JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен протокол визуализации динамических микротрубочек in vivo с использованием флуоресцентно меченого конечного связывающего белка. Описаны методы маркировки, изображения и анализа динамических микротрубочек в заднем боковом микротрубочке (PLM) нейрона C. elegans.

Аннотация

В нейронах ориентация микротрубочек была ключевым оценщиком для идентификации аксонов, которые имеют плюсовые микротрубочки и дендриты, которые обычно имеют смешанную ориентацию. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированные флуоресцентные репортеры кончиков микротрубочек, мы визуалировали аксональные микротрубочки. Локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть количественно определены с помощью этого протокола. Этот анализ адаптируется к другим нейронам и генетическим фонам для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах.

Введение

Нейроны имеют сложную архитектуру со специализированными компартментами, такими как дендриты, клеточные тела, аксоны и синапсы. Нейрональный цитоскелет состоит из микротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов, и их отчетливая организация поддерживает нейронные компартменты структурно и функционально1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . На протяжении многих лет организация микротрубочек была идентифицирована как ключевой детерминант полярности и функции нейронов. Поскольку нейроны подвергаются структурному ремоделированию во время развития или регенерации, динамика и ориентация микротрубочек определяют идентичность, поляризованный транспорт, рост и развитие различных нейронных компартментов7. Поэтому крайне важно оценить динамику и ориентацию микротрубочек in vivo, чтобы коррелировать с процессом ремоделирования нейронов.

Микротрубочки состоят из протофиламентов гетеродимеров α и β тубулина с динамическими плюс-концами и относительно стабильными минус-концами11,12. Открытие комплекса плюс-наконечника и связанных с ним конечных связывающих белков позволило платформе оценить организацию микротрубочек13. Конечные связывающие белки (EBP) временно связываются с растущими плюс концем микротрубочек и их ассоциативная динамика коррелирует с ростом протофиламентов микротрубочек14,15. Из-за частой ассоциации и диссоциации комплекса плюс наконечника с микротрубочкой функция точечного распространения GFP-помеченного EBP появляется как «комета» в таймлапс-ролике15,16. Начиная с новаторского наблюдения за нейронами млекопитающих16,конечные связывающие белки, помеченные флуоресцентными белками, использовались для определения динамики микротрубочек в различных модельных системах и типах нейронов17,18,19,20,21,22,23.

Благодаря своей простой нервной системе и прозрачному телу, C. elegans зарекомендовал себя как отличная модельная система для изучения ремоделирования нейронов во время развития и регенерации in vivo. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированный EBP-2::GFP, мы визуализировали микротрубочки в нейроне PLM, что позволило нам определить полярность микротрубочек в двух разных нейритах этого нейрона24. Этот метод позволяет наблюдать и количественно оценивать кометы EBP как меру динамики микротрубочек в различных клеточных контекстах, например, локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть оценены с использованием нашего протокола. Этот анализ может быть адаптирован для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах в различных типах клеток и генетическом фоне.

протокол

1. Репортерное напряжение: культура и поддержание

ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения динамики микротрубочек и ориентации в нейронах PLM мы использовали штамм червя, экспрессирующий EBP-2::GFP под сенсорным нейроном специфическим промотором mec-4 (аллель juIs338) 18,25,26. Мы используем стандартные методы культивирования и поддержания червей для этого штамма27.

  1. Подготовьте питательную среду нематоды (3,0 г/л хлорида натрия, 2,5 г/л пептона, 20,0 г/л агара, 10 мг/л холестерина (разбавленного из запасного раствора 10 мг/мл)) в воде и автоклаве смеси.
  2. Охладите смесь кратковременно в течение 10-15 мин, прежде чем дополнить ее 1 мМ хлорида кальция, 1 мМ сульфата магния и 25,0 мМ фосфата калия моноосновным рН 6,0.
  3. Вылейте около 9 мл смеси в 60 мм чашки Петри с помощью стерильного дозатора с последующим хранением при комнатной температуре и стерильных условиях в течение суток и последующим хранением при 4 °C.
  4. Приготовьте 50 мл бульона B (5,0 г /л хлорида натрия, 10,0 г / л бакто-триптона), автоклав и охладите его перед инокуляцией одной колонией кишечной палочки (штамм OP50).
  5. Культивировщик бактерий при 37 °C в течение 12 часов. Доведите охлажденные пластины NGM до комнатной температуры для посева и с помощью стерилизованного стеклянного распределителя сделайте мазок бактерий OP50 на пластине NGM.
  6. Держите привитые плиты NGM при 37 °C в течение 12 часов, что позволит сформировать бактериальный газон для культивирования C. elegans. Эти пластины можно хранить в инкубаторе при 20 °C до использования.
  7. Задней части трансгенный штамм на засеянных пластинах NGM.
  8. Стерилизуйте платиновый проволочный отмычек на огне и соберите 20-25 гравидных взрослых гермафродитов для переноса на свежепосеянную тарелку.
  9. После переноса переложить пластину в инкубатор при 20 °C в течение 1 ч. Затем извлеките взрослых из этих пластин. Эти пластины теперь будут содержать яйца, которые соответствуют возрасту.
  10. Переместите пластины в инкубатор 20 °C для выращивания до тех пор, пока они не достигнут интересующей стадии развития, которая в данном случае является стадией L4 через 43,5 часа после откладывания яиц. Для большего количества червей, задние несколько пластин, чтобы избежать скученности.
  11. На желаемой стадии развития эти черви могут быть установлены для визуализации комет EBP-2::GFP.

2. Пробоподготовка: Установка червей для визуализации комет EBP-2

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить живое наблюдение комет EBP в нейронах PLM, мы установили червей на агарозных подушечках, чтобы минимизировать их подвижность, не ставя под угрозу физиологию нейрона. Среди различных методов иммобилизации мы выбрали 0,1 мкм раствор полистирольных шариков, легко доступный в продаже. Мы изложили процедуру монтажа, используемую специально для наблюдения EBP-2::GFP.

  1. Готовят раствор 10% агарозы путем плавления 0,2 г агарозы в 2 мл 1x M9 буфера (0,02 M KH2PO4,0,02 M Na2HPO4,0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) в стеклянной пробирке 5 мл над пламенем. Эта пробирка может легко поместиться в нагревательный блок, который удерживает агарозу в расплавленном состоянии до использования.
  2. Используя пипетку с широким горлом, дозируют каплю (около 100 мкл) этой расплавленной агарозы на чистом стеклянном слайде размером 35 мм х 25 мм.
  3. Пока он находится в расплавленном состоянии, нажмите на каплю другим стеклянным слайдом, чтобы создать тонкую пленку агарозы между стеклянными слайдами. Агароза затвердевает в виде пленки толщиной около 0,5 - 1,0 мм примерно за 30 секунд.
  4. Как только агароза затвердеет, держите нижний слайд в недоминирующей руке, а верхний слайд в доминирующей руке. Переверните верхний слайд, удерживая нижний слайд устойчивым, в результате чего агарозная подушка прилипает к одному из двух слайдов.
  5. Если сформированная агарозная прокладка больше размера крышки (18 мм х 18 мм), то обрежьте края прокладки для получения необходимых размеров для обеспечения правильного размещения крышки. Эти агарозные прокладки предназначены для немедленного использования и не должны храниться.
  6. Визуально осмотрите агарозную прокладку на наличие гладкой поверхности, которая является влажной и пригодной для монтажа. Если агарозная прокладка подвергается воздействию воздуха и высыхает, поверхность агарозной прокладки кажется морщинистой. В таком случае приготовьте свежую агарозную подушку, как указано в шагах 2-6 этого раздела.
  7. На агарозную прокладку поместите 2 мкл раствора полистирольного шарика 0,1 мкм в качестве монтажного носителя.
  8. Выберите 3-4 червя с помощью платиновой проволоки и переложите их на несеяную пластину NGM. Этот процесс обеспечивает удаление поверхностных бактерий, препятствующих иммобилизации во время монтажа.
  9. Как только черви выползут из своих поверхностных бактерий, подберите их для монтажа с помощью платиновой проволоки и повторно суспендьте их в капле полистирольных шариков на агарозовой подушке.
  10. Осторожно поместите на червей крышку 18 мм x 18 мм. Чтобы предотвратить потрошение навесных червей, не перемещайте крышку после размещения.
  11. Установите подготовленный слайд на микроскоп для визуализации.

3. Настройка и получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Кометы EBP движутся с приблизительной скоростью 0,22 мкм/с, как это наблюдалось в нейронах млекопитающих и PLM C. elegans16,18. Для оптимальной выборки событий в замедленной съемке в соответствии с критериями Найквиста28требуются пространственные и временные масштабы 0,09 мкм и 0,43 с соответственно. Для предотвращения фототоксичности или фотоотбеливания мы использовали сбор Spinning Disk. Ниже мы описали настройку и сбор изображений.

  1. Делайте снимки с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного вращающимся дисковым блоком и камерой. Включите настройку в соответствии с инструкцией производителя.
  2. Включите программное обеспечение, управляя установкой.
  3. Поскольку это перевернутый микроскоп, поместите затвор с установленными червями на сцену с низким увеличением объектива (5x или 10x) с крышкой вниз.
  4. Настройте световой путь к глазу или видимый режим, который использует освещение от галогенной лампы для пропускаемого света и ртутной дуговой лампы для отраженного света.
  5. Фокусировка и центр червя в поле зрения под ярким полем.
  6. Поместите погружное масло и измените увеличение на 63x (1,4NA / масло) и перефокусировать хвост червя в ярком поле для нейронов PLM.
  7. Включите флуоресценцию ртутной дуговой лампы для кратковременной перефокусировки PLM-нейронов. Поместите правильный набор рефлектора (AF488) в световой контур для визуализации GFP.
  8. Установите микроскоп на получение камеры, направляя световой путь к камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Управление вышеупомянутыми шагами 4-7 через тонкопленочный транзисторный (TFT) экран микроскопа происходит быстро и предотвращает ненужное воздействие освещения. В качестве альтернативы можно управлять освещением, отражателем через программное обеспечение.
  9. После фокусировки PLM-нейрона в поле зрения, в программном интерфейсе выбирают подсветку лазера 488 нм мощностью 30% и экспозицией 300 мс для камеры со значением коэффициента усиления 70 electron Multiplying (EM). В зависимости от выражения репортера измените эти параметры по мере необходимости. Сохраните параметры в качестве конфигурации для последующих сеансов создания образов.
  10. На вкладке «Каналы» хранятся дорожки с определенным освещением и настройками камеры. Выделенный трек позволяет визуализировать в реальном времени, тогда как для получения изображения трек должен быть отмечен галочкой. Выделите канал с brightfield (DIC) для визуализации хвоста червя в рабочем пространстве в реальном времени. Образец фокусируется и центрируется в окне обработки изображений в реальном времени рабочей области.
  11. Выделите канал лазерным возбуждением 488 нм для быстрой фокусировки PLM-нейрона в окне визуализации в реальном времени. После фокусировки начните сбор временных промежутков, задав параметры временных рядов, как указано на следующем шаге.
  12. Используя лазерное освещение 488 нм, постройте эксперимент с временными рядами в течение 2 минут и без временного интервала между кадрами. Чтобы сохранить временные масштабы получения изображения, мы получили только флуоресценцию GFP.
  13. На вкладке Начать эксперимент начните получение. Использование 63-кратного увеличения ограничивает пространственное разрешение до 0,21 мкм, которое сэмплируется камерой с размером пикселя 0,09 мкм. Получите таймлапс со скоростью 3,3 кадра/с для оптимальной выборки события. Покадровое изображение имело 396 таймфреймов, полученных в течение 2 минут. После получения сохраните изображение в формате по умолчанию, к которому позже может получить доступ программное обеспечение по умолчанию или ImageJ.

4. Наблюдение и анализ

  1. Просмотрите получение таймлапса в программном обеспечении по умолчанию или откройте его в Image J через плагин Bioformats.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы описали процесс анализа изображений в Image J.
  2. Установите подключаемый модуль Bioformats в ImageJ.
    1. Кроме того, можно экспортировать файл формата по умолчанию в .tif для обеспечения совместимости файлов в ImageJ. Функция экспорта в ZEN2 приводит к отдельным кадрам изображения в виде дискретных .tif файлов. Мы избегаем этого метода, чтобы предотвратить образование большого количества файлов.
  3. Откройте изображение в формате '.czi' непосредственно в Image J через плагин 'Bioformats'. Изображение откроется в виде стека с несколькими изображениями. Если используется функция «экспорт» программного обеспечения по умолчанию, то воссоздайте изображения как стек из нескольких образов, используя следующий рабочий процесс в ImageJ: Программа ImageJ > меню изображений > стеки подменю > Images To Stack.
  4. Просмотрите изображение как фильм с помощью значка Воспроизвести в левом нижнем углу окна изображения. Кометы можно увидеть как яркие подвижные пунктары в теле клетки и процессы PLM-нейрона. Если кометы видны четко, перейдите к шагу 8, в противном случае выполните шаги 5-7 этого раздела.
  5. Преобразуйте цветовой профиль изображения с помощью таблицы подстановки (LUT) в изображение в градациях серого: программа ImageJ > меню «Изображение» > подменю «Таблицы подстановки» > «Выбор серых».
  6. Инвертировать профиль LUT изображения для удобной визуализации: программа ImageJ > меню «Изображение» > подменю «Таблицы подстановки» > «Инвертировать LUT».
  7. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения для просмотра комет: программа ImageJ > меню «Изображение» > Настроить подменю > Яркость / Контрастность.
    1. Переместите ползунки «Минимум», «Максимум», «Яркость» и «Контрастность» для требуемого масштабирования интенсивности по всему изображению. Мы количественно оценили изображения с кометами, видимыми отчетливо.
  8. Базовая версия ImageJ имеет инструменты запуска, представленные в виде значков. Найдите и щелкните правой кнопкой мыши значок со строкой, чтобы открыть раскрывающееся меню, и выберите сегментированную линию. Нарисуйте сегментированную линию на интересующих областях (ROI) с ее происхождением на теле клетки нейрона или рядом с ней.
    1. Для более поздних соображений сохраните сегментированную линию ROI через менеджер ROI с помощью следующего рабочего процесса: ImageJ > Analyze > Tools > ROI manager > Выберите нарисованную трассировку на изображении и нажмите кнопку Добавить в окне менеджера ROI > Подробнее в окне менеджера ROI > Сохранить.
  9. Перед генерацией кимографа, так как пространственный и временной масштабы различны, уберите масштабирование, чтобы получить измерения в пикселях, используя следующее:
    ImageJ > Анализ > Настройка масштабной > Нажмите, чтобы удалить масштаб > ОК.
  10. С помощью функции «Перелиценция» в раскрывающемся меню «Стеки изображений >» сгенерируйте кимограф. Кимограф представляет собой представление сегментированной roI во времени. Горизонтальная ось представляет расстояние, а вертикальная ось представляет время. Диагональные следы представляют движущиеся кометы. Как правило, кимограф принимает цветовой профиль изображения, в противном случае назначается цветовой профиль, как описано в предыдущих шагах 5-6 для визуализации диагональных следов.
  11. С помощью функции «Прямая линия» в раскрывающемся меню инструмента «Линия» (см. шаг 9 этого раздела) нарисуйте прямые линии над каждой из диагональных трассировок и добавьте их в менеджере ROI.
  12. На вкладке Анализ перейдите в перейти в пункт Задать измерения и выберите Параметры средней интенсивности и ограничивающего прямоугольника для измерения трассировок.
  13. В окне менеджера ROI щелкните Измерить, которое откроет окно Результат, в котором будет выдаваться средняя интенсивность ROI, координаты X и Y трассировок линии, Ширина, Высота, Угол и Длина трассировок линии. Это окно может быть сохранено в формате .csv, а затем импортировано в программу анализа данных.
  14. В программе для работы с электронными таблицами открывается окно результатов со значениями, распределенными по строкам и столбцам. Соответствующими значениями являются ширина, высота и угол трассировки. Ширина дает смещение трассировки, высота дает длительность, а угол представляет вектор. Поскольку значения ширины и высоты находятся в пикселях, умножьте их на пространственный и временной масштабы соответственно для получения стандартных измеримых параметров.
  15. Поскольку левая сторона кимографа находится проксимально к телу клетки, в зависимости от угла, классифицируют кометы на плюс-конец или минус-конец(т.е. вдали от тела клетки или к телу клетки, соответственно). Классифицируйте углы от 1° до -89° и от -91° до -179° как плюс-конец-выход и минус-конец соответственно. Сопоставляйте данные с нескольких кимографов в электронную таблицу для исследования и статистически представляете.

Результаты

В качестве репрезентативного примера мы описали наблюдение in vivo комет EBP в стационарном состоянии и регенерирующими аксонами нейронов PLM. PLM-нейроны расположены в хвостовой области червя с длинным передним отроском, образующий синапс и короткий задний отроск. Нейроны PLM растут в передн?...

Обсуждение

Понимание динамики микротрубочек было ключевым направлением в области исследований цитоскелетов на протяжении многих лет. Микротрубочки претерпевают зародышивание и катастрофу вместе с непрерывным процессом динамической нестабильности44, 45,

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Иши Джина и Эндрю Чисхолма за первоначальную поддержку и штамм, использованный в исследовании. Бактериальный штамм OP50 был коммерчески использован Центром генетики Caenorhabditis (CGC), финансируемым Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы также благодарим Дхармендру Пури за стандартизацию экспериментальных процедур. Исследование финансируется за счет основного гранта Национального центра исследований мозга (при поддержке Департамента биотехнологии правительства Индии), гранта DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (грант No IA/E/18/1/504331) S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (грант No IA/I/13/1/500874) для A.G.-R и гранта От Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB: CRG/2019/002194) для A.G.-R.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CZ18975 worm strainYishi Jin labCZ18975Generated by Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Mounting worms
Dry bath with heating blockNeolabMounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)Blue StarMounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)Polysciences Inc.00876Mounting worms
Test tubesMounting worms
OP50 bacterial strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Worm handling
60mm petri platesPraveen Scientific20440Worm handling
Aspirator/CapillaryVWR53432-921Worm handling
IncubatorPanasonicMIR554EWorm handling
Platinum wireWorm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachmentLeicaM165FCWorm handling
0.3% Sodium ChlorideSigma71376Nematode Growth Medium
0.25% PeptoneT M Media1506Nematode Growth Medium
10mg/mL CholesterolSigmaC8667Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrateSigma223506Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrateSigmaM2773Nematode Growth Medium
2% AgarT M Media1202Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP9791Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP97911X M9 buffer
0.04M Sodium chlorideSigma713761X M9 buffer
0.1M Ammonium chlorideFisher Scientific214051X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrateSigmaS93901X M9 buffer
Glass bottlesBorosilBuffer storage
488 nm laserZeissImaging
5X objectiveZeissImaging
63X objectiveZeissImaging
CameraPhotometricsEvolve 512 DeltaImaging
Computer system for Spinning Disk unitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
Epifluorescence microscopeZeissObserver.Z1Imaging
Halogen lampZeissImaging
Mercury Arc LampZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 softwareZeissImaging
Image J (Fiji Version)Image analysis and processing
Adobe Creative CloudAdobeImage analysis and processing
Computer system for Image AnalysisDellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHzImage processing/Representation

Ссылки

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021)
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8, (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  62. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  63. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  64. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  65. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  66. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  67. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  68. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены