Method Article
Bu, Burkholderia faydalı bir symbiont'taki aday böcek kolonizasyon faktörlerini tanımlamak için uyarlanmış bir yöntemdir. Böcek konağı transposon mutajensis yoluyla oluşturulan rastgele bir mutant kütüphanesi ile enfektedir ve kolonileşmeden sonra kütüphane karmaşıklığı in vitroyetiştirilen bir kontrol ile karşılaştırılır.
Genlerin aktivitelerini manipüle ederek işlevini çıkarıcı olmak, çoğu biyolojik işlemin genetik temellerini anlamak için önemli bir araçtır. Moleküler mikrobiyolojideki gelişmeler, genlerin manipülasyonu için çeşitli mutajensis tekniklerinin ortaya çıkışını görmüştür. Bunlar arasında, transposon ekleme dizilimi (Tn-seq), birçok aday genin işlevselliğini aynı anda hedefsiz bir şekilde değerlendirmek için değerli bir araçtır. Teknik, çeşitli patojenik mikroplarda ve birkaç faydalı simpiontlarda ökaryotik konakların kolonizasyonu için moleküler mekanizmaları tanımlamak için anahtar olmuştur.
Burada, Tn-seq, lagria villosaböceğinin karşılıklı burkholderia gladioli ortakyaşamında kolonileşme faktörlerini tanımlamak için bir yöntem olarak kurulmuştur. Konjugasyon ile, Tn5 transposon aracılı antibiyotik direnci kasetinin yerleştirilmesi B. gladioli'derastgele genomik yerlerde gerçekleştirilir. Gen bozulmalarının bakterilerin böcek konağını kolonileştirme yeteneği üzerindeki etkisini tanımlamak için, üretilen B. gladioli transposon-mutant kütüphanesi böcek yumurtaları üzerinde aşılanırken, sıvı kültür ortamında bir kontrol in vitro olarak yetiştirilir. Kolonizasyon için yeterli zaman sağladıktan sonra, in vivo ve in vitro yetiştirilen kütüphanelerden DNA çıkarılır. DNA kütüphanesi hazırlama protokolünün ardından, DNA örnekleri transposon ekleme dizilimi için hazırlanır. Transposon-insert kenarını ve yan bakteriyel DNA'yı içeren DNA parçaları seçilir ve mutasyon bölgeleri transposon-insert kenarından uzağa dizilerek belirlenir. Son olarak, in vivo ve in vitro kütüphaneler arasındaki her bir mutantın frekanslarını analiz ederek ve karşılaştırarak, böcek kolonizasyonu sırasında spesifik symbiont genlerinin önemi tahmin edilebilir.
Burkholderia gladioli, Lagria villosa böcekleri ile simbiyotik bir ilişkiye girebilir ve böcekkonağınınmikrobiyal antagonistlerine karşı savunmada önemli bir rol oynar 4,5,6. Dişi böcekler, üreme sistemine özel bez aksesuarında B. gladioli'nin çeşitli suşlarını barındırır. Yumurtlama üzerine dişiler, B. gladioli tarafından üretilen antimikrobiyal bileşiklerin entomopatojenik mantarlar tarafından enfeksiyonları inhibe ettiği yumurta yüzeyinde B. gladioli hücrelerini lekeler4,6. Geç embriyonik gelişim sırasında veya larvalar yumurtadan çıktıktan sonra, bakteri larvaların dorsal yüzeyindeki kbüler invaginasyonları kolonizasyona eder. Bu özel lokalizasyona ve symbiontların dikey iletim rotasına rağmen, L. villosa muhtemelen B. gladioli'yi ortamdan yatay olarak da edinebilir4. Ayrıca, L. villosa4,6ile ilişkili olarak en az üç B. gladioli türü bulunmuştur. Bunlar arasında, B. gladioli Lv-StA in vitroekimi için uygun olan tek kişidir.
B. gladioli Lv-StA 8.56 Mb 6 genom boyutuna sahiptir ve 7.468 gen içerir. Bu genlerden hangisi B. gladioli bakterilerinin böcek konağını kolonileştirmesi için önemlidir? Busoruyucevaplamak için, koşullu olarak gerekli mikrobiyal genleri tanımlamak için keşif yöntemi olan transposon ekleme dizilimlerini (Tn-seq) kullandık 1,2,3. Bir Tn5 transposon kullanılarak B. gladioli Lv-StA'dan oluşan bir mutant kütüphanesi oluşturuldu. Escherichia coli donör hücrelerinden B. gladioli Lv-StA'ya konjugasyon yoluyla, Tn5 transposonunu taşıyan bir pRL27 plazmid ve ters tekrarlarla çevrili bir antibiyotik direnç kaseti aktarılmıştır (Şekil 1). Böylece, 3.736 symbiont geninin bozulmalarını ayrı ayrı taşıyan bir dizi mutant üretilmiştir (Şekil 2).
Mutant havuzu, kolonizasyon faktörlerini tanımlamak için böcek yumurtalarına bulaştı ve kontrol olarak King's B (KB) ortamında in vitro olarak da yetiştirildi. Kolonizasyon için yeterli zaman sağladıktan sonra, yumurtadan çıkmış larvalar toplandı ve DNA ekstraksiyonu için birikti. Transposon kesici ucu ve B. gladioli Lv-StA'nın yan genomik bölgesini içeren DNA parçaları, dizileme için değiştirilmiş bir DNA kütüphanesi hazırlama protokolü kullanılarak seçildi. B. gladioli Lv-StA'nın yumurta yüzeyi üzerinden bulaştığında L. villosa larvalarını kolonileştirmesi için çok önemli olan belirli genleri tanımlamak için DESeq2 ile analizlerin ardından kalite işlemeyi okuyun.
1. Medya ve tampon hazırlama
2. Transposon mutant kütüphanesini oluşturmak için konjugasyon
Şekil 1: Konjugasyon protokolü adımları. Konjugasyon alıcısı Burkholderia gladioli Lv-StA (kırmızı) ve pRL27 plazmidini (pembe) içeren donör Escherichia coli, kanamycin ve DAP ile desteklenmiş sırasıyla KB agar ve LB'de yetiştirilir. Plazmidin 30 °C'de 12-18 saat konjugatif transferden sonra, transkonjugant B. gladioli hücreleri KANAMYCIN içeren KB'de seçilir ve bir araya getirilir. Kısaltmalar: DAP = 2,6-diaminopimelik asit; Kan = kanamycin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. B. gladioli Lv-StA'da başarılı eklemeleri onaylamak için PCR ve jel elektroforezi
4. Böcek yumurtalarında mutant havuz enfeksiyonu
5. Enfekte böcekler ve in vitro mutant kütüphanesi DNA ekstraksiyonu
NOT: DNA ekstraksiyonları, üreticinin aşağıda kısaca özetlenen protokolüne göre bir DNA ve RNA saflaştırma kiti kullanılarak gerçeklendirilmiştir.
6. Kütüphane hazırlığının sıralanıyor
NOT: DNA kütüphanesi hazırlama protokolü ve reaktifleri, DNA kütüphanesi hazırlama kitinin üreticisi tarafından sağlanan talimatlardan uyarlanır ve değiştirilir.
Şekil 2: DNA kütüphanesi hazırlama adımlarının şeması. Kesme ve adaptör ligasyonundan sonra, değiştirilen protokol, ekleme kasetini içeren DNA parçalarını zenginleştirmek için bir streptavidin boncuk seçimi adımı içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7. Sıralama ve analiz
Konakçı ile ilişkili bakteriler, yapışkanlık, hareketlilik, kemotaksi, stres yanıtları veya belirli taşıyıcılar da dahil olmak üzere bir ilişki kurmak için çeşitli faktörler kullanabilir. Patojen konak etkileşimleri için önemli faktörler rapor edilmiş olsa da, burkholderia19,20cinsinin üyeleri de dahil olmak üzere çeşitli bakteriler13, 14 ,15,16,17 ,18, daha az çalışma koloniizasyon için faydalı symbiontlar tarafından kullanılan moleküler mekanizmaları araştırdı21,22,23 . Transposon ekleme dizilimini kullanarak amaç, B. gladioli'nin L. villosa böceklerini kolonileştirmesini sağlayan moleküler faktörleri tanımlamaktı.
Transposon aracılı mutajensis, bir Tn5 transposon ve ters tekrar bölgeleri tarafından kuşatılmış bir kanamycin direnç kaseti taşıyan pRL27 plazmid kullanılarak gerçekleştirildi. Plazmid, plazmid donör E. coli WM3064 suşu ile konjugasyon yapılarak hedef B. gladioli Lv-StA hücrelerine sokuldu (Şekil 1'degösterildiği gibi). Konjugasyondan sonra B. gladioli alıcısı ve E. coli donör hücrelerini içeren konjugasyon karışımı kanamycin içeren seçici agar plakaları üzerine kaplandı. Plakalarda DAP bulunmaması donör E. coli hücrelerini ve başarılı B. gladioli Lv-StA transkonjugantları için seçilen kanamycin varlığını ortadan kaldırdı. 100.000 transkonjugant kolonisinin hasatından elde edilen havuzlu B. gladioli Lv-StA mutant kütüphanesi, değiştirilmiş bir DNA kütüphanesi hazırlama kiti ve özel astarlar kullanılarak sıralama için hazırlandı. Şekil 2, DNA kütüphanesi hazırlama adımlarını vurgulamaktadır. Sıralama 4 Mio eşleştirilmiş okuma sağladı; B. gladioli Lv-StA'daki 7.468 genden 3.736'sı bozuldu.
Konakta kolonizasyon kusurlu olan mutantları tanımlamak için, B. gladioli Lv-StA mutant kütüphanesi böcek yumurtalarına bulaştı ve kontrol olarak KB ortamında in vitro olarak yetiştirildi. In vivo kolonizasyon darboğaz boyutu deneyden önce hesaplandı. Bilinen sayıda B. gladioli Lv-StA hücresi böcek yumurtasına bulaştı ve taze yumurtadan çıkan ilk başlangıç larvalarındaki kolonileşen hücrelerin sayısı, her larvadan bir süspansiyonun kaplaılması ve kişi başına koloni oluşturan birimlerin sayılmasıyla elde edildi. Bu hesaplamalar, kolonileşen hücrelerin sayısının, kütüphanedeki mutantların tamamını veya yüksek bir yüzdesini konak sahibini kolonileştirme yetenekleri için değerlendirmek için yeterli olduğundan emin olmak için yapılmıştır. Ek olarak, in vitro ve in vivo koşullar arasındaki büyüme süresi, bu örnekleri karşılaştırılabilir hale getirmek için bakteri nesillerinin sayısına göre normalleştirildi.
Yumurtalar yumurtadan çıktıktan sonra 13 havuzda 1.296 larva toplandı. İlgili in vitro mutant kültürleri yetiştirildi ve gliserol stokları olarak depolandı. In vivo ve in vitro yetiştirilen mutant kütüphanelerinin DNA'sı bir ultrasonicator'da çıkarıldı ve parçalandı. Şekil 3, parçaların çoğunluğunun beklendiği gibi 100 ila 400 bp arasında yayıldığı yamyulan DNA'nın boyut dağılımını göstermektedir. Bu adımı sıralama için değiştirilmiş DNA kütüphanesi hazırlama protokolü izledi. Protokolün her adımında, adımların doğru bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak ve DNA kayıplarını izlemek için kalan DNA konsantrasyonu kontrol edildi. Sıralamadan önce yapılan bir kalite kontrolü (Bkz. Malzeme Tablosu),DNA kütüphanelerinin beklenmedik şekilde büyük (>800 bp) DNA parçaları içerdiğini ve bunun in vivo kütüphanelerde daha belirgin olduğunu ortaya koydu. Sıralama şeritlerindeki parçaların kümelenmesindeki zorluk göz önüne alındığında, istenen okuma sayısına elde etmek için sıralama derinliğini in vivo kütüphanelerde 10 Mio eşleştirilmiş okumalara çıkarmak gerekiyordu. Sıralama sonuçlarının analizi, in vivo kütüphanelerde ortalama 4 Mio ve in vitro kütüphanelerinde 3.1 Mio okumasının, bu deney için tatmin edici olan 5' Read-1(Tablo 9)ucundaki Transposon kenarını içerdiğini ortaya koydu. Orijinal kütüphanedeki B. gladioli genomuna 24.224 benzersiz eklemenin dağılımı Şekil 4'te gösterilmiştir. DESeq2 kullanılarak yapılan bir analiz, 271 mutantın bolluğunun in vivo ve in vitro koşullar arasında önemli ölçüde farklı olduğunu ortaya koydu.
Şekil 3: Bir mutant ve DNA kütüphanelerinin agarose jelleri. (A) X şeridindeki bir mutantın duyulmamış DNA'sı ve ölçek için 1 kbp merdiveni olan agarose jel. (B) Yamlu DNA kütüphanesi ile jel. İlk şeritteki merdivenin bant boyutları sol tarafta belirtilir. A, b ve c'nin ilk üç şeridi in vivo kütüphanelerin yamlu DNA parçalarınıiçerir. Lanes d, e, f ve g, in vitro kütüphanelerin yamuğunda DNA parçaları içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Burkholderia gladioli Lv-StA genomunda yer alan dört replicon genelinde orijinal kütüphanedeki benzersiz ekleme alanlarının konumu. X ekseni boyunca her çubuk bir ekleme yerinde bulunur. y ekseni boyunca bir çubuğun yüksekliği, bu siteyle ilişkili okuma sayısına karşılık gelir. İki kromozom ve iki plazmidin tam uzunlukta gösterildiğini ve bu nedenle x ekseninde farklı ölçeklere sahip olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kralın B orta / agar | |
Pepton (soya fasulyesi) | 20 g/M |
K2HPO4 | 1,5 g/M |
MgSO4.7H2O | 1,5 g/M |
Agar | 15 g/M |
Damıtılmış suda çözünmüş | |
LB orta/agar | |
Tryptone | 10 g/M |
Maya özü | 5 g/M |
NaCl | 10 g/M |
Damıtılmış suda çözünmüş |
Tablo 1: Ortam bileşenleri.
Hayır. | Astar | Sıra | PCR tavlama sıcaklığı( °C) | |
1 | tpnRL17–1RC | 5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3' | 58.2 | |
2 | tpnRL13–2RC | 5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3' |
Tablo 2: Konjugasyonun başarısını onaylamak için primerler.
Parça | Hacim (μL) |
HPLC arıtılmış su | 4.92 |
10x Tampon S (yüksek özgüllük) | 1 |
MgCl2 (25 mM) | 0.2 |
dNTP'ler (2 mM) | 1.2 |
Astar 1 (10 pmol/μL) | 0.8 |
Astar 2 (10 pmol/μL) | 0.8 |
Taq (5 U/μL) | 0.08 |
Mastermix toplamı | 9 |
Şablon | 1 |
Tablo 3: Konjugasyonun başarısını onaylamak için PCR master mix. Kısaltmalar: HPLC = yüksek performanslı sıvı kromatografisi; dNTP'ler = deoksinükleozit trifosfat.
Adım -ları | Sıcaklık °C | Saat | Döngü |
İlk Denatürasyon | 95 | 3 dk | 1 |
Denatürasyon | 95 | 40 sn | |
Tavlama | 58.2 | 40 sn | 30 ila 35 |
Uzantı | 72 | 1-2 dk | |
Son Uzantı | 72 | 4 dk | 1 |
Tutmak | 4 | ∞ |
Tablo 4: Konjugasyonun başarısını onaylamak için PCR koşulları.
Astar | Sıra | Tm °C | Kullanmak | Kaynak | |
Transposon spesifik biyotinilasyonlu astar | 5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3' | 63.5 | 6.7.1. PCR I | Töre | |
Değiştirilmiş Evrensel PCR astarı | 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3' | 62 | 6.10.1. PCR II | Töre | |
Dizin astarı | Üretici kılavuzuna bakın | 6.7.1. PCR I ve 6.10.1. PCR II | Illumina için NEBNext Multiplex Oligos (İndeks primer seti 1) | ||
Bağdaştırıcı | Üretici kılavuzuna bakın | 6.5. Adaptör ligasyonu | Illumina için NEBNext Ultra II DNA kütüphanesi hazırlık kiti |
Tablo 5: DNA kütüphanesi hazırlığı sırasında PCR I ve II için astarlar ve adaptör.
PCR karışımı | (μL) |
Adaptörle liglenmiş DNA parçaları | 15 |
NEBNext Ultra II Q5 ana karışımı | 25 |
İndeks astarı (10 pmol/ μL) | 5 |
Transposon spesifik biyotinillenmiş astar (10 pmol/ μL) | 5 |
Toplam birim | 50 |
Tablo 6: DNA kütüphanesi hazırlığı-PCR I master mix.
Adım -ları | Sıcaklık | Saat | Döngü |
İlk Denatürasyon | 98 °C | 30 sn | 1 |
Denatürasyon | 98 °C | 10 sn | 6'dan 12'ye |
Tavlama | 65 °C | 30 sn | |
Uzantı | 72 °C | 30 sn | |
Son Uzantı | 72 °C | 2 dk | 1 |
Tutmak | 16 °C | ∞ |
Tablo 7: DNA kütüphanesi hazırlama-PCR I ve II koşulları.
PCR karışımı | (μL) |
Boncuk tarafından seçilen DNA | 15 |
NEBNext Ultra II Q5 ana karışımı | 25 |
Dizin astarı | 5 |
Değiştirilmiş evrensel PCR astarı | 5 |
Toplam birim | 50 |
Tablo 8: DNA kütüphanesi hazırlama-PCR II ana karışımı.
Kitaplık | Invivo-1 | Invivo-2 | Invivo-3 | Invitro-1 | Invitro-2 | Invitro-3 | Özgün kitaplık | |
Hayır. okuma sayısı (PE) | 56,57,710 | 39,19,051 | 30,65,849 | 35,73,494 | 28,83,440 | 36,61,956 | 46,09,410 | |
Hayır. Tn içeren okumaların sayısı – 5' Read-1'in sonundaki kenar | 54,15,880 | 37,31,169 | 29,36,247 | 33,00,499 | 27,35,705 | 33,50,402 | 41,53,270 | |
Bowtie2 genel hizalama oranı (%) (yalnızca Okuma-1) | 95.53% | 83.71% | 89.87% | 80.79% | 78.00% | 73.06% | 74.92% | |
Benzersiz ekleme sayısı | 8,539 | 4,134 | 7,183 | 18,930 | 18,421 | 20,438 | 24,224 | |
Vurulan gen sayısı | 1575 | 993 | 1450 | 2793 | 2597 | 3037 | 3736 |
Tablo 9: Kitaplık başına sıralama çıktısı ve transposon ekleme sıklığının özeti. Kısaltma: PE = eşleştirilmiş uç.
L. villosa böcekleri ve B. gladioli bakterileri arasındaki simbiyotik etkileşimde önemli konak kolonizasyon faktörlerini belirlemek için bir B. gladioli transposon mutant kütüphanesi oluşturulmuştır. Protokoldeki başlıca adımlar konjugasyon, konakçı enfeksiyonu, DNA kütüphanesi hazırlama ve sıralamaydı.
Burkholderia'nın birçok türü konjugasyon24,25ile genetik modifikasyona elverişliolduğundan,transposon ve antibiyotik ekleme kasetini taşıyan plazmid, E. coli'denhedef B. gladioli Lv-StA suşuna başarıyla konjuge edildi. Elektroporasyon ile önceki dönüşüm girişimleri çok düşük bir şekilde neredeyse hiç B. gladioli transformantı vermedi. Hedef organizmanın çok sayıda dönüştürücüyu verimli bir şekilde elde etmesi için dönüşüm tekniğini optimize etmek tavsiye edilir.
B. gladioli Lv-StA'da bir tur konjugasyon ve 40 konjugasyon noktası 3.736 geni bozdu. Geçmişe bakıldığında, 7.468 genin çoğunu bozmak ve doymuş bir kütüphane elde etmek için birden fazla konjugasyon turu gerekli olacaktır. Özellikle, konjugasyon sırasında kuluçka süresinin B. gladioli'ninüstel büyüme aşamasının sonu olan 12-18 saati aşmasına izin verilmedi. Bakteri hücrelerinin üstel büyüme evresinin ötesinde konjugasyona izin vermek, transkonjugant elde etme şansını azaltır26. Bu nedenle, konjugasyon süresi bakteri türlerinin büyümesine göre ayarlanmalıdır.
Bir konakta mutant kütüphanelerinin enfeksiyonunu içeren bir deneyi başarıyla gerçekleştirmek için, kolonileşme sırasında bakteriyel popülasyon darboğaz boyutunu ve enfeksiyondan önce kütüphanedeki mutantların çeşitliliğini değerlendirmek önemlidir1,2,27. Deneye hazırlanırken, kütüphanedeki her bir mutantın örneklenme ve kolonileştirmesine izin verme şansının yüksek olması için enfekte olması gereken minimum böcek sayısını tahmin ettik. Deney süresince yaklaşık in vivo bakteriyel üretim süresi ve nesil sayısı da hesaplandı. İn vitro kültür daha sonra kuluçka süresi ayarlanarak benzer sayıda nesile kadar büyüdü. Model olmayan diğer konaklarda benzer bir enfeksiyon deneyi için, bir laboratuvar kültürünü ve konak organizmaların sabit bir kaynağını koruma yeteneği arzu edilir.
Mutant kütüphane in vivo ve in vitro ve örnek toplamanın büyümesinin ardından transposon ekleme dizilimi için değiştirilmiş bir DNA kütüphanesi hazırlama protokolü gerçekleştirildi. Protokoldeki değişiklik, özel PCR astarları tasarlamayı ve ekleme kasetini içeren DNA parçalarını seçmek için PCR adımları eklemeyi içeriyordu. Protokol özelleştirildiğinden, protokoldeki ek PCR döngüleri, aşırı örnekleme ve son kitaplıklarda karma bağdaştırıcı bağdaştırıcısı parçaları elde etme riskini artırdı. Bu nedenle, bu parçaların çıkarılmasına yardımcı olduğu için iki PCR'den sonra son bir temizleme adımı (boyut seçimi olmadan) önerilir. DNA kütüphanelerinin boyut dağılımı hala beklenenden daha genişti. Bununla birlikte, sıralama derinliğinin artırılması biyoinformatik analizi sırasında filtrelenen yeterli veriyi sağlayarak tatmin edici sonuçlar elde etti.
Transposon aracılı mutajensis tek bir deneyde binlerce rastgele ekleme ürettiğinden, bakteri üremesi için gerekli genlerin bozulduğu mutantlar hariç hepsini içeren doymuş bir mutant kütüphanesi oluşturmak mümkündür. Burkholderia sp ile ilgili diğer çalışmalarda temel genlerin tahminleri göz önüne alındığında, büyük olasılıkla doymuş bir mutant kütüphanesi ile çalışmadık. 28,29. Doymayan bir kütüphane, hedefli mutajensis kullanarak daha fazla çalışma için çeşitli aday genlerin araştırılmasına yardımcı olur. Deneylerden önce, bazı transposonların genom30'dakibelirli locilerde mutantların bolluğunu artıran belirli ekleme hedef bölgelerine sahip olduğunu hatırlamak da önemlidir. Mariner transposons ekleme için AT siteleri hedef bilinmektedir31, ve Tn5 transposons bir GC önyargı vardır32,33. Transposon eklemeleri için sıcak noktaları tanımak için biyoinformatik analizi sırasındaki adımların dahil etmesi, herhangi bir dağıtım önyargısını değerlendirmeye yardımcı olacaktır.
Aksiliklere eğilimli olsa da, iyi tasarlanmış bir transposon ekleme dizileme deneyi, bakterilerdeki birçok koşullu önemli geni tek bir deneyde tanımlamak için güçlü bir araç olabilir. Örneğin, Burkholderia seminalis'te orkide yaprağı nekrozunun bastırılması için önemli olan bir düzine gen transposon mutajensis ve genomik34birleştirilerek tanımlanmıştır. Burkholderia'nınötesinde, çeşitli yapışma ve hareketlilik genleri ve taşıyıcıları, Apis mellifera (Honeybee)22'nin Snodgrassella alvi symbionts'unda ve Euprymna scolopes'un Vibrio fischerii payandalarında (Hawaii bobtail kalamar)23 transposon eklemeli mutagenesis yaklaşımını kullanarak önemli kolonileşme faktörleri olarak tanımlanmıştır.
Alternatif bir yaklaşım olarak transposon mutajensis, sıralama yerine seçici ortam kullanılarak bireysel mutantların taranarak takip edilebilir. Hareketlilik, biyoaktif ikincil metabolitlerin üretimi veya spesifik auxotrophies gibi eksiklikleri tanımlamak için fenotipik tarama veya biyoassaylar mümkündür. Örneğin, burkholderia insecticola (Caballeronia35cinsine yeniden atanmıştır) transposon mutant kütüphanesinin taranmasının, symbiontların Riptortus pedestris'ikolonileştirmek için hareketlilik genleri kullandığı, böcek konakçılarının36. Ayrıca, transposon mutajensis ve fenotipik tarama kullanılarak, burkholderia caryophylli37'debiyoaktif ikincil metabolit karyosenentin için biyosentetik gen kümesi tanımlanmıştır. Transposon mutajensis ve taramadan sonra Burkholderia psödomallei'nin bir auxotrophic mutant'ı tanımlanmıştır ve insanlarda ve hayvanlarda tehlikeli bir hastalık olan melioidoza karşı olası bir zayıflatılmış aşı adayıdır38. Bu nedenle, transposon mutajensis ve dizileme, patojenik veya karşılıklı ilişkilerde ilgili konakçılarla etkileşimleri için önemli olan bakterilerin moleküler özelliklerinin incelenmesinde değerli bir yaklaşımdır.
Yazarlar, çalışmayla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Prosedürde konjugasyon ve rehberlik için E. coli WM3064 +pRL27 suşu sağladığı için Junbeom Lee'ye, mutant kütüphane üretimi sırasında sorun gidermeye yardımcı olduğu için Kathrin Hüffmeier'e ve böcek toplama ve izin alımını desteklediği için Prof. André Rodrigues'e minnettarız. Ayrıca Rebekka Janke ve Dagmar Klebsch'e böceklerin toplanması ve yetiştirisinde destekleri için teşekkür ediyoruz. Brezilyalı yetkilileri böcek örneklerine erişim, toplama ve ihracat için aşağıdaki izinleri verdiği için kabul ediyoruz: SISBIO yetkilendirme Nr. 45742-1, 45742-7 ve 45742-10, CNPq süreci nº 01300.004320/2014-21 ve 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF ve 20BR035212/DF). Bu araştırma, Alman Bilim Vakfı (DFG) Araştırma Hibeleri FL1051/1-1 ve KA2846/6-1 tarafından finanse edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar - Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates - 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates - 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır