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Il s’agit d’une méthode adaptée pour identifier les facteurs de colonisation des insectes candidats dans un symbiote bénéfique Burkholderia. L’hôte du coléoptère est infecté par une bibliothèque mutante aléatoire générée par mutagénèse par transposon, et la complexité de la bibliothèque après la colonisation est comparée à un témoin cultivé in vitro.
Déduire la fonction des gènes en manipulant leur activité est un outil essentiel pour comprendre les fondements génétiques de la plupart des processus biologiques. Les progrès de la microbiologie moléculaire ont vu l’émergence de diverses techniques de mutagénèse pour la manipulation des gènes. Parmi eux, le séquençage transposon-insertion (Tn-seq) est un outil précieux pour évaluer simultanément la fonctionnalité de nombreux gènes candidats de manière non ciblée. La technique a été essentielle pour identifier les mécanismes moléculaires de la colonisation des hôtes eucaryotes chez plusieurs microbes pathogènes et quelques symbiotes bénéfiques.
Ici, Tn-seq est établi comme une méthode pour identifier les facteurs de colonisation dans un symbiote mutualiste Burkholderia gladioli du coléoptère Lagria villosa. Par conjugaison, l’insertion par transposon Tn5 d’une cassette de résistance aux antibiotiques est réalisée à des endroits génomiques aléatoires chez B. gladioli. Pour identifier l’effet des perturbations génétiques sur la capacité des bactéries à coloniser l’hôte du coléoptère, la bibliothèque de mutations transposon de B. gladioli générée est inoculée sur les œufs du coléoptère, tandis qu’un témoin est cultivé in vitro dans un milieu de culture liquide. Après avoir prévu suffisamment de temps pour la colonisation, l’ADN est extrait des bibliothèques cultivées in vivo et in vitro. Suivant un protocole de préparation de bibliothèque d’ADN, les échantillons d’ADN sont préparés pour le séquençage d’insertion de transposon. Les fragments d’ADN qui contiennent le bord transposon-insert et l’ADN bactérien flanquant sont sélectionnés, et les sites de mutation sont déterminés par séquençage loin du bord transposon-insert. Enfin, en analysant et en comparant les fréquences de chaque mutant entre les bibliothèques in vivo et in vitro, l’importance de gènes symbiotes spécifiques lors de la colonisation du coléoptère peut être prédite.
Burkholderia gladioli peut s’engager dans une association symbiotique avec les coléoptères Lagria villosa, jouant un rôle important dans la défense contre les antagonistes microbiens de l’insecte hôte4,5,6. Les coléoptères femelles abritent plusieurs souches de B. glaïeules dans des glandes spécialisées accessoires au système reproducteur. Lors de la ponte, les femelles étalent les cellules de B. gladioli à la surface de l’œuf où les composés antimicrobiens produits par B. gladioli inhibent les infections par les champignons entomopathogènes4,6. Au cours du développement embryonnaire tardif ou au début de l’éclosion des larves, les bactéries colonisent les invaginations cuticulaires sur la surface dorsale des larves. Malgré cette localisation spécialisée et cette voie de transmission verticale des symbiotes, L. villosa peut vraisemblablement aussi acquérir B. gladioli horizontalement de l’environnement4. De plus, au moins trois souches de B. gladioli ont été trouvées en association avec L. villosa4,6. Parmi ceux-ci, B. gladioli Lv-StA est le seul qui se prête à la culture in vitro.
B. glaïez Lv-StA a une taille de génome de 8,56 Mb6 et contient 7 468 gènes. Lesquels de ces gènes sont importants pour que la bactérie B. gladioli colonise l’hôte du coléoptère? Pour répondre à cette question, nous avons utilisé le séquençage par insertion de transposon (Tn-seq), une méthode exploratoire permettant d’identifier les gènes microbiens conditionnellement essentiels1,2,3. Une bibliothèque mutante de B. gladioli Lv-StA a été créée à l’aide d’un transposon Tn5. Par conjugaison des cellules donneuses d’Escherichia coli à B. gladioli Lv-StA, un plasmide pRL27 portant le transposon Tn5 et une cassette de résistance aux antibiotiques flanquée de répétitions inversées ont été transférés (Figure 1). Ainsi, un ensemble de mutants porteurs individuellement de perturbations de 3 736 gènes symbiotes a été généré (Figure 2).
Le groupe de mutants a été infecté sur des œufs de coléoptères pour identifier les facteurs de colonisation et, comme témoin, a également été cultivé in vitro dans le milieu B de King(KB). Après avoir prévu suffisamment de temps pour la colonisation, les larves écloses ont été collectées et mises en commun pour l’extraction de l’ADN. Des fragments d’ADN contenant l’insert de transposon et la région génomique d’accompagnement de B. gladioli Lv-StA ont été sélectionnés à l’aide d’un protocole de préparation de bibliothèque d’ADN modifié pour le séquençage. Un traitement de qualité de lecture suivi d’une analyse avec DESeq2 a été effectué pour identifier des gènes spécifiques cruciaux pour que B. gladioli Lv-StA colonise les larves de L. villosa lorsqu’elles sont transmises par la surface de l’œuf.
1. Préparation des supports et des tampons
2. Conjugaison pour générer la bibliothèque de mutants transposons
Figure 1: Étapes du protocole de conjugaison. Le receveur de conjugaison Burkholderia gladioli Lv-StA (rouge) et le donneur Escherichia coli contenant le plasmide pRL27 (rose) sont cultivés dans la gélose KB et LB, respectivement, complétées par de la kanamycine et du DAP. Après transfert conjugatif du plasmide pendant 12-18 h à 30 °C, les cellules transconjugantes de B. gladioli sont sélectionnées sur KB contenant de la kanamycine et regroupées. Abréviations : DAP = acide 2,6-diaminopimélique; Kan = kanamycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. PCR et électrophorèse sur gel pour confirmer les insertions réussies dans B. gladioli Lv-StA
4. Infection mutante de la piscine sur les œufs de coléoptères
5. Coléoptères infectés et extraction d’ADN de bibliothèque mutante in vitro
REMARQUE: Les extractions d’ADN ont été effectuées à l’aide d’un kit de purification de l’ADN et de l’ARN conformément au protocole du fabricant brièvement décrit ci-dessous.
6. Préparation de la bibliothèque de séquençage
REMARQUE: Le protocole et les réactifs pour la préparation de la bibliothèque d’ADN sont adaptés et modifiés à partir des instructions fournies par le fabricant du kit de préparation de la bibliothèque d’ADN.
Figure 2: Schéma des étapes de préparation de la bibliothèque d’ADN. Après le cisaillement et la ligature de l’adaptateur, le protocole modifié comprend une étape de sélection des billes de streptavidine pour enrichir les fragments d’ADN contenant la cassette d’insertion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
7. Séquençage et analyse
Les bactéries associées à l’hôte peuvent utiliser plusieurs facteurs pour établir une association, y compris ceux qui médient l’adhésion, la motilité, la chimiotaxie, les réponses au stress ou des transporteurs spécifiques. Alors que des facteurs importants pour les interactions pathogène-hôte ont été rapportés pour plusieursbactéries13,14 , 15,16,17,18, y compris les membres du genre Burkholderia19,20, moins d’études ont exploré les mécanismes moléculaires utilisés par les symbiotes bénéfiques pour la colonisation21,22,23 . En utilisant le séquençage d’insertion de transposons, l’objectif était d’identifier les facteurs moléculaires qui permettent à B. gladioli de coloniser les coléoptères L. villosa.
La mutagénèse médiée par transposon a été réalisée à l’aide du plasmide pRL27, qui porte un transposon Tn5 et une cassette de résistance à la kanamycine flanquée de sites de répétition inversés. Le plasmide a été introduit dans les cellules cibles de B. gladioli Lv-StA par conjugaison avec la souche E. coli WM3064 du donneur de plasmide (comme le montre la figure 1). Après conjugaison, le mélange de conjugaison contenant des cellules donneuses de B. glaïe et d’E. coli a été plaqué sur des plaques de gélose sélectives contenant de la kanamycine. L’absence de DAP sur les plaques a éliminé les cellules d’E. coli donneuses, et la présence de kanamycine sélectionnée pour les transconjugants réussis de B. gladioli Lv-StA. La bibliothèque de mutants B. gladioli Lv-StA obtenue à partir de la récolte des 100 000 colonies transconjuvantes a été préparée pour le séquençage à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ADN modifié et d’amorces personnalisées. La figure 2 met en évidence les étapes de préparation de la bibliothèque d’ADN. Le séquençage a donné 4 millions de lectures appariées; 3 736 gènes sur 7 468 gènes de B. gladioli Lv-StA ont été perturbés.
Pour identifier les mutants qui étaient défectueux de colonisation chez l’hôte, la bibliothèque mutante B. gladioli Lv-StA a été infectée sur les œufs de coléoptères et cultivée in vitro en milieu KB comme témoin. La taille du goulot d’étranglement de la colonisation in vivo a été calculée avant l’expérience. Un nombre connu de cellules de B. gladioli Lv-StA a été infecté sur des œufs de coléoptères, et le nombre de cellules colonisatrices dans les larves du premier stade fraîchement écloses a été obtenu en plaquant une suspension de chaque larve et en comptant les unités formant des colonies par individu. Ces calculs ont été effectués pour s’assurer que le nombre de cellules colonisatrices est suffisant pour évaluer la totalité ou un pourcentage élevé des mutants de la bibliothèque pour leur capacité à coloniser l’hôte. De plus, le temps de croissance entre les conditions in vitro et in vivo a été normalisé en fonction du nombre de générations bactériennes pour rendre ces échantillons comparables.
Après l’éclosion des œufs, 1 296 larves ont été recueillies dans 13 bassins. Les cultures mutantes in vitro correspondantes ont été cultivées et stockées sous forme de stocks de glycérol. L’ADN des bibliothèques de mutants cultivés in vivo et in vitro a été extrait et fragmenté dans un ultrasonateur. La figure 3 montre la distribution granulométrique de l’ADN cisaillé, où la majorité des fragments s’étendent entre 100 et 400 pb, comme prévu. Cette étape a été suivie par le protocole de préparation de la bibliothèque d’ADN modifié pour le séquençage. À chaque étape du protocole, la concentration d’ADN restant a été vérifiée pour s’assurer que les étapes ont été effectuées correctement et pour suivre les pertes d’ADN. Un contrôle de qualité (voir la table des matériaux)avant le séquençage a révélé que les bibliothèques d’ADN contenaient des fragments d’ADN étonnamment grands (>800 pb), ce qui était plus prononcé dans les bibliothèques in vivo. Compte tenu de la difficulté d’optimiser le regroupement de fragments dans les voies de séquençage, il était nécessaire d’augmenter la profondeur de séquençage à 10 Mio de lectures appariées dans les bibliothèques in vivo pour atteindre le nombre de lectures souhaité. L’analyse des résultats du séquençage a révélé qu’une moyenne de 4 Mio de lectures dans les bibliothèques in vivo et de 3,1 Mio de lectures dans les bibliothèques in vitro contenait le bord transposon à l’extrémité 5' de Read-1(tableau 9),ce qui était satisfaisant pour cette expérience. La distribution des 24 224 insertions uniques à travers le génome de B. gladioli dans la bibliothèque originale est illustrée à la figure 4. Une analyse réalisée à l’aide de DESeq2 a révélé que les abondances de 271 mutants étaient significativement différentes entre les conditions in vivo et in vitro.
Figure 3: Gels d’agarose d’un mutant et bibliothèques d’ADN. ( A )Geld’agarose avec l’ADN non ciselé d’un mutant dans la voie x et une échelle de 1 kbp pour l’échelle. (B) Gel avec bibliothèque d’ADN cisaillé. Les tailles de bande de l’échelle dans la première voie sont indiquées sur le côté gauche. Les trois premières voies a, b et c contiennent des fragments d’ADN cisaillés des bibliothèques in vivo. Les voies d, e, f et g contiennent des fragments d’ADN cisaillés des bibliothèques in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Emplacement des sites d’insertion uniques dans la bibliothèque originale à travers les quatre replicons du génome Lv-StA de Burkholderia gladioli. Chaque barre le long de l’axe des x est située sur un site d’insertion. La hauteur d’une barre le long de l’axe des y correspond au nombre de lectures associées à ce site. Notez que les deux chromosomes et les deux plasmides sont représentés en pleine longueur et ont donc des échelles différentes sur l’axe des x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
King’s B médium / agar | |
Peptone (soja) | 20 g/L |
K2HPO4 | 1,5 g/L |
MgSO4.7H2O | 1,5 g/L |
Agar-agar | 15 g/L |
Dissous dans de l’eau distillée | |
LB moyen/agar | |
Tryptone | 10 g/L |
Extrait de levure | 5 g/L |
NaCl | 10 g/L |
Dissous dans de l’eau distillée |
Tableau 1 : Composantes des médias.
Non. | Amorces | Séquence | Température de recuit PAR PCR (°C) | |
1 | tpnRL17–1RC | 5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3' | 58.2 | |
2 | tpnRL13–2RC | 5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3' |
Tableau 2 : Amorces pour confirmer le succès de la conjugaison.
Composant | Volume (μL) |
Eau purifiée hpLC | 4.92 |
10x Buffer S (haute spécificité) | 1 |
MgCl2 (25 mM) | 0.2 |
dNTP (2 mM) | 1.2 |
Amorce 1 (10 pmol/μL) | 0.8 |
Amorce 2 (10 pmol/μL) | 0.8 |
Taq (5 U/μL) | 0.08 |
Total Mastermix | 9 |
Modèle | 1 |
Tableau 3 : Mélange maître PCR pour confirmer le succès de la conjugaison. Abréviations : CLHP = chromatographie liquide à haute performance; dNTPs = désoxynucléoside triphosphate.
Escalier | Température °C | Heure | Cycles |
Dénaturation initiale | 95 | 3 min | 1 |
Dénaturation | 95 | 40 s | |
Recuit | 58.2 | 40 s | 30 à 35 |
Extension | 72 | 1-2 min | |
Prolongation finale | 72 | 4 min | 1 |
Tenir | 4 | ∞ |
Tableau 4 : Conditions de PCR pour confirmer le succès de la conjugaison.
Amorces | Séquence | Tm °C | Utiliser | Source | |
Apprêt biotinylé spécifique au transposon | 5'-Biotine-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3' | 63.5 | 6.7.1. PCR I | Coutume | |
Amorce PCR universelle modifiée | 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3' | 62 | 6.10.1. PCR II | Coutume | |
Introduction à l’indice | Reportez-vous au manuel du fabricant | 6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR II | NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Ensemble d’amorces d’indice 1) | ||
Adaptateur | Reportez-vous au manuel du fabricant | 6.5. Ligature de l’adaptateur | Kit de préparation de la bibliothèque d’ADN NEBNext Ultra II pour Illumina |
Tableau 5 : Amorces et adaptateur pour pcR I et II pendant la préparation de la bibliothèque d’ADN.
Mélange PCR | (μL) |
Fragments d’ADN ligaturés par adaptateur | 15 |
Mélange maître NEBNext Ultra II Q5 | 25 |
Amorce d’indice (10 pmol/μL) | 5 |
Apprêt biotinylé spécifique au transposon (10 pmol/μL) | 5 |
Volume total | 50 |
Tableau 6 : Préparation de la bibliothèque d’ADN -Mélange maître PCR I.
Escalier | Température | Heure | Cycles |
Dénaturation initiale | 98 °C | 30 s | 1 |
Dénaturation | 98 °C | 10 s | 6 à 12 |
Recuit | 65 °C | 30 s | |
Extension | 72 °C | 30 s | |
Prolongation finale | 72 °C | 2 min | 1 |
Tenir | 16 °C | ∞ |
Tableau 7 : Préparation de la bibliothèque d’ADN -Conditions pcR I et II.
Mélange PCR | (μL) |
ADN sélectionné par perles | 15 |
Mélange maître NEBNext Ultra II Q5 | 25 |
Introduction à l’indice | 5 |
Amorce PCR universelle modifiée | 5 |
Volume total | 50 |
Tableau 8 : Préparation de la bibliothèque d’ADN -Mélange maître PCR II.
Bibliothèques | Invivo-1 | Invivo-2 | Invivo-3 | Invitro-1 | Invitro-2 | Invitro-3 | Bibliothèque originale | |
Non. nombre de lectures (PE) | 56,57,710 | 39,19,051 | 30,65,849 | 35,73,494 | 28,83,440 | 36,61,956 | 46,09,410 | |
Non. de lectures contenant Tn – bord à l’extrémité 5' de Read-1 | 54,15,880 | 37,31,169 | 29,36,247 | 33,00,499 | 27,35,705 | 33,50,402 | 41,53,270 | |
Taux d’alignement global de Bowtie2 (%) (lecture 1 uniquement) | 95.53% | 83.71% | 89.87% | 80.79% | 78.00% | 73.06% | 74.92% | |
Nombre d’insertions uniques | 8,539 | 4,134 | 7,183 | 18,930 | 18,421 | 20,438 | 24,224 | |
Nombre de gènes touchés | 1575 | 993 | 1450 | 2793 | 2597 | 3037 | 3736 |
Tableau 9 : Résumé de la sortie de séquençage et de la fréquence d’insertion des transposons par bibliothèque. Abréviation : PE = paired-end.
Une bibliothèque de mutants transposon de B. gladioli a été générée pour identifier d’importants facteurs de colonisation de l’hôte dans l’interaction symbiotique entre les coléoptères L. villosa et les bactéries B. gladioli. Les principales étapes du protocole étaient la conjugaison, l’infection de l’hôte, la préparation de la bibliothèque d’ADN et le séquençage.
Comme de nombreuses souches de Burkholderia se prêtent à une modification génétique par conjugaison24,25, le plasmide transportant le transposon et la cassette d’insertion d’antibiotiques a été conjugué avec succès dans la souche cible B. gladioli Lv-StA d’E. coli. Les tentatives précédentes de transformation par électroporation ont donné très peu ou presque pas de transformants de B. glaïe oléoli. Il est conseillé d’optimiser la technique de transformation pour que l’organisme cible produise efficacement un grand nombre de transformants.
Un cycle de conjugaison et 40 points de conjugaison ont perturbé 3 736 gènes chez B. gladioli Lv-StA. Avec le recul, plusieurs cycles de conjugaison seraient nécessaires pour perturber la plupart des 7 468 gènes et obtenir une bibliothèque saturée. Notamment, le temps d’incubation pendant la conjugaison n’a pas été autorisé à dépasser 12-18 h, ce qui est la fin de la phase de croissance exponentielle de B. gladioli. Permettre la conjugaison au-delà de la phase de croissance exponentielle des cellules bactériennes réduit les chances de succès d’obtenir des transconjugants26. Par conséquent, la période de conjugaison doit être ajustée en fonction de la croissance des espèces bactériennes.
Pour mener à bien une expérience impliquant l’infection de bibliothèques mutantes chez un hôte, il est important d’évaluer la taille du goulot d’étranglement de la population bactérienne pendant la colonisation et la diversité des mutants dans la bibliothèque avantl’infection1,2,27. En préparation de l’expérience, nous avons estimé que le nombre minimum de coléoptères qui doivent être infectés a de fortes chances que chaque mutant de la bibliothèque soit échantillonné et autorisé à coloniser. Le temps approximatif de génération bactérienne in vivo et le nombre de générations pour la durée de l’expérience ont également été calculés. La culture in vitro a ensuite été cultivée jusqu’à un nombre comparable de générations en ajustant le temps d’incubation. Pour une expérience d’infection similaire chez d’autres hôtes non modèles, la capacité de maintenir une culture de laboratoire et une source constante des organismes hôtes est souhaitable.
Suite à la croissance de la bibliothèque mutante in vivo et in vitro et de la collecte d’échantillons, un protocole de préparation de bibliothèque d’ADN modifié pour le séquençage d’insertion de transposons a été réalisé. La modification du protocole impliquait la conception d’amorces PCR personnalisées et l’ajout d’étapes PCR à sélectionner pour les fragments d’ADN contenant la cassette d’insertion. Étant donné que le protocole a été personnalisé, des cycles PCR supplémentaires dans le protocole ont augmenté le risque de suramplification et d’obtention de fragments d’adaptateur-adaptateur hybridés dans les bibliothèques finales. Par conséquent, une étape de nettoyage finale (sans sélection de taille) après les deux PCR est recommandée, car elle aide à éliminer ces fragments. La distribution de taille des bibliothèques d’ADN était encore plus large que prévu. Cependant, l’augmentation de la profondeur de séquençage a fourni suffisamment de données qui ont été filtrées lors de l’analyse bioinformatique, obtenant des résultats satisfaisants.
Comme la mutagénèse médiée par transposon génère des milliers d’insertions aléatoires en une seule expérience, il est possible de générer une bibliothèque saturée de mutants qui contient tous sauf ceux où les gènes essentiels à la croissance bactérienne ont été perturbés. Nous n’avons probablement pas travaillé avec une bibliothèque de mutants saturés, compte tenu des estimations de gènes essentiels dans d’autres études sur Burkholderia sp. 28,29. Une bibliothèque non saturée aide néanmoins à explorer divers gènes candidats pour d’autres études utilisant la mutagénèse ciblée. Avant les expériences, il est également important de rappeler que certains transposons ont des sites cibles d’insertion spécifiques qui augmentent l’abondance des mutants à certains loci du génome30. Les transposons mariner sont connus pour cibler les sites AT pour l’insertion31, et les transposons Tn5 ont un biais GC32,33. L’inclusion d’étapes au cours de l’analyse bioinformatique pour reconnaître les points chauds pour les insertions de transposons aidera à évaluer tout biais de distribution.
Bien que sujette à des revers, une expérience de séquençage d’insertion de transposon bien conçue peut être un outil puissant pour identifier de nombreux gènes conditionnellement importants chez les bactéries au sein d’une seule expérience. Par exemple, une douzaine de gènes de Burkholderia seminalis importants pour la suppression de la nécrose des feuilles d’orchidée ont été identifiés en combinant la mutagénèse des transposons et lagénomique 34. Au-delà de Burkholderia,plusieurs gènes et transporteurs d’adhésion et de motilité ont été identifiés comme des facteurs de colonisation importants chez les symbiotes Snodgrassella alvi d’Apis mellifera (Abeille)22, et dans les symbiotes Vibrio fischerii d’Euprymna scolopes (calmar bobtail hawaïen)23 en utilisant l’approche de mutagénèse par insertion de transposon.
Comme approche alternative, la mutagénèse transposon peut être suivie d’un dépistage des mutants individuels à l’aide de milieux sélectifs au lieu du séquençage. Un dépistage phénotypique ou des essais biologiques pour identifier les lacunes, telles que la motilité, la production de métabolites secondaires bioactifs ou d’auxotrophies spécifiques, sont réalisables. Par exemple, le criblage d’une bibliothèque de mutants de transposon Burkholderia insecticola (réaffectée au genre Caballeronia35)a été essentiel pour identifier que les symbiotes utilisent des gènes de motilité pour coloniser Riptortus pedestris,leur insecte hôte36. En outre, en utilisant la mutagénèse transposon et le criblage phénotypique, le groupe de gènes biosynthétiques pour le métabolite secondaire bioactif caryoynencine a été identifié dans Burkholderia caryophylli37. Un mutant auxotrophe de Burkholderia pseudomallei a été identifié à la suite d’une mutagénèse et d’un dépistage par transposon et est un candidat vaccin atténué possible contre la mélioïdose, une maladie dangereuse chez l’homme et l’animal38. Ainsi, la mutagénèse et le séquençage des transposons sont une approche précieuse dans l’étude des traits moléculaires des bactéries qui sont importants pour les interactions avec leurs hôtes respectifs dans des associations pathogènes ou mutualistes.
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts relatif à l’étude.
Nous sommes reconnaissants à Junbeom Lee d’avoir fourni la souche E. coli WM3064+pRL27 pour la conjugaison et les conseils dans la procédure, à Kathrin Hüffmeier pour avoir aidé au dépannage lors de la génération de bibliothèques mutantes et au professeur André Rodrigues pour soutenir la collecte d’insectes et l’acquisition de permis. Nous remercions également Rebekka Janke et Dagmar Klebsch pour leur soutien dans la collecte et l’élevage des insectes. Nous reconnaissons les autorités brésiliennes pour l’octroi des permis suivants pour l’accès, la collecte et l’exportation de spécimens d’insectes : autorisation SISBIO n° 45742-1, 45742-7 et 45742-10, procédé CNPq nº 01300.004320/2014-21 et 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF et 20BR035212/DF). Cette recherche a été financée par les subventions de recherche FL1051/1-1 et KA2846/6-1 de la Fondation allemande pour la science (DFG).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar - Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates - 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates - 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |
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