In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Riepilogo

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

Abstract

Nei neuroni, l'orientamento dei microtubuli è stato un valutatore chiave per identificare gli assoni che hanno microtubuli e dendriti plus-end che generalmente hanno un orientamento misto. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificati di punte di microtubuli, abbiamo ripreso i microtubuli assonali. I cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l'assotomia possono essere quantificati utilizzando questo protocollo. Questo test è adattabile ad altri neuroni e background genetici per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari.

Introduzione

I neuroni hanno un'architettura elaborata con compartimenti specializzati come dendriti, corpi cellulari, assoni e sinapsi. Il citoscheletro neuronale è costituito dai microtubuli, microfilamenti e neurofilamenti e la loro organizzazione distinta supporta i compartimenti neuronali strutturalmente e funzionalmente^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10} . Nel corso degli anni, l'organizzazione dei microtubuli è stata identificata come un determinante chiave della polarità e della funzione neuronale. Mentre i neuroni subiscono un rimodellamento strutturale durante lo sviluppo o la rigenerazione, la dinamica e l'orientamento dei microtubuli determinano l'identità, il trasporto polarizzato, la crescita e lo sviluppo di vari compartimenti neuronali⁷. È quindi imperativo valutare la dinamica dei microtubuli e l'orientamento in vivo per correlarsi con il processo di rimodellamento neuronale.

I microtubuli sono composti da protofilamenti di eterodimeri di α e β tubulina con estremità più dinamiche e estremità meno relativamente stabili^11,12. La scoperta del complesso plus tip e delle proteine leganti l'estremità associate hanno permesso una piattaforma per valutare l'organizzazione dei microtubuli¹³. Le proteine leganti l'estremità (EBP) si associano transitoriamente alle estremità più crescenti del microtubulo e le loro dinamiche di associazione sono correlate alla crescita dei protofilamenti dei microtubuli^14,15. A causa della frequente associazione e dissociazione del complesso plus tip con il microtubulo, la funzione di diffusione puntuale dell'EBP con tag GFP appare come una "cometa" in un film timelapse^15,16. Dall'osservazione pionieristica nei neuroni dei mammiferi^16,le proteine leganti le estremità marcate con proteine fluorescenti sono state utilizzate per determinare la dinamica dei microtubuli in diversi sistemi modello e tipi di neuroni^{17,18, 19,20,21,22,23.}

Grazie al suo semplice sistema nervoso e al corpo trasparente, C. elegans ha dimostrato di essere un eccellente sistema modello per studiare il rimodellamento neuronale durante lo sviluppo e la rigenerazione in vivo. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando EBP-2::GFP geneticamente codificato, abbiamo ripreso i microtubuli nel neurone PLM, che ci ha permesso di determinare la polarità dei microtubuli in due diversi neuriti di questo neurone²⁴. Questo metodo consente l'osservazione e la quantificazione delle comete EBP come misura della dinamica dei microtubuli in diversi contesti cellulari, ad esempio, i cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l'assotomia possono essere valutati utilizzando il nostro protocollo. Questo test può essere adattato per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari in diversi tipi di cellule e background genetici.

Protocollo

1. Ceppo reporter: cultura e manutenzione

NOTA: Per misurare la dinamica e l'orientamento dei microtubuli nei neuroni PLM, abbiamo usato il ceppo worm che esprime EBP-2::GFP sotto il promotore specifico del neurone tattile mec-4 ( allelejuIs338) ^18,25,26. Per questo ceppo utilizziamo metodi standard di coltura e manutenzione dei vermi²⁷.

1. Preparare il mezzo di crescita del nematode (3,0 g/L di cloruro di sodio, 2,5 g/L di peptone, 20,0 g/L di agar, 10 mg/L di colesterolo (diluito da una soluzione stock di 10 mg/ml)) in acqua e in autoclave la miscela.
2. Raffreddare brevemente la miscela per 10-15 minuti prima di integrarla con 1 mM di cloruro di calcio, 1 mM di solfato di magnesio e 25,0 mM di fosfato di potassio monobasico pH 6,0.
3. Versare circa 9 ml del composto in piastre di Petri da 60 mm utilizzando un dispenser sterile seguito da conservazione a temperatura ambiente e condizioni sterili per un giorno e successiva conservazione a 4 °C.
4. Preparare 50 ml di brodo B (5,0 g/L di cloruro di sodio, 10,0 g/L di bacto-triptone), in autoclave e raffreddarlo prima di inoculare con una singola colonia di Escherichia coli (ceppo OP50).
5. Colturare i batteri a 37 °C per 12 ore. Portare le piastre NGM refrigerate a temperatura ambiente per la semina e utilizzando uno spandi vetro sterilizzato fare uno striscio di batteri OP50 sulla piastra NGM.
6. Mantenere le piastre NGM inoculate a 37 °C per 12 ore, il che consentirà la formazione di un prato batterico per la coltivazione di C. elegans. Queste piastre possono essere conservate in un incubatore a 20 °C fino all'uso.
7. Allevare il ceppo transgenico sulle piastre NGM seminate.
8. Sterilizzare un filo di platino sulla fiamma e raccogliere 20-25 ermafroditi adulti gravidi per il trasferimento in un piatto appena seminato.
9. Una volta trasferito, spostare la piastra su un incubatore a 20 °C per 1 ora. Quindi, estrarre gli adulti da questi piatti. Queste piastre ora conterranno uova che sono abbinate all'età.
10. Spostare le piastre nell'incubatrice a 20 °C per l'allevamento fino a raggiungere lo stadio di sviluppo di interesse che in questo caso è lo stadio L4 a 43,5 ore dopo la deposizione delle uova. Per più vermi, retroguardare più piastre per evitare l'affollamento.
11. Nella fase di sviluppo desiderata, questi vermi possono essere montati per l'imaging delle comete EBP-2::GFP.

2. Preparazione del campione: montaggio di vermi per l'imaging di comete EBP-2

NOTA: Per consentire l'osservazione dal vivo delle comete EBP nei neuroni PLM, abbiamo montato i vermi su cuscinetti di agarose per ridurre al minimo la loro mobilità senza compromettere la fisiologia del neurone. Tra i vari metodi di immobilizzazione, abbiamo scelto la soluzione di perline di polistirene da 0,1 μm prontamente disponibile in commercio. Abbiamo delineato la procedura di montaggio utilizzata specificamente per l'osservazione EBP-2::GFP.

1. Preparare una soluzione di acarosio al 10% fondendo 0,2 g di acarosio in 2 mL di 1 tampone M9 (0,02 M KH₂PO₄, 0,02 M Na₂HPO₄, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH₄Cl) in una provetta di vetro da 5 mL su una fiamma. Questa provetta può facilmente inserirsi in un blocco riscaldante che mantiene l'agarose allo stato fuso fino all'uso.
2. Utilizzando un contagocce a bocca larga, erogare una goccia (circa 100 μL) di questo agarosio fuso su un vetrino pulito di dimensioni 35 mm x 25 mm.
3. Mentre è allo stato fuso, premere la goccia con un'altra diapositiva di vetro per creare un film sottile dell'agarose tra le diapositive di vetro. L'agarose si solidifica come un film di circa 0,5 - 1,0 mm di spessore in circa 30 secondi.
4. Una volta che l'agarose si solidifica, tenere la diapositiva inferiore nella mano non dominante e la diapositiva superiore nella mano dominante. Capovolgere la diapositiva superiore tenendo ferma la diapositiva inferiore a seguito della quale il cuscinetto di agarose si attacca a una delle due diapositive.
5. Se il tampone di agarose formato è più grande della dimensione del coverslip (18 mm x 18 mm), tagliare i bordi del pad per ottenere le dimensioni richieste per garantire il corretto posizionamento del coverslip. Questi tamponi di agarose sono per l'uso immediato e non devono essere conservati.
6. Ispezionare visivamente il tampone di agarosio per una superficie liscia che sia umida e adatta al montaggio. Se il tampone di agarose è esposto all'aria e si asciuga, la superficie del tampone di agarose appare rugosa. In tale scenario, preparare un tampone di agarose fresco come menzionato nei passaggi 2-6 di questa sezione.
7. Sul tampone di agarose, mettere 2 μL di soluzione di polistirene da 0,1 μm come mezzo di montaggio.
8. Scegli 3-4 vermi usando un plettro di filo di platino e spostali su una piastra NGM non semi. Questo processo garantisce la rimozione dei batteri superficiali che ostacolano l'immobilizzazione durante il montaggio.
9. Una volta che i vermi strisciano fuori dai loro batteri superficiali, raccoglierli per il montaggio usando un plettro di filo di platino e risospese nella goccia di perline di polistirolo sul tampone di agarose.
10. Con attenzione, posizionare un coperchio di 18 mm x 18 mm sui vermi. Per prevenire l'eviscerazione dei vermi montati, non spostare il coperchio dopo il posizionamento.
11. Montare il vetrino preparato sul microscopio per l'imaging.

3. Configurazione e acquisizione dell'imaging

NOTA: Le comete EBP viaggiano con una velocità approssimativa di 0,22 μm/s come osservato nei neuroni mammiferi e PLM di C. elegans^16,18. Per campionare in modo ottimale gli eventi in un'acquisizione time lapse secondo i criteri di Nyquist²⁸, sono necessarie scale spaziali e temporali di 0,09 μm e 0,43 s, rispettivamente. Per la prevenzione della fototossicità o del fotosableaching, abbiamo utilizzato l'acquisizione Spinning Disk. Di seguito sono descritte le impostazioni di configurazione e acquisizione delle immagini.

1. Cattura le immagini utilizzando un microscopio invertito dotato di un'unità disco rotante e di una fotocamera. Attivare la configurazione secondo le istruzioni del produttore.
2. Attivare il software che controlla la configurazione.
3. Poiché si tratta di un microscopio invertito, posizionare il vetrino con i vermi montati sul palco con un obiettivo a basso ingrandimento (5x o 10x) con il coperchio rivolto verso il basso.
4. Impostare il percorso della luce verso la modalità occhio o visibile che utilizza l'illuminazione della lampada alogena per la luce trasmessa e della lampada ad arco di mercurio per la luce riflessa.
5. Mettere a fuoco e centrare un worm nel campo visivo sotto il campo luminoso.
6. Metti l'olio di immersione e cambia l'ingrandimento a 63x (1.4NA /Olio) e rifocalizza la coda del verme nel campo luminoso per i neuroni PLM.
7. Accendere la fluorescenza della lampada ad arco di mercurio per una breve rifocalizzazione dei neuroni PLM. Posizionare il set corretto di riflettore (AF488) nel percorso della luce per la visualizzazione di GFP.
8. Impostare il microscopio sull'acquisizione della fotocamera dirigendo il percorso della luce verso la fotocamera.
   NOTA: il controllo dei passaggi 4-7 di cui sopra attraverso lo schermo TFT (Thin Film Transistor) del microscopio è rapido e impedisce un'esposizione non necessaria all'illuminazione. In alternativa, controllare l'illuminazione, riflettore attraverso il software.
9. Dopo la messa a fuoco del neurone PLM nel campo visivo, nell'interfaccia software selezionare l'illuminazione del laser a 488 nm con potenza del 30% e 300 ms di esposizione per la fotocamera con valore di guadagno ELECTRON Multiplying (EM) 70. A seconda dell'espressione del reporter, variare questi parametri in base alle esigenze. Memorizzare le impostazioni come configurazione per le sessioni di imaging successive.
10. La scheda Canali memorizza le tracce ciascuna con un'illuminazione e un'impostazione della telecamera specifiche. La traccia evidenziata consente una visualizzazione dal vivo, mentre per acquisire un'immagine la traccia deve essere spuntata. Evidenziare un canale con brightfield (DIC) per la visualizzazione in tempo reale della coda del worm nell'area di lavoro. L'esempio è focalizzato e centrato nella finestra di creazione di immagini dal vivo dell'area di lavoro.
11. Evidenzia il canale con eccitazione laser a 488 nm per una rapida messa a fuoco del neurone PLM nella finestra di imaging dal vivo. Una volta focalizzato, inizia l'acquisizione time lapse impostando i parametri della serie temporale come indicato nel passaggio successivo.
12. Utilizzando l'illuminazione laser a 488 nm, impostare un esperimento con serie temporali per 2 minuti e nessun intervallo di tempo tra i fotogrammi. Per mantenere le scale temporali di acquisizione delle immagini, abbiamo acquisito solo la fluorescenza GFP.
13. Utilizzando la scheda Avvia esperimento, iniziare l'acquisizione. L'utilizzo di un ingrandimento 63x limita la risoluzione spaziale a 0,21 μm che viene campionata dalla fotocamera alla dimensione dei pixel di 0,09 μm. Acquisire un intervallo di tempo a 3,3 fotogrammi/s per campionare in modo ottimale l'evento. L'immagine time lapse aveva 396 intervalli di tempo acquisiti per una durata di 2 minuti. Dopo l'acquisizione, salvare l'immagine nel formato predefinito, a cui è possibile accedere successivamente dal software predefinito o ImageJ.

4. Osservazione e analisi

1. Visualizza in anteprima l'acquisizione del timelapse nel software predefinito o aprilo nell'immagine J tramite il suo plug-in Bioformats.
   NOTA: abbiamo descritto il processo di analisi delle immagini nell'immagine J.
2. Installare il plug-in Bioformats in ImageJ.
   1. In alternativa, esportare il file di formato predefinito in .tif per la compatibilità dei file in ImageJ. La funzione di esportazione in ZEN2 genera singoli fotogrammi dell'immagine come file .tif discreti. Evitiamo questo metodo per prevenire la formazione di un gran numero di file.
3. Apri l'immagine in formato '.czi' direttamente nell'immagine J attraverso il suo plugin 'Bioformats'. L'immagine si apre come una pila di più immagini. Se si utilizza la funzione "esporta" del software predefinito, ricostituire le immagini come stack multi-immagine utilizzando il seguente flusso di lavoro in ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stack.
4. Visualizza l'anteprima dell'immagine come filmato utilizzando l'icona Riproduci nell'angolo in basso a sinistra della finestra dell'immagine. Le comete possono essere viste come punti di puntura mobili luminosi nel corpo cellulare e nei processi del neurone PLM. Se le comete sono visibili chiaramente, procedere al passaggio 8 altrimenti seguire i passaggi 5-7 di questa sezione.
5. Convertire il profilo colore dell'immagine utilizzando la tabella di ricerca (LUT) in un'immagine in scala di grigi: il programma ImageJ > menu Immagine > sottomenu Tabelle di ricerca > Seleziona grigi.
6. Inverti il profilo LUT dell'immagine per una facile visualizzazione: il programma ImageJ > menu Immagine > sottomenu Tabelle di ricerca > Inverti LUT.
7. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine per vedere le comete: il programma ImageJ > menu Immagine > sottomenu Regola > Luminosità/Contrasto.
   1. Spostare i cursori minimo, massimo, luminosità e contrasto per il ridimensionamento desiderato delle intensità nell'immagine. Abbiamo quantificato le immagini con comete visibili distintamente.
8. La versione base di ImageJ ha strumenti di avvio rappresentati come icone. Individua e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'icona con una linea per aprire un menu a discesa e seleziona la linea segmentata. Disegna la linea segmentata sulle regioni di interesse (ROI) con la sua origine su o vicino al corpo cellulare del neurone.
   1. Per considerazioni successive, salvare il ROI della linea segmentata tramite roi manager utilizzando il seguente flusso di lavoro: ImageJ > Analizza > Strumenti > ROI manager > Selezionare la traccia disegnata nell'immagine e fare clic su Aggiungi nella finestra ROI manager > Altro nella finestra ROI manager > Salva.
9. Prima di generare il kymograph, poiché le scale spaziali e temporali sono diverse, rimuovere il ridimensionamento per ottenere le misurazioni in pixel utilizzando quanto segue:
   ImageJ > Analizza > Imposta scala > Fare clic per rimuovere la scala > OK.
10. Utilizzando la funzione Reslice nel menu a discesa Image > Stacks, generare un kymograph. Il kymograph è una rappresentazione del ROI segmentato nel tempo. L'asse orizzontale rappresenta la distanza e l'asse verticale rappresenta il tempo. Le tracce diagonali rappresentano le comete in movimento. Generalmente, il kymograph prende il profilo colore dell'immagine altrimenti assegna un profilo colore come descritto nei passaggi precedenti 5-6 per la visualizzazione delle tracce diagonali.
11. Utilizzando la funzione Linea retta nel menu a discesa dello strumento Linea (fare riferimento al passaggio 9 di questa sezione) disegnare linee rette su ciascuna delle tracce diagonali e aggiungerle nel roi manager.
12. Nella scheda Analizza, passare a Imposta misurazioni e selezionare i parametri Intensità media e Rettangolo limite per misurare le tracce.
13. Nella finestra gestione ROI, fare clic su Misura che aprirà una finestra Risultato che produrrà l'intensità media del ROI, le coordinate X e Y delle tracce di linea, Larghezza, Altezza, Angolo e Lunghezza delle tracce di linea. Questa finestra può essere salvata come formato .csv e successivamente importata in un programma di analisi dei dati.
14. Nel programma del foglio di calcolo, si apre la finestra dei risultati con i valori distribuiti in righe e colonne. I valori rilevanti sono la larghezza, l'altezza e l'angolo delle tracce. La larghezza dà lo spostamento della traccia, l'altezza dà la durata e l'angolo rappresenta il vettore. Poiché i valori di larghezza e altezza sono in pixel, moltiplicarli per le scale spaziale e temporale, rispettivamente, per ottenere i parametri misurabili standard.
15. Poiché il lato sinistro del chimografo è prossimale al corpo cellulare, a seconda dell'angolo, classificare le comete in plus-end-out o minus-end-out (cioè, lontano dal corpo cellulare o verso il corpo cellulare, rispettivamente). Classificare gli angoli compresi tra 1° e -89° e da -91° a -179° rispettivamente come plus-end-out e minus-end-out. Raccogli i dati di più kymographs in un foglio di calcolo per uno studio e rappresenta statisticamente.

Risultati

Come esempio rappresentativo, abbiamo descritto l'osservazione in vivo delle comete EBP nello stato stazionario e gli assoni rigeneranti dei neuroni PLM. I neuroni PLM si trovano nella regione della coda del verme con un lungo processo anteriore che forma una sinapsi e un breve processo posteriore. I neuroni PLM crescono nella direzione anteriore-posteriore vicino all'epidermide e sono responsabili della delicata sensazione di tocco nei vermi. A causa della loro struttura semplificata e della suscettibilità all'imaging ...

Discussione

La comprensione della dinamica dei microtubuli è stata un obiettivo chiave nel campo della ricerca citoscheletrica nel corso degli anni. I microtubuli subiscono nucleazione e catastrofe insieme a un processo continuo di instabilità dinamica^44,45,46,47. Molte di queste informazioni sono state ottenute attraverso saggi in vitro come le lettura di diffusione della lu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CZ18975 worm strain	Yishi Jin lab	CZ18975	Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose	Sigma	A9539	Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)	Zeiss	474030-9010-000	Mounting worms
Dry bath with heating block	Neolab		Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)	Blue Star		Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)	Polysciences Inc.	00876	Mounting worms
Test tubes			Mounting worms
OP50 bacterial strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Worm handling
60mm petri plates	Praveen Scientific	20440	Worm handling
Aspirator/Capillary	VWR	53432-921	Worm handling
Incubator	Panasonic	MIR554E	Worm handling
Platinum wire			Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment	Leica	M165FC	Worm handling
0.3% Sodium Chloride	Sigma	71376	Nematode Growth Medium
0.25% Peptone	T M Media	1506	Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol	Sigma	C8667	Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate	Sigma	223506	Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate	Sigma	M2773	Nematode Growth Medium
2% Agar	T M Media	1202	Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791	Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791	1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride	Sigma	71376	1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride	Fisher Scientific	21405	1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	Sigma	S9390	1X M9 buffer
Glass bottles	Borosil		Buffer storage
488 nm laser	Zeiss		Imaging
5X objective	Zeiss		Imaging
63X objective	Zeiss		Imaging
Camera	Photometrics	Evolve 512 Delta	Imaging
Computer system for Spinning Disk unit	HP	Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz	Imaging
Epifluorescence microscope	Zeiss	Observer.Z1	Imaging
Halogen lamp	Zeiss		Imaging
Mercury Arc Lamp	Zeiss		Imaging
Spinning Disk Unit	Yokogawa	CSU-X1	Imaging
ZEN2 software	Zeiss		Imaging
Image J (Fiji Version)			Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud	Adobe		Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis	Dell	Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz	Image processing/Representation