiss		Imaging
63X objective	Zeiss		Imaging
Camera	Photometrics	Evolve 512 Delta	Imaging
Computer system for Spinning Disk unit	HP	Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz	Imaging
Epifluorescence microscope	Zeiss	Observer.Z1	Imaging
Halogen lamp	Zeiss		Imaging
Mercury Arc Lamp	Zeiss		Imaging
Spinning Disk Unit	Yokogawa	CSU-X1	Imaging
ZEN2 software	Zeiss		Imaging
Image J (Fiji Version)			Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud	Adobe		Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis	Dell	Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz	Image processing/Representation