JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

Özet

Nöronlarda, mikrotübül yönelimi, genellikle karışık oryantasyona sahip artı uçlu mikrotübüllere ve dendritlere sahip aksonları tanımlamak için önemli bir değerlendirici olmuştur. Burada, C. elegans'taki dokunmatik nöronların gelişimi ve yenilenmesi sırasında mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz. Mikrotübül uçlarının genetik olarak kodlanmış floresan muhabirlerini kullanarak aksonal mikrotübülleri görüntüledik. Aksotomi sonrasında akson rejenerasyonunu başlatan mikrotübül davranışındaki lokal değişiklikler bu protokol kullanılarak ölçülebilir. Bu test, çeşitli hücresel süreçlerde mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için diğer nöronlara ve genetik geçmişlere uyarlanabilir.

Giriş

Nöronlar dendritler, hücre gövdeleri, aksonlar ve sinapslar gibi özel bölmelere sahip ayrıntılı bir mimariye sahiptir. Nöronal sitoskeleton mikrotübüller, mikrofilamentler ve nörofilamentlerden oluşandır ve farklı organizasyonları nöronal bölmeleri yapısal ve işlevsel olarakdestekler 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Yıllar içinde mikrotübül organizasyonu nöronal polarite ve fonksiyonun önemli bir belirleyicisi olarak tanımlanmıştır. Nöronlar gelişim veya yenilenme sırasında yapısal tadilata tabi tuttukça, mikrotübül dinamikleri ve yönelimi çeşitli nöronal bölmelerin kimliğini, polarize taşınmasını, büyümesini ve gelişimini belirler7. Bu nedenle, nöronal yeniden şekillendirme işlemi ile ilişkili olmak için mikrotübül dinamiklerini ve oryantasyonunu değerlendirmek zorunludur.

Mikrotübüller, dinamik artı uçları ve nispeten istikrarlı eksi uçları11,12olan α ve β Tubulin heterodimerlerinin protofilamentlerinden oluşur. Artı uç kompleksinin ve ilişkili uç bağlama proteinlerinin keşfi, mikrotübül organizasyonunun13. Son bağlayıcı proteinler (EBP) geçici olarak mikrotübüllerin büyüyen artı uçları ile ilişkilidir ve ilişki dinamikleri mikrotübül protofilamentlerinin büyümesi ile ilişkilidir14,15. Artı uç kompleksinin mikrotübül ile sık sık ilişkilendirilmesi ve ayrışması nedeniyle, GFP etiketli EBP'nin nokta yayma işlevi bir timelapse filmi15,16'dabir "kuyruklu yıldız" olarak görünür. Memelinöronlarında öncü gözlemden bu yana16, floresan proteinlerle etiketlenmiş son bağlayıcı proteinler, farklı model sistemleri ve nöron tipleri 17 , 18 ,19, 20 ,21,22,23arasında mikrotübül dinamiklerini belirlemek için kullanılmıştır.

Basit sinir sistemi ve şeffaf gövdesi nedeniyle, C. elegans geliştirme ve rejenerasyon sırasında nöronal remodeling çalışmak için mükemmel bir model sistemi olduğunu kanıtlamıştır vivo. Burada, C. elegans'taki dokunmatik nöronların gelişimi ve yenilenmesi sırasında mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz. Genetik olarak kodlanmış EBP-2::GFP kullanarak, PLM nöronunda mikrotübülleri görüntüledik, bu nöronun iki farklı nötroritinde mikrotübüllerin polaritesini belirlememizi sağladı24. Bu yöntem, EBP kuyruklu yıldızlarının farklı hücresel bağlamlardaki mikrotübül dinamiklerinin bir ölçüsü olarak gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin verir, örneğin aksotomi sonrası akson yenilenmesini başlatan mikrotübül davranışındaki lokal değişiklikler protokolümüz kullanılarak değerlendirilebilir. Bu test, çeşitli hücre tiplerinde ve genetik geçmişlerde çeşitli hücresel süreçlerde mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için uyarlanabilir.

Protokol

1. Muhabir gerginliği: Kültür ve bakım

NOT: PLM nöronlarındaki mikrotübül dinamiklerini ve oryantasyonunu ölçmek için, dokunmatik nörona özgü promotör mec-4(juIs338 alele) 18,25,26altında EBP-2::GFP'yi ifade eden solucan suşunu kullandık. Bu suş için standart solucan kültürü ve bakım yöntemleri kullanıyoruz27.

  1. Nematod Büyüme Ortamını (3,0 g/L sodyum klorür, 2,5 g/L pepton, 20,0 g/L agar, 10 mg/L kolesterol (10 mg/mL'lik bir stok çözeltisinden seyreltilmiş) suya hazırlayın ve karışımı otoklavlayın.
  2. Karışımı 1 mM kalsiyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat ve 25,0 mM potasyum fosfat monobasik pH 6.0 ile takviye etmeden önce 10-15 dakika kısa bir süre soğutun.
  3. Karışımın yaklaşık 9 mL'sini steril bir dağıtıcı kullanarak 60 mm Petri kaplarına dökün, ardından oda sıcaklığında ve steril koşullarda bir gün boyunca saklayın ve daha sonra 4 °C'de saklayın.
  4. 50 mL B Suyu (5.0 g/L sodyum klorür, 10.0 g/L Bacto-Tryptone) hazırlayın, otoklav ve tek bir Escherichia coli kolonisi (OP50 suşu) ile aşılamadan önce soğutun.
  5. Bakterileri 37 °C'de 12 saat boyunca kültüre edin. Soğuduğu NGM plakalarını tohumlama için oda sıcaklığına getirin ve sterilize edilmiş bir cam serpme yağı kullanarak NGM plakasına OP50 bakterisi sürün.
  6. Aşılanmış NGM plakalarını 12 saat boyunca 37 ° C'de tutun, bu da C. eleganlarınkültleşmesi için bakteri çimlerinin oluşmasına izin verecektir. Bu plakalar kullanıma kadar 20 °C'lik bir inkübatörde saklanabilir.
  7. Tohumlu NGM plakalarındaki transgenik gerilimi arkalayın.
  8. Alev üzerine bir platin tel çekme sterilize ve taze tohumlu bir plakaya transfer için 20-25 gravid yetişkin hermafroditleri seçin.
  9. Aktarıldıktan sonra, plakayı 1 saat boyunca 20 °C'lik bir inkübatöre kaydırın. Sonra, yetişkinleri bu plakalardan çıkarın. Bu tabaklar artık yaşla eşleşen yumurtalar içerecektir.
  10. Plakaları, bu durumda yumurtlamadan 43,5 saat sonra L4 aşaması olan gelişim aşamasına ulaşana kadar yetiştirme için 20 ° C inkübatörüne kaydırın. Daha fazla solucan için, kalabalığı önlemek için birden fazla plakayı arkalayın.
  11. İstenilen gelişim aşamasında, bu solucanlar EBP-2::GFP kuyruklu yıldızlarının görüntülenmesi için monte edilebilir.

2. Örnek hazırlama: EBP-2 kuyruklu yıldızlarının görüntülenmesi için solucanların montajı

NOT: PLM nöronlarındaki EBP kuyruklu yıldızlarının canlı gözlemini sağlamak için, solucanları nöronun fizyolojisini tehlikeye atmayacak şekilde hareketliliklerini en aza indirmek için agarose pedlerine monte ettik. Çeşitli hareketsizleştirme yöntemleri arasında, ticari olarak kolayca mevcut olan 0,1 μm Polistiren boncuk çözeltisini seçtik. Özellikle EBP-2::GFP gözlemi için kullanılan montaj prosedürünü özetledik.

  1. 2 mL 1x M9 tamponda (0,02 M KH 2 PO4, 0,02 MNa2HPO4 , 0,008 M NaCl, 0,02 M NH 4 Cl) 5 mL cam test tüpünde 0,2 g agarose eriterek%10agarose çözeltisi hazırlayın. Bu test tüpü, agarose'u kullanıma kadar erimiş durumda tutan bir ısıtma bloğuna kolayca sığabilir.
  2. Geniş ağızlı bir damlalık kullanarak, bu erimiş agarozun bir damlalarını (yaklaşık 100 μL) 35 mm x 25 mm boyutlarda temiz bir cam kaydırağın üzerine dağıtın.
  3. Erimiş durumdayken, cam slaytlar arasında agarose ince bir film oluşturmak için başka bir cam slayt ile damla basın. Agarose, yaklaşık 30 saniyede yaklaşık 0,5 - 1,0 mm kalınlığında bir film olarak katılaştır.
  4. Agarose katılaştıktan sonra, alt kaydırağı baskın olmayan elde ve üst slaytı baskın elde tutun. Agarose pad'in iki slaytlardan birine yapışması sonucu alt kaydırağı sabit tutarken üst kaydırağı yukarı çevirin.
  5. Oluşan agarose ped kapak kılıfı boyutundan (18 mm x 18 mm) daha büyükse, kapak kapağının düzgün yerleştirilmesini sağlamak için gerekli boyutları elde etmek için pedinin kenarlarını kesin. Bu agarose pedler hemen kullanım içindir ve saklanmamalıdır.
  6. Agarose pedi nemli ve montaj için uygun pürüzsüz bir yüzey için görsel olarak inceleyin. Agarose ped havaya maruz kalırsa ve kurursa, agarose pedinin yüzeyi buruşuk görünür. Böyle bir senaryoda, bu bölümün 2-6 adımlarında belirtildiği gibi taze agarose ped hazırlayın.
  7. Agarose ped üzerine montaj ortamı olarak 2 μL 0,1 μm polistiren boncuk çözeltisi koyun.
  8. Platin tel çekme kullanarak 3-4 solucan seçin ve bunları unseeded NGM plakasına kaydırın. Bu işlem, montaj sırasında hareketsizleşmeyi engelleyen yüzey bakterilerinin uzaklaştırılmasını sağlar.
  9. Solucanlar yüzey bakterilerinden çıktıktan sonra, platin tel çekme kullanarak monte etmek için alın ve agarose pedi üzerindeki polistiren boncuk damlasına yeniden kullanın.
  10. Dikkatlice, solucanların üzerine 18 mm x 18 mm'lik bir kapak kılıfı yerleştirin. Monte edilen solucanların tahliyesini önlemek için, yerleştirildikten sonra kapak sapını hareket ettirmeyin.
  11. Hazırlanan slaydı görüntüleme için mikroskop üzerine monte edin.

3. Görüntüleme kurulumu ve edinimi

NOT: EBP kuyrukluyıldızları, C. elegans16,18'inmemeli ve PLM nöronlarında gözlendiği gibi yaklaşık0,22 μm/ s hız ile seyahat eder. Nyquist kriterleri28'egöre zaman atlamalı alımda olayları en iyi şekilde örneklemek için sırasıyla 0,09 μm ve 0,43 s uzaysal ve zamansal ölçekler gereklidir. Fototoksisi veya fotobleachingin önlenmesi için Spinning Disk alımını kullandık. Görüntüleme kurulum ve alım ayarlarımızı aşağıda açıklamış bulunuyoruz.

  1. Dönen disk ünitesi ve kamera ile donatılmış ters bir mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın. Üreticinin talimatına göre kurulumu açın.
  2. Kurulumu denetleyen yazılımı açın.
  3. Bu ters bir mikroskop olduğundan, takılı solucanlarla birlikte kaydırağı, kapak aşağı bakacak şekilde düşük büyütme hedefi (5x veya 10x) ile sahneye yerleştirin.
  4. Yansıyan ışık için iletilen ışık ve cıva ark lambası için halojen lambadan aydınlatma kullanan göze veya görünür moda giden ışık yolunu ayarlayın.
  5. Parlak alanın altındaki görüş alanına bir solucanı odakla ve ortala.
  6. Daldırma yağını koyun ve büyütmeyi 63x (1.4NA / Yağ) olarak değiştirin ve solucan kuyruğunu PLM nöronları için parlak alanda yeniden odaklayın.
  7. PLM nöronlarının kısa bir yeniden odaklama için cıva ark lambasının floresanını açın. GFP'nin görselleştirilmesi için doğru reflektör setini (AF488) ışık yoluna yerleştirin.
  8. Işık yolunu kameraya yönlendirerek mikroskobu kamera alımına ayarlayın.
    NOT: Yukarıda belirtilen adımların mikroskobun İnce Film Transistörü (TFT) ekranından 4-7'ye kadar kontrol edilmesi hızlıdır ve aydınlatmaya gereksiz yere maruz kalmayı önler. Alternatif olarak, aydınlatmayı, reflektörün yazılım aracılığıyla kontrol edin.
  9. PLM nöronunun görüş alanına odaklanmasından sonra, yazılım arayüzünde% 30 güç ve Elektron Çarpma (EM) kazanç değeri 70 ile kamera için 300 ms pozlama ile 488 nm lazerin aydınlatmasını seçin. Muhabir ifadesine bağlı olarak, bu parametreleri gerektiği gibi değiştirebilir. Ayarları sonraki görüntüleme oturumları için bir yapılandırma olarak depolayın.
  10. Kanallar sekmesi, parçaların her biri belirli bir aydınlatma ve kamera ayarıyla depolar. Vurgulanan parça canlı bir görselleştirme sağlarken, parçanın işaretlenmesi gereken bir görüntü elde etmek için. Çalışma alanında solucanın kuyruğunun canlı görselleştirilmesi için brightfield (DIC) içeren bir kanalı vurgulayın. Örnek, çalışma alanının canlı görüntüleme penceresinde odaklanmış ve ortalanmıştır.
  11. PLM nöronunun canlı görüntüleme penceresinde hızlı bir şekilde odaklanması için kanalı 488 nm lazer ekscitasyon ile vurgulayın. Odaklandıktan sonra, bir sonraki adımda belirtildiği gibi zaman serisi parametrelerini ayarlayarak zaman atlamalı alıma başlayın.
  12. 488 nm lazer aydınlatma kullanarak, 2 dakika boyunca zaman serileri ile bir deney ayarlayın ve çerçeveler arasında zaman aralığı yok. Görüntü alımının zamansal ölçeklerini korumak için sadece GFP floresanını satın aldık.
  13. Denemeyi Başlat sekmesini kullanarak edinme işlemine başlayın. 63x büyütme kullanmak, uzamsal çözünürlüğü kamera tarafından 0,09 μm piksel boyutunda örneklenen 0,21 μm ile sınırlar. Olayı en iyi şekilde örneklemek için 3,3 kare/sn'de bir zaman atlamalı elde edin. Zaman atlamalı görüntü, 2 dakikalık bir süre boyunca elde edilen 396 zaman dilimine sahipti. Satın alma işleminden sonra, görüntüyü daha sonra varsayılan yazılım veya ImageJ tarafından erişilebilen varsayılan biçimde kaydedin.

4. Gözlem ve analiz

  1. Varsayılan yazılımda zaman uyumlu alımını önizleyin veya Bioformats eklentisi aracılığıyla Image J'de açın.
    NOT: Görüntü analizi sürecini Image J'de anlattık.
  2. ImageJ'de Bioformats eklentisini yükleyin.
    1. Alternatif olarak, ImageJ'de dosya uyumluluğu için varsayılan biçim dosyasını .tif verin. ZEN2'deki dışa aktarma işlevi, görüntünün ayrık .tif dosyaları olarak tek tek karelerine neden olur. Çok sayıda dosyanın oluşumunu önlemek için bu yöntemden kaçınıyoruz.
  3. Görüntüyü '.czi' formatında doğrudan 'Bioformats' eklentisi aracılığıyla Image J'de açın. Görüntü çok görüntülü bir yığın olarak açılır. Varsayılan yazılımın "dışa aktar" işlevini kullanıyorsanız, ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stacks'teki aşağıdaki iş akışını kullanarak görüntüleri çok görüntülü bir yığın olarak yeniden düzenleyin.
  4. Görüntü penceresinin sol alt köşesindeki Oynat simgesini kullanarak görüntüyü film olarak önizleyin. Kuyruklu yıldızlar, PLM nöronunun hücre gövdesinde ve süreçlerinde parlak mobil nokta olarak görülebilir. Kuyruklu yıldızlar net bir şekilde görünüyorsa, 8.
  5. Arama Tablosu'nu (LUT) kullanarak görüntünün renk profilini gri tonlamalı görüntüye dönüştürün: ImageJ programı > Görüntü menüsü > Arama Tabloları alt menüsü > Grileri Seç.
  6. Kolay görselleştirme için görüntünün LUT profilini ters çevirin: ImageJ programı > Görüntü menüsü > Arama Tabloları alt menüsü > INVERT LUT.
  7. Kuyrukluyıldızları görmek için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın: ImageJ programı > Görüntü menüsü > Parlaklık / Kontrast > alt menüleri ayarlayın.
    1. Görüntüdeki yoğunlukların istenen ölçeklenerek ölçeklenerek Minimum, Maksimum, Parlaklık ve Karşıtlık kaydırıcılarını hareket ettirın. Görüntüleri kuyrukluyıldızlarla belirgin bir şekilde ölçtük.
  8. ImageJ'in temel sürümünde simgeler olarak temsil edilen başlangıç araçları vardır. Açılan menüyü açmak için çizgi içeren simgeyi bulun ve sağ tıklatın ve Parçalı satırıseçin. Parçalanmış çizgiyi, kaynağı nöronun hücre gövdesi üzerinde veya yakınında olan ilgi alanlarına (ROI) çizin.
    1. Daha sonraki hususlar için, aşağıdaki iş akışını kullanarak segmentlere ayrılmıştı satır yatırım getirisini yatırım getirisi yöneticisi aracılığıyla kaydedin: ImageJ > > Araçları Analiz > YATıRıM Getirisi yöneticisi > Görüntüde çizilen izlemeyi seçin ve YATıRıM YÇ yöneticisi penceresinde Ekle'yi tıklatın > Kaydet'> yatırım getirisi yöneticisi penceresinde Daha Fazla .
  9. Kimografı oluşturmadan önce, uzamsal ve zamansal ölçekler farklı olduğundan, aşağıdakileri kullanarak piksel cinsinden ölçümleri elde etmek için ölçeklendirmeyi kaldırın:
    ImageJ > Analiz et > Ölçek ayarla > Ölçeği kaldırmak için tıklatın > Tamam.
  10. Resim > Yığınları açılır menüsünün altındaki Yeniden Kaydır işlevini kullanarak bir kimograf oluşturun. Kimograf, segmentlere ayrılmıştı yatırım getirisinin zaman içinde bir temsilidir. Yatay eksen mesafeyi, dikey eksen ise saati temsil eder. Çapraz izler hareketli kuyrukluyıldızları temsil eder. Genellikle, kimograf görüntünün renk profilini alır, aksi takdirde çapraz izlemelerin görselleştirilmesi için önceki 5-6 adımlarında açıklandığı gibi bir renk profili atar.
  11. Çizgi aracının açılan menüsündeki Düz çizgi işlevini kullanarak (bu bölümün 9. adımına bakın) çapraz izlemelerin her birinin üzerine düz çizgiler çizin ve bunları yatırım getirisi yöneticisine ekler.
  12. Çözümle sekmesinin altında Ölçümleri Ayarla'ya gidin ve izlemeleri ölçmek için Ortalama Yoğunluk ve Sınırlayıcı Dikdörtgen parametrelerini seçin.
  13. Yatırım getirisi yöneticisi penceresinde, yatırım getirisinin ortalama yoğunluğunu, çizgi izlemelerinin X ve Y koordinatlarını, genişlik, yükseklik, açı ve çizgi izlemelerinin uzunluğunu verecek bir Sonuç penceresi açacak Ölçü'nün üzerine tıklayın. Bu pencere .csv biçimi olarak kaydedilebilir ve daha sonra bir veri çözümleme programına aktarılabilir.
  14. Elektronik tablo programında, sonuçlar penceresi satır ve sütunlar halinde dağıtılan değerlerle açılır. İlgili değerler, izlerin genişliği, yüksekliği ve açısıdır. Genişlik iz'in yer değiştirmesini verir, yükseklik süreyi verir ve açı vektörü temsil eder. Genişlik ve yükseklik değerleri piksel cinsinden olduğundan, standart ölçülebilir parametreleri elde etmek için bunları sırasıyla uzamsal ve zamansal ölçeklerle çarpın.
  15. Kimografın sol tarafı hücre gövdesine proksimal olduğundan, açıya bağlı olarak, kuyrukluyıldızları artı-son veya eksi-sonu olarak sınıflandırın (yani, sırasıyla hücre gövdesinden uzağa veya hücre gövdesine doğru). Açıları sırasıyla 1° ila -89° ve -91° ila -179° arasında artı-bitiş ve eksi-bitiş olarak sınıflandırın. Bir çalışma için bir elektronik tablodaki birden çok kimograftan gelen verileri harmanla ve istatistiksel olarak temsil edin.

Sonuçlar

Temsili bir örnek olarak, PLM nöronlarının sabit durumundaki ve yenileyici aksonlarındaki EBP kuyruklu yıldızlarının in vivo gözlemini tanımladık. PLM nöronları, bir sinaps ve kısa bir posterior işlem oluşturan uzun bir ön işlemle solucanın kuyruk bölgesinde bulunur. PLM nöronları epidermisin yakınında ön-arka yönde büyür ve solucanlardaki nazik dokunma hissinin sorumlusudur. Basitleştirilmiş yapıları ve görüntüleme ve mikrocerrahiye karşı alametleri nedeniyle PLM nöronları mikrot?...

Tartışmalar

Mikrotübül dinamiklerini anlamak, yıllar boyunca sitoskeletal araştırma alanında önemli bir odak noktası olmuştur. Mikrotübüller, sürekli dinamik dengesizlik süreci ile birlikte çekirdeklenme ve felakete uğrar44,45,46,47. Bu bilgilerin çoğu, serbest vs polimerize tübulinin ışık saçılım okumaları, floresan tübulinden mikrotübül büyüme ta...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

İlk destek ve çalışmada kullanılan suş için Yishi Jin ve Andrew Chisholm'a teşekkür ederiz. OP50 bakteriyel suş, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetics Center'dan (CGC) ticari olarak yararlanmıştır. Dharmendra Puri'ye deneysel prosedürlerin standardizasyonu için de teşekkür ederiz. Çalışma, Ulusal Beyin Araştırma Merkezi'nin temel hibesi (Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklenmektedir, Hindistan Govt. ), DBT/Wellcome Trust India Alliance Erken Kariyer Hibesi (Grant # IA/E/18/1/504331) S.D.'ye, Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/ I/ 13/ 1 / 500874) A.G.-R'ye ve Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'ndan (SıRP: CRG/2019/002194) 'a A.G.-R.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
CZ18975 worm strainYishi Jin labCZ18975Generated by Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Mounting worms
Dry bath with heating blockNeolabMounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)Blue StarMounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)Polysciences Inc.00876Mounting worms
Test tubesMounting worms
OP50 bacterial strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Worm handling
60mm petri platesPraveen Scientific20440Worm handling
Aspirator/CapillaryVWR53432-921Worm handling
IncubatorPanasonicMIR554EWorm handling
Platinum wireWorm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachmentLeicaM165FCWorm handling
0.3% Sodium ChlorideSigma71376Nematode Growth Medium
0.25% PeptoneT M Media1506Nematode Growth Medium
10mg/mL CholesterolSigmaC8667Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrateSigma223506Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrateSigmaM2773Nematode Growth Medium
2% AgarT M Media1202Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP9791Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP97911X M9 buffer
0.04M Sodium chlorideSigma713761X M9 buffer
0.1M Ammonium chlorideFisher Scientific214051X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrateSigmaS93901X M9 buffer
Glass bottlesBorosilBuffer storage
488 nm laserZeissImaging
5X objectiveZeissImaging
63X objectiveZeissImaging
CameraPhotometricsEvolve 512 DeltaImaging
Computer system for Spinning Disk unitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
Epifluorescence microscopeZeissObserver.Z1Imaging
Halogen lampZeissImaging
Mercury Arc LampZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 softwareZeissImaging
Image J (Fiji Version)Image analysis and processing
Adobe Creative CloudAdobeImage analysis and processing
Computer system for Image AnalysisDellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHzImage processing/Representation

Referanslar

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021)
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8, (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  62. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  63. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  64. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  65. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  66. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  67. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  68. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır