Method Article
זוהי שיטה מותאמת לזיהוי גורמי קולוניזציה חרקים מועמדים בסימביונט מועיל Burkholderia. מארח חיפושית נגוע בספריית מוטציות אקראית שנוצרת באמצעות mutagenesis טרנספוסון, ומורכבות הספרייה לאחר קולוניזציה מושוות לשליטה גדל במבחנה.
הסקת תפקוד הגנים על ידי מניפולציה של פעילותם היא כלי חיוני להבנת היסודות הגנטיים של רוב התהליכים הביולוגיים. ההתקדמות במיקרוביולוגיה מולקולרית ראתה את הופעתן של טכניקות מוטגנסיס מגוונות למניפולציה של גנים. ביניהם, רצף הכנסה טרנספוסון (Tn-seq) הוא כלי בעל ערך כדי להעריך בו זמנית את הפונקציונליות של גנים מועמדים רבים בצורה לא מנוטרלת. הטכניקה הייתה המפתח לזיהוי מנגנונים מולקולריים להתיישבות של פונדקאים אאוקריוטים במספר חיידקים פתוגניים וכמה סימביונים מועילים.
כאן, Tn-seq הוקמה כשיטה לזיהוי גורמי קולוניזציה בסימביונט גלדיולי של איילת לאגריה וילוסה. על ידי הטיות, Tn5 טרנספוסון בתיווך החדרה של קלטת עמידות לאנטיביוטיקה מתבצעת במקומות גנומיים אקראיים B. גלדיולי. כדי לזהות את ההשפעה של הפרעות גנטיות על היכולת של החיידקים ליישב את מארח היין, הספרייה הנוצרת B. גלדיולי טרנספוסון-מוטציה מחוסנת על ביצי היין, בעוד שליטה גדלה במבחנה במדיום תרבות נוזלית. לאחר מתן מספיק זמן להתיישבות, DNA מופק מתוך in vivo וספריות גידול במבחנה. בעקבות פרוטוקול הכנת ספריית DNA, דגימות הדנ"א מוכנות לרצף של החדרת טרנספוסון. שברי דנ"א המכילים את הקצה של ההחדרה הטרנספוסון ואת ה- DNA החיידקי האגף נבחרים, ואתרי המוטציה נקבעים על ידי רצף הרחק מקצה ההחדרה של טרנספוסון. לבסוף, על ידי ניתוח והשוואה של התדרים של כל מוטציה בין ספריות in vivo וספריות במבחנה, ניתן לחזות את החשיבות של גנים סימביונט ספציפיים במהלך קולוניזציה של חילוקיות.
Burkholderia גלדיולי יכול לעסוק בקשר סימביוטי עם לאגריה villosa bes, משחק תפקיד חשוב בהגנה נגד אנטגוניסטים מיקרוביאליים של מארח חרקים4,5,6. נקבות האשכים מספר זנים של B. גלדיולי אביזר בלוטות מיוחדים למערכת הרבייה. על הטלת ביצים, נקבות למרוח B. תאי גלדיולי על פני הביצה שבו תרכובות מיקרוביאלית המיוצרות על ידי B. גלדיולי לעכב זיהומים על ידי פטריות אנטומופתוגניים4,6. במהלך התפתחות עוברית מאוחרת או מוקדם לאחר צוהר הזחלים, החיידקים ליישב פולשים cuticular על פני השטח של הזחלים. למרות לוקליזציה מיוחדת זו ומסלול שידור אנכי של הסימבינטים, L. villosa יכול ככל הנראה גם לרכוש B. גלדיולי אופקית מהסביבה4. יתר על כן, לפחות שלושה זנים של B. גלדיולי נמצאו בשיתוף עם L. villosa4,6. בין אלה, B. גלדיולי Lv-StA הוא היחיד כי הוא מקובל לטפח במבחנה.
ב. גלדיולי גודל הגנום של Lv-StA הוא 8.56 מגה-בתיםומכיל 7,468 גנים. איזה מהגנים האלה חשוב לחיידקי ב. גלדיולי כדי ליישב את מארח החילולי? כדי לענות על שאלה זו, השתמשנו ברצף טרנספוסון-החדרה (Tn-seq), שיטה חקרנית לזיהויגניםמיקרוביאליים חיוניים מותנים 1,2,3. ספריית מוטציות של B. גלדיולי Lv-StA נוצרה באמצעות טרנספוסון Tn5. באמצעות הטיות מתאי התורם של אשריצ'יה קולי ל- B. gladioli Lv-StA, הועברה פלסמיד pRL27 הנושא את טרנספוסון Tn5 וקסטה עמידות לאנטיביוטיקה המוקפת בחזרות הפוכות (איור 1). כך נוצרה קבוצה של מוטנטים הנושאים בנפרד שיבושים של 3,736 גנים סימביונטים (איור 2).
מאגר המוטציות הודבק על ביצי שולחן כדי לזהות את גורמי ההתיישבות, וכבקרה, גדל גם במבחנה במדיום קינגס B (KB). לאחר שאפשרו מספיק זמן להתיישבות, נאספו זחלים בקעו ונאספו להפקת דנ"א. שברי דנ"א המכילים את ההוספה טרנספוסון ואת האזור הגנומי האגף של B. גלדיולי Lv-StA נבחרו באמצעות פרוטוקול הכנת ספריית DNA שונה לרצף. קריאת עיבוד איכות ואחריו ניתוח עם DESeq2 בוצע כדי לזהות גנים ספציפיים חיוני עבור B. גלדיולי Lv-StA ליישב זחלי L. villosa כאשר מועברים דרך פני הביצה.
1. הכנת מדיה ומאגר
2. הטיות ליצירת ספריית המוטציות של טרנספוסון
איור 1: שלבי פרוטוקול ההונאה. מקבל ההטיה Burkholderia גלדיולי Lv-StA (אדום) והתורם Escherichia coli המכיל pRL27 plasmid (ורוד) גדלים KB אגר ו LB, בהתאמה, בתוספת kanamycin ו DAP. לאחר העברה ההולכת וגואה של הפלסמיד במשך 12-18 שעות ב 30 °C (50 °F), תאי B. גלדיולי transconjugant נבחרים על KB המכילים kanamycin ומאובדים יחד. קיצורים: DAP = 2,6-חומצה דיאמינופימלית; קאן = קנאמיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
3. אלקטרופורזה PCR וג'ל כדי לאשר כניסות מוצלחות ב B. גלדיולי Lv-StA
4. זיהום בבריכת מוטציות על ביצי איילת
5. סלק נגוע ומיצוי דנ"א בספריית המוטציה במבחנה
הערה: עקירות DNA בוצעו באמצעות DNA וערכת טיהור RNA על פי פרוטוקול היצרן המתואר בקצרה להלן.
6. הכנת ספריית רצף
הערה: הפרוטוקול והריגנטים להכנת ספריית DNA מותאמים ומשתנים מההוראות שסופקו על ידי יצרן ערכת הכנת ספריית ה- DNA.
איור 2: שרטוט של שלבי הכנת ספריית הדנ"א. לאחר גזוזה וקשירת מתאם, הפרוטוקול שהשתנה כולל שלב בחירת חרוזים של סטרפטאבידין להעשרת שברי DNA המכילים את קלטת הכניסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
7. רצף וניתוח
חיידקים הקשורים לפונדקאי יכולים להעסיק מספר גורמים כדי ליצור קשר, כולל אלה בתיווך הידבקות, תנועתיות, כימוטקסיס, תגובות מתח, או מובילים ספציפיים. בעוד גורמים חשובים עבור אינטראקציות פתוגן מארח דווחו עבור מספר חיידקים13,14,15,16,17,18, כולל חברים בסוג Burkholderia19,20, פחות מחקרים חקרו את המנגנונים המולקולריים המשמשים סימביונים מועילים עבור קולוניזציה21,22,23 . באמצעות רצף החדרת טרנספוסון, המטרה הייתה לזהות גורמים מולקולריים המאפשרים B. גלדיולי ליישב את L. villosa bes.
מוטגנזה בתיווך טרנספוסון בוצעה באמצעות pRL27 plasmid, הנושא טרנספוסון Tn5 וקלטת התנגדות קנאמיצין מוקף על ידי הפוך אתרים חוזרים. הפלסמיד הוכנס לתוך היעד B. תאי גלדיולי Lv-StA על ידי הטיות עם תורם פלסמיד E. coli WM3064 (כפי שמוצג באיור 1). לאחר ההטיה, תערובת ההטיה המכילה את נמען הגלדיולי B. ותאי התורם E. coli היו מצופים על לוחות אגר סלקטיביים המכילים קנאמיצין. היעדר DAP על הצלחות חיסל את התאים התורמים E. coli, ואת נוכחותו של kanamycin שנבחר עבור מוצלח B. גלדיולי Lv-StA transconjugants. הספרייה המוטנטית B. gladioli Lv-StA שהתקבלה מקציר 100,000 המושבות הטרנס-יבשתיות הוכנה לרצף באמצעות ערכת הכנת ספריית דנ"א מותאמת ובריימרים מותאמים אישית. איור 2 מדגיש את שלבי ההכנה לספריית הדנ"א. רצף הניב 4 קריאות מזווגות של מיו; 3,736 גנים מתוך 7,468 גנים ב B. גלדיולי Lv-StA שובשו.
כדי לזהות מוטנטים שהיו פגומים בהתיישבות בפונדקאי, ספריית המוטציות B. gladioli Lv-StA נדבקה בביצי היין וגדלה במבחנה במדיום KB כשליטה. גודל צוואר הבקבוק של קולוניזציה in vivo חושב לפני הניסוי. מספר ידוע של תאי B. גלדיולי Lv-StA נדבקו בביצי אשקלה, ומספר התאים המתיישבים בזחלי הכוכב הראשון שקעו זה עתה הושג על ידי ציפוי השעיה מכל זחל וספירת יחידות יוצרות מושבה לאדם. חישובים אלה נעשו כדי להבטיח שמספר התאים המתיישבים מספיק כדי להעריך את כל או אחוז גבוה של המוטנטים בספרייה על יכולתם ליישב את הפונדקאי. בנוסף, זמן הצמיחה בין אין במבחנה לבין תנאי vivo היה מנורמל בהתבסס על מספר הדורות חיידקים כדי להפוך דגימות אלה לשווה.
לאחר שהביצים בקעו, נאספו 1,296 זחלים ב-13 בריכות. התרבויות המוטנטיות במבחנה המקבילות גדלו ואוחסנו כמניות גליסול. DNA של in vivo וספריות מוטציות גדל במבחנה הוצא ופוצל ultrasonicator. איור 3 מציג את התפלגות הגודל של הדנ"א הנמרץ, שבו רוב השברים משתרעים על פני 100 עד 400 bp, כצפוי. שלב זה בוצע לאחר פרוטוקול הכנת ספריית DNA שונה לרצף. בכל שלב של הפרוטוקול, הריכוז של ה- DNA הנותר נבדק כדי לוודא כי הצעדים בוצעו כראוי כדי לעקוב אחר אובדן של DNA. בדיקת איכות (ראה טבלת החומרים) לפני הרצף העלתה כי ספריות הדנ"א הכילו שברי DNA גדולים באופן בלתי צפוי (>800 bp), והדבר היה בולט יותר בספריות in vivo. בהתחשב בקושי לייעל את קיבוץ השברים בנתיבי הרצף, היה צורך להגדיל את עומק הרצף ל-10 קריאות זיו בספריות in vivo כדי להשיג את מספר הקריאות הרצוי. ניתוח תוצאות הרצף העלה כי ממוצע של 4 Mio קורא בספריות in vivo ו 3.1 Mio קורא בספריות במבחנה הכיל את קצה Transposon בסוף 5 'של Read-1 (טבלה 9), אשר היה משביע רצון לניסוי זה. התפלגות 24,224 ההוספות הייחודיות ברחבי הגנום של B. gladioli בספרייה המקורית מוצגת באיור 4. ניתוח שנערך באמצעות DESeq2 גילה כי השפע של 271 מוטציות היה שונה באופן משמעותי בין in vivo לבין תנאי במבחנה.
איור 3: ג'לים של מוטציה וספריות דנ"א. (א)ג'ל אגרוז עם דנ"א לא נגף של מוטציה בנתיב x וסולם של 1 kbp לקנה מידה. (ב)ג'ל עם ספריית דנ"א גיהית. גדלי הרצועה של הסולם בנתיב הראשון מסומנים בצד שמאל. שלושת הנתיבים הראשונים a, b ו- c מכילים שברי DNA גרוסים של ספריות in vivo . נתיבים d, e, f ו- g מכילים שברי דנ"א גועכים של ספריות ההחצטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיקום אתרי הכנסה ייחודיים בספרייה המקורית על פני ארבעת השרידים בגנום גלדיולי Lv-StA של בורקהולדריה. כל פס לאורך ציר ה- x ממוקם באתר של הוספה. הגובה של סרגל לאורך ציר ה- y תואם למספר הקריאות המשויכות לאתר זה. שים לב כי שני כרומוזומים ושני plasmids מוצגים באורך מלא ולכן יש קשקשים שונים על ציר x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קינגס בי מדיום/ אגר | |
פפטון (פולי סויה) | 20 גרם/ל' |
K2HPO4 | 1.5 גרם/ל' |
MgSO4.7H2O | 1.5 גרם/ל' |
אגר | 15 גרם/ל' |
מומס במים מזוקקים | |
LB בינוני/אגר | |
טריפטון | 10 גר'/ל' |
תמצית שמרים | 5 גרם/ל' |
NaCl | 10 גר'/ל' |
מומס במים מזוקקים |
טבלה 1: רכיבי מדיה.
לא. | פריימרים | רצף | טמפרטורת חישול PCR. (°C) | |
1 | tpnRL17–1RC | 5'-CGTTACATCTGGCTTGTT-3' | 58.2 | |
2 | tpnRL13–2RC | 5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3' |
לוח 2: פריימרים כדי לאשר את הצלחת ההטיות.
רכיב | אמצעי אחסון (μL) |
מים מטוהרים ב-HPLC | 4.92 |
10x Buffer S (ספציפיות גבוהה) | 1 |
MgCl2 (25 מ"ר) | 0.2 |
dNTPs (2 מ"מ) | 1.2 |
פריימר 1 (22:00/μL) | 0.8 |
פריימר 2 (22:00/μL) | 0.8 |
טאק (5 U/μL) | 0.08 |
סה"כ מאסטרמיקס | 9 |
תבנית | 1 |
טבלה 3: תמהיל מאסטר PCR כדי לאשר את ההצלחה של הטיות. קיצורים: HPLC = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים; dNTPs = deoxynucleoside triphosphate.
שלבים | טמפרטורה °C (55°F) | זמן | מחזורים |
דנטורציה ראשונית | 95 | 3 דקות | 1 |
דנטורציה | 95 | שנות ה-40 | |
חישול | 58.2 | שנות ה-40 | 30 עד 35 |
סיומת | 72 | 1-2 דקות | |
הארכה סופית | 72 | 4 דקות | 1 |
אחז | 4 | ∞ |
טבלה 4: תנאי PCR כדי לאשר את הצלחת ההטיות.
פריימרים | רצף | ת"מ °C | שימוש | מקור | |
פריימר ביוטינילי ספציפי לטרנספוסון | 5'-ביוטין-ACAGGAACACTTAGGCTGACATG -3' | 63.5 | 6.7.1. PCR I | מנהג | |
פריימר PCR אוניברסלי שהשתנה | 5'- אטגאטאקגאקאקאגאטק TACACTCTCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3' | 62 | 6.10.1. PCR II | מנהג | |
פריימר אינדקס | עיין במדריך של היצרן | 6.7.1. PCR I &6.10.1. PCR II | NEBNext מולטיפלקס אוליגוס עבור אילומינה (פריימרים אינדקס להגדיר 1) | ||
מתאם | עיין במדריך של היצרן | 6.5. קשירת מתאם | ערכת הכנה לספריית DNA של NEBNext אולטרה II עבור אילומינה |
טבלה 5: פריימרים ומתאם עבור PCR I ו- II במהלך הכנת ספריית DNA.
תערובת PCR | (μL) |
שברי DNA עם קשירת מתאם | 15 |
NEBNext אולטרה II Q5 תערובת מאסטר | 25 |
פריימר אינדקס (10 pmol / μL) | 5 |
פריימר ביוטינילציה ספציפי טרנספוסון (10 pmol / μL) | 5 |
סה"כ אמצעי אחסון | 50 |
טבלה 6: הכנת ספריית DNA -תמהיל מאסטר PCR I.
שלבים | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
דנטורציה ראשונית | 98 °C (77 °F) | שנות ה-30 | 1 |
דנטורציה | 98 °C (77 °F) | שנות ה-10 | 6 עד 12 |
חישול | 65 °C (75 °F) | שנות ה-30 | |
סיומת | 72 °C (72 °F) | שנות ה-30 | |
הארכה סופית | 72 °C (72 °F) | 2 דקות | 1 |
אחז | 16 °C (77 °F) | ∞ |
טבלה 7: הכנת ספריית DNA -תנאיPCR I ו- II.
תערובת PCR | (μL) |
דנ"א שנבחר על-ידי חרוזים | 15 |
NEBNext אולטרה II Q5 תערובת מאסטר | 25 |
פריימר אינדקס | 5 |
פריימר PCR אוניברסלי שהשתנה | 5 |
סה"כ אמצעי אחסון | 50 |
טבלה 8: הכנת ספריית DNA -תמהיל מאסטר PCR II.
ספריות | איניבו-1 | איניבו-2 | איניבו-3 | Invitro-1 | Invitro-2 | Invitro-3 | ספריה מקורית | |
לא. של קריאות (PE) | 56,57,710 | 39,19,051 | 30,65,849 | 35,73,494 | 28,83,440 | 36,61,956 | 46,09,410 | |
לא. של קריאות המכילות Tn – קצה בקצה 5' של Read-1 | 54,15,880 | 37,31,169 | 29,36,247 | 33,00,499 | 27,35,705 | 33,50,402 | 41,53,270 | |
Bowtie2 שיעור יישור כולל (%) (לקריאה-1 בלבד) | 95.53% | 83.71% | 89.87% | 80.79% | 78.00% | 73.06% | 74.92% | |
מספר הוספות ייחודיות | 8,539 | 4,134 | 7,183 | 18,930 | 18,421 | 20,438 | 24,224 | |
מספר הגנים שנפגעו | 1575 | 993 | 1450 | 2793 | 2597 | 3037 | 3736 |
טבלה 9: סיכום של פלט רצף ותדירות הכנסה של טרנספוסון לכל ספריה. קיצור: PE = קצה מזווג.
ספריית מוטציות טרנספוסון של B. גלדיולי נוצרה כדי לזהות גורמי קולוניזציה מארחים חשובים באינטראקציה הסימביוטית בין סלק L. villosa וחיידקי B. גלדיולי. הצעדים העיקריים בפרוטוקול היו הטיות, זיהום מארח, הכנת ספריית DNA ורצף.
כמו זנים רבים של Burkholderia הם מקובלים על שינוי גנטי על ידי הטיות24,25, plasmid נושא את קלטת טרנספוסון והכנסת אנטיביוטיקה היה מצומד בהצלחה לתוך היעד B. זן גלדיולי Lv-StA מ E. coli. ניסיונות טרנספורמציה קודמים על ידי אלקטרופורציה הניבו נמוך מאוד כמעט ללא טרנספורמטים של גלדיולי B. מומלץ לייעל את טכניקת הטרנספורמציה עבור האורגניזם היעד להניב ביעילות מספר רב של טרנספורמטים.
סבב אחד של הטיות ו-40 נקודות הטיות שיבשו 3,736 גנים ב-B. גלדיולי Lv-StA. במבט לאחור, יהיה צורך בסבבים מרובים של הטיות כדי לשבש את רוב 7,468 הגנים ולקבל ספרייה רוויה. ראוי לציין, זמן הדגירה במהלך ההטיות לא הורשה לעלות על 12-18 שעות, המהווה את סוף שלב הצמיחה המעריכי של B. גלדיולי. מתן אפשרות להטיות מעבר לשלב הצמיחה המעריכי של תאי חיידקים מקטין את סיכויי ההצלחה להשיג טרנס-קונצ'וגנטים26. לכן, יש להתאים את תקופת ההטיות בהתאם לצמיחת המינים החיידקיים.
כדי לבצע בהצלחה ניסוי הכולל זיהום של ספריות מוטציות במארח, חשוב להעריך את גודל צוואר הבקבוק של אוכלוסיית החיידקים במהלך ההתיישבות ואת מגוון המוטנטים בספרייה לפני זיהום1,2,27. כהכנה לניסוי, הערכנו את המספר המינימלי של לחפשיות שיש להדביק כדי שיהיה סיכוי גבוה שכל מוטציה בספרייה תידגם ותורשה להתיישב. זמן ייצור החיידקים המשוער ב-vivo ומספר הדורות למשך הניסוי חושבו גם הם. תרבות ההחמה גדלה אז למספר דומה של דורות על ידי התאמת זמן הדגירה. לניסוי זיהום דומה אצל מארחים אחרים שאינם מודלים, היכולת לשמור על תרבות מעבדה ומקור קבוע של האורגניזמים המארחים רצויה.
בעקבות צמיחת ספריית המוטציות ב- vivo ובאיסוף במבחנה ובדגימה, בוצע פרוטוקול הכנת ספריית DNA שונה לרצף החדרת טרנספוסון. השינוי בפרוטוקול כלל עיצוב פריימרים PCR מותאמים אישית והוספת שלבי PCR לבחירה עבור שברי DNA המכילים את קלטת הכניסה. מאחר שהפרוטוקול הותאם אישית, מחזורי PCR נוספים בפרוטוקול הגבירו את הסיכון לפשטנות יתר וקבלת מקטעי מתאם-מתאם היברידיים בספריות הקצה. לפיכך, מומלץ לשלב ניקוי סופי (ללא בחירת גודל) לאחר שני PCRs, שכן הוא מסייע בהסרת שברים אלה. התפלגות הגודל של ספריות הדנ"א הייתה עדיין רחבה מהצפוי. עם זאת, הגדלת עומק הרצף סיפקה מספיק נתונים שסוננו במהלך ניתוח ביואינפורמטיקה, והשיגה תוצאות משביעות רצון.
מכיוון שמוטגנסיזה בתיווך טרנספוסון מייצרת אלפי כניסות אקראיות בניסוי אחד, ניתן ליצור ספרייה רוויה של מוטציות המכילה את כולם מלבד המוטנטים שבהם גנים החיוניים לצמיחת חיידקים שובשו. סביר להניח שלא עבדנו עם ספריית מוטציות רוויה, בהתחשב בהערכות של גנים חיוניים במחקרים אחרים על Burkholderia sp. 28,29. ספריה לא רוויה בכל זאת מסייעת לחקור גנים מועמדים שונים למחקרים נוספים באמצעות מוטגנזה ממוקדת. לפני הניסויים, חשוב גם לזכור כי כמה transposons יש אתרי יעד הכנסה ספציפיים המגבירים את שפע המוטנטים ב loci מסוימים בגנום30. טרנספונים של מרינר ידועים כמטרה לאתרי AT עבור הכנסה31, ו- Tn5 טרנספונים יש הטיה GC32,33. הכללת שלבים במהלך ניתוח ביואינפורמטיקה לזיהוי נקודות חמות עבור תוספות טרנספוסון תסייע בהערכת כל הטיית הפצה.
למרות שנוטה לכישלונות, ניסוי רצף הכנסה טרנספוסון מעוצב היטב יכול להיות כלי רב עוצמה לזיהוי גנים חשובים ומותנים רבים בחיידקים בתוך ניסוי אחד. לדוגמה, תריסר גנים בבורקהולדריה seminalis חשוב לדיכוי של נמק עלי סחלב זוהו על ידי שילוב של mutagenesis טרנספוסון וגנומיקה34. מעבר לבורקהולדריה, כמה גנים ותנועתיות ומשגרים זוהו כגורמי קולוניזציה חשובים בסימביונטים של אפיס מליפרה (דבורת הדבש)22, ובשיתוי ויבריו פישרי של אופרימנה סקולופס (דיונון בובטייל הוואי)23 באמצעות הגישה של מוטאגנסיס בהחדרת טרנספון.
כגישה חלופית, מוטגנזה טרנספוסון עשויה להיות מלווה על ידי הקרנה עבור מוטציות בודדות באמצעות מדיה סלקטיבית במקום רצף. סינון פנוטיפי או bioassays כדי לזהות ליקויים, כגון תנועתיות, ייצור של מטבוליטים משניים ביואקטיביים, או auxotrophies ספציפי, הם אפשריים. לדוגמה, הקרנה של חרקים Burkholderia (מחדש לסוג Caballeronia35) ספריית מוטציות טרנספוסון היה המפתח בזיהוי כי סימביונטים להשתמש בגנים תנועתיות להתיישבות ריפטורוס pedestris, מארח החרקים שלהם36. יתר על כן, באמצעות מוטגנסיס טרנספוסון והקרנה פנוטיפית, אשכול הגנים הביוסינתזה עבור קריויננסין מטבוליט משני ביואקטיבי זוהה Burkholderia caryophylli37. מוטציה אוקסוטרופית של Burkholderia pseudomallei זוהתה בעקבות מוטגנזה טרנספוסון והקרנה והוא מועמד אפשרי לחיסון מוחלש נגד melioidosis, מחלה מסוכנת בבני אדם ובעלי חיים38. לכן, מוטאגנזה טרנספוסון ורצף היא גישה חשובה בחקר התכונות המולקולריות של חיידקים החשובים לאינטראקציות עם המארחים שלהם בהתאמה באסוציאציות פתוגניות או הדדיות.
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים הנוגע למחקר.
אנו מודים לג'ונבום לי על שסיפק את זן E. coli WM3064+pRL27 להטיה והדרכה בהליך, קתרין הופמאייר על שעזרה בפתרון בעיות במהלך יצירת ספריית המוטציות, ופרופ' אנדרה רודריגז לתמיכה באיסוף חרקים ורכישת היתרים. אנו מודים גם רבקה ינקה ודאגמר קלבש על התמיכה באיסוף וגידול החרקים. אנו מודים לרשויות הברזילאיות על מתן היתרי הגישה הבאים, איסוף, וייצוא של דגימות חרקים: אישור SISBIO Nr. 45742-1, 45742-7 ו 45742-10, תהליך CNPq nº 01300.004320/2014-21 ו 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF ו 20BR035212/DF). מחקר זה נתמך על ידי מימון של קרן המדע הגרמנית (DFG) מענקי מחקר FL1051/1-1 ו KA2846/6-1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar - Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates - 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates - 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved