מודל עכברוש 6-הידרוקסידופמין של מחלת פרקינסון

Summary

מודל 6-hydroxydopamine (6-OHDA) שימש במשך עשרות שנים כדי לקדם את ההבנה של מחלת פרקינסון. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לבצע נגעים nigrostriatal חד צדדיים בחולדה על ידי הזרקת 6-OHDA בחבילת המוח הקדמי המדיאלי, להעריך ליקויים מוטוריים, ולחזות נגעים באמצעות מבחן הצעדה.

Abstract

תסמינים מוטוריים של מחלת פרקינסון (PD)-ברדיקינזיה, אקנזיה, ורעד במנוחה- הם ההשלכות של ניוון עצבי דופאמין בסובסטנציה ניגרה pars compacta (SNc) וגירעון striatal דופאמין. מודלים של בעלי חיים שימשו באופן נרחב כדי לדמות פתולוגיה אנושית במעבדה. מכרסמים הם הדגמים בעלי החיים הנפוצים ביותר עבור PD בשל קלות הטיפול והתחזוקה שלהם. יתר על כן, האנטומיה והמנגנונים המולקולריים, התאיים והפרמקולוגיים של PD דומים במכרסמים ובבני אדם. עירוי של neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OHDA), לתוך צרור המוח הקדמי המדיאלי (MFB) של חולדות משחזר את ההרס החמור של נוירונים דופאמין ומדמה תסמיני PD. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע את microinjection חד צדדי של 6-OHDA ב- MFB במודל חולדה של PD ומראה את הליקויים המוטוריים הנגרמים על ידי 6-OHDA ונגעים דופאמין חזוי באמצעות מבחן הצעד. 6-OHDA גורם לפגיעה משמעותית במספר השלבים המבוצעים עם חזית הנגד.

Introduction

המאפיינים הנוירופתולוגיים העיקריים של PD הם ניוון עצבי פרוגרסיבי כרוני של נוירונים דופאמין בסובסטנציה ניגרה pars compacta (SNc) ואת נוכחותם של גופים לוי המכילים חלבון α-סינוקלאין1. כמו נוירונים דופאמין SNc להקרין האקסונים שלהם לתוך הסטריאטום דרך המסלול nigrostriatal, ניוון עצבי של נוירונים ב SNc גורם גירעון דופאמין בסטריאטום2. היעדר דופמין בסטריאטום גורם לחוסר איזון בפעילותם של מסלולי הבקרה המוטורית הישירים והעקיפים, האחראים על הסימפטומים המוטוריים העיקריים של PD: אקנזיה (תנועה איטית), ברדיקינזיה (קושי בהתחלת תנועות), נוקשות שרירים ורעד במנוחה ^3,4,5.

כמו המנגנונים המולקולריים והפיזיולוגיים המעורבים בהתפרצות של PD עדיין לא מובנים במלואם, טיפולים עיקריים זמינים כיום מבקשים להקל על הסימפטומים המוטוריים באמצעות פרמקותרפיות, גירוי מוחי ^עמוק6,7, טיפולים ^{גנטיים8}, השתלת ^תאים9. לכן, מחקר פרה קליני הוא בסיסי כדי להבהיר את המנגנונים המעורבים בהופעת PD ולגלות מתודולוגיות חדשות לאבחון מוקדם וטיפולים חדשים כדי למנוע או לעצור את ניוון של נוירונים מושפעים ^PD10.

מודלים של בעלי חיים שימשו באופן נרחב כדי לדמות פתולוגיה אנושית במעבדה, ותורמים לקידום הרפואה והמדע11,12,13,14^. עם זאת, חשוב להדגיש כי הבחירה הנכונה של המודל החייתי היא בסיסית להצלחת המחקר. לכן, המודל החייתי חייב להיות מאומת בשלושה היבטים עיקריים: i) תוקף הפנים, שבו המודל החייתי חייב להיות בעל המאפיינים של הפתולוגיה האנושית; ii) תוקף קונסטרוקטיבי, שבו למודל החי חייב להיות בסיס תיאורטי מוצק; ו-iii) תוקף חזוי, שבו מודלים של בעלי חיים חייבים להגיב לטיפולים באופן דומה לטיפול קליני.

נכון לעכשיו, מספר בעלי חיים משמשים כמודלים בעלי חיים עבור PD. הקבוצות העיקריות כוללות יונקים, כגון מכרסמים, פרימטים, מיניפיגים, כלבים וחתולים, וקבוצות אחרות כגון דרוזופילה ודגי זברה. מכרסמים הם המודל החייתי הקלאסי ביותר עבור PD ואת הנפוץ ביותר בשל קלות הטיפול והתחזוקה שלהם. בנוסף, האנטומיה והמנגנונים המולקולריים, התאיים והפרמקולוגיים של PD דומים במכרסמים ובבני ^אדם15.

סקירה שפורסמה על ידי Kin ועמיתיו בשנת 2019 ניתחה את המתודולוגיות העיקריות של מודל בעלי חיים ששימשו ל- PD בשנות ה -2000 ומצאה כי המודל החייתי הנפוץ ביותר כלל רעלנים עצביים כגון 6-הידרוקסידופאמין (6-OHDA) ו 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרהידרופירידין (MPTP). שני neurotoxins לגרום dysregulation מיטוכונדריאלי בתאי עצב דופאמין במסלול nigrostriatal, המוביל למוות ^תאים16. מודל נפוץ נוסף כרוך במניפולציה גנטית באמצעות מוטציה בגנים ספציפיים המעורבים בהתפרצות של PD, גרימת dysregulation mitochondrial17. מודלים Neurotoxin משמשים בדרך כלל כדי להעריך ולהשוות טיפולית, ואילו מודלים גנטיים משמשים כדי ללמוד את הפיתוח של טיפולים מונעים ^PD15 אידיופתי.

MPTP neurotoxin התגלה כגורם לפרקינסון באמצע שנות השמונים לאחר ששבעה חולים השתמשו בחומר והפגינו תסמיני PD חמורים. בנוסף לתסמינים, המטופלים הגיבו לטיפול בסדר גמור, מה שגרם לחוקרים לקשר את המולקולה ישירות ל- PD. לאחר שהמקרה פורסם בשנת 1986, מספר חוקרים החלו להשתמש ב- MPTP במחקר PD פרה-קליני18. חוקרים מצאו כי בהיותה מולקולה ליפופילית, MPTP יכול לחצות את מחסום הדם - מוח (BBB) ולהומר ל- MPP ⁺¹⁹. חומר רעיל זה מצטבר בתוך נוירונים וגורם נזק מורכב 1 של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלי, המוביל למוות של נוירונים ^{דופאמין20}.

מודל הנוירוטוקסין 6-OHDA שימש לראשונה כדי לגרום לניוון של נוירונים מונואמין של המסלול nigrostriatal בשנת ¹⁹⁶⁸²¹. מודל 6-OHDA משמש בדרך כלל כדי לגרום ניוון עצבי במסלול nigrostriatal כפי שהוא דופמין אנלוגי רעיל עבור תאים המכילים קטכולאמין. לאחר 6-OHDA נכנס למוח, זה עשוי להילקח על ידי טרנספורטר דופמין (DAT) נוירונים דופאמין, המוביל ניוון של מסלול nigrostriatal22. מכיוון ש-6-OHDA אינו חודר ל-BBB, יש לתת אותו ישירות באמצעות הזרקה סטריאוטקית תוך-מוחית23. מעכב ספיגה חוזרת של נוראדרנלין משולב לעתים קרובות עם microinjection 6-OHDA כדי לשמר סיבים noradrenergic ולספק ניוון סלקטיבי יותר של נוירונים ^{דופאמין24}.

לאחר DAT תופס 6-OHDA, זה יצטבר בציטוסול של נוירונים, לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) ומוביל למוות ^תאים15. שלושה דגמי נגעים שונים של 6-OHDA משמשים לעתים קרובות: i) נגעים ^SNc25,26; ii) נגעים לסטריאטום27,28; ג. נגעים ל- ^MFB29,30. נגעים הנגרמים בסטריאטום גורמים לניוון איטי ומדרדר של נוירונים דופאמין ב- SNpc. לעומת זאת, נגעים הנגרמים ב- SNpc ו- MFB גורמים לניוון מהיר ומוחלט של נוירונים, מה שמוביל לתסמינים פרקינסון מתקדמים ^יותר31.

הזרקה חד-צדדית או דו-צדדית של 6-OHDA יכולה לגרום לניוון עצבי בתאי עצב דופאמין. 6-OHDA לא תמיד לגרום נזק חמור לנוירונים; לפעמים, ההזרקה גורמת לנזק חלקי, אשר משמש גם כדי לדמות את השלבים המוקדמים של ^PD32. ההזרקה החד-צדדית משמשת בדרך כלל בשל יכולתו של המודל להעריך את הליקויים המוטוריים של החיה ולחזות אובדן תאים באמצעות בדיקות כגון סיבוב המושרה באמפטמין/אפומורפין ומבחן ^הצעד29. זריקות דו-צדדיות משמשות ביותר להערכת זיכרון מרחבי ^{וזיהוי33}.

מבחן הסיבוב המושרה אמפטמין/אפומורפין הוא מבחן התנהגותי נפוץ לחזות אובדן תאים במסלול nigrostriatal. זה מוגדר כתהליך שבו ניהול חוזר ונשנה של אגוניסטים דופמין מוביל התעצמות של התנהגות סיבובית בבעלי חיים 6-OHDA-נגע34. התנהגות סיבובית מורכבת מכמת סיבוב סיבובי איפסילטרלי המושרה באמפטמין או מפניות קונטרלטרליות הנגרמות על ידי אפומורפין במכרסמים בעלי נגע חד-צדדי. התנהגות סיבובית הנגרמת על ידי סמים זכתה לביקורת מכיוון שהסבב אינו תואם לתסמיני PD בבני אדם ויכול להיות מושפע ממשתנים כגון סובלנות, רגישות ו"פרימינג"³⁵.

פרימינג הוא אחד הגורמים הקריטיים ביותר במבחנים התנהגותיים אלה. כמה מקרים דווחו שבהם מנה אחת של בסדר גמור הובילה לכישלון בהתנהגויות ^{סיבוביות36}. בנוסף, גורם קריטי נוסף הקשור ליישום המשולב של הבדיקה המושרה אמפטמין ובדיקה הנגרמת על ידי אפומורפין לשימוש מקבילי הוא שהם מודדים נקודות קצה שונות בגלל מנגנוני פעולה שונים, המשקפים את ההשבתה של מנגנוני איתות ומסלולים שונים. יתר על כן, הבדיקה המושרה אמפטמין הוא מדויק יותר למדוד נגעים nigrostriatal מעל 50-60%, ואילו הבדיקה הנגרמת על ידי אפומורפין מדויקת יותר עבור נגעים מעל 80%³⁷.

מבחן הצעדים התגלה כמבחן התנהגותי המצביע על ליקויים הקשורים ניוון נוירון דופאמין והשפעות טיפוליות. זה מאפשר ניתוח של אקנזיה הנגרמת על ידי נגע 6-OHDA בתאי עצב דופאמין ללא הליך הנגרמת על ידי סמים. יתר על כן, הבדיקה הוקמה היטב ובדרך כלל בשימוש מאז 1995, כאשר היא תוארה לראשונה על ידי Olsson et ^al.35. בשנת 1999, צ'אנג ואח ' ³⁸ גם ניתח והשווה את הביצועים של חולדות במבחן הצעד עם רמת ניוון שנגרם על ידי 6-OHDA ומצא כי בעלי חיים שביצעו גרוע יותר במבחן הצעדה היה גם ניוון משמעותי יותר של נוירונים דופאמין.

מבחן הצעדה הוא שיטה מצוינת לחזות נזק nigrostriatal דופאמין חמור בחולדות נגע 6-OHDA. הראיות מצביעות על כך שהגירעונות המוטוריים מופיעים בקדמת הבמה הנגדית של עירוי 6-OHDA במהלך מבחן הצעדה כאשר מידת האובדן הדופאמין ב- SNc היא >90%³⁹. מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים, המתודולוגיות והחומרים המשמשים לביצוע ניתוח סטריאוטקסי לעירוי חד-צדדי של 6-OHDA ל- MFB של חולדות וכיצד לחזות את הנגעים הדופאמין הנגרמים על ידי הרעלן באמצעות מבחן הצעדה.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים פעלו על פי העקרונות האתיים של המועצה הלאומית לבקרה על ניסויים בבעלי חיים (CONCEA) וחוק ארוקה (חוק 11.794/2008) ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (CEUA-FFCLRP/ USP (18.5.5.35.59.5).

1. הכנת סמים

1. הרדמה עם קטמין/קסילאזין
   הערה: המינון של קטמין בשימוש הוא 70 מ"ג/ק"ג, ואת המינון של xylazine הוא 10 מ"ג/ק"ג.
   1. להכנת 1 מ"ל של הרדמה באמצעות פתרון קטמין 100 מ"ג / מ"ל ופתרון xylazine 20 מ"ג / מ"ל, לשלב 0.35 מ"ל של פתרון קטמין, 0.25 מ"ל של פתרון קסילאזין, ו 0.4 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית 0.9%. לנהל את הפתרון ההרדמה בנפח סופי של 2 מ"ל / ק"ג.
      הערה: קטמין יחד עם קסילאזין יכול לייצר הרגעה במשך 60-80 דקות. אם לבעל החיים עדיין יש רפלקסים (למשל, זריקת רגל אחורית ו/או רפלקס מהבהב), לתת 10% נוספים של המינון הפרטני.
2. אימפרמין
   הערה: המינון האישי של imipramine בשימוש הוא 20 מ"ג/ק"ג.
   1. להכנת 1 מ"ל של פתרון imipramine 20 מ"ג / מ"ל, לשלב 20 מ"ג של imipramine ו 1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. לנהל את פתרון imipramine בנפח סופי של 1 מ"ל / קילוגרם.
3. Meloxicam
   הערה: המינון האישי של meloxicam בשימוש הוא 1 מ"ג/ק"ג.
   1. להכנת 1 מ"ל של תמיסת meloxicam 1 mg/mL, לשלב 0.05 מ"ל של meloxicam 2% ו 0.95 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. לנהל את פתרון meloxicam בנפח סופי של 1 מ"ל / קילוגרם פעם ביום במשך יומיים.
4. חומצה אסקורבית 0.1%
   1. להכנת 1 מ"ל של 0.1% חומצה אסקורבית, לשלב 1 מ"ג של חומצה אסקורבית ו 1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
5. 6-הידרוקסידופאמין (6-OHDA)
   הערה: 6-OHDA הוא רעלן עצבי המשמש להרוס באופן סלקטיבי דופאמין נוירונים noradrenergic במוח. יש להימנע ממגע ישיר עם העור והריריות של העיניים, האף והפה. בעת טיפול 6-OHDA, ללבוש כפפות ניטריל כפולות, חלוק מעבדה, שמלה חד פעמית, הגנה על העיניים, מסכה כירורגית או מגן פנים. נפח העירוי הכולל של הרעלן הוא 4 μL / בעלי חיים, ואת הסכום הבודד הוא 10 מיקרוגרם של 6-OHDA / בעלי חיים.
   1. כדי להכין 1 מ"ל של 6-OHDA בריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מ"ל, לערבב 2.5 מ"ג של 6-OHDA ו 1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח המכילה 0.1% חומצה אסקורבית (המתואר לעיל).
      הערה: 6-OHDA רגיש לאור ומתפרק מהר יותר כאשר הוא נחשף לאור בהיר. יש לטפל בו כראוי ולאחסן אותו בסביבה מוגנת מפני אור. אם צבע הפתרון אדמדם, מחק אותו.
6. לידוקאין הידרוכלוריד (2%)
   1. הכן פתרון לידוקאין 2% ליישום מקומי לבעל החיים.
      הערה: המינון המרבי שניתן ליישם הוא 7 מ"ג/ק"ג.
7. השעיה פולי-אנטיביוטית
   הערה: ההשעיה הפולי-אנטיביוטית עם סטרפטומיצינים ופנצילין (ראה טבלת החומרים) חייבת להיות מוכנה בזמן היישום עם כל נפח הדילול, שהאמפולה שלו מלווה את הבקבוקון עם האבקה.
   1. הסר את הדיסק המתכתי על פקק הגומי. לחטא את פקק הגומי עם אלכוהול.
   2. באמצעות מזרק עם מחט של 23 גרם, להזריק את הדילול לתוך הבקבוקון. הסר את המחט ולנער את הבקבוקון במרץ עד ההשעיה הוא הומוגני לחלוטין. להזריק קצת אוויר לתוך הבקבוקון ולמשוך את הנפח הרצוי של ההשעיה.
   3. לנהל זריקה תוך שרירית עמוקה, מושך את הבוכנה לפני הזרקת התרופה כדי להבטיח כי אין כלי דם הוא הגיע.
      הערה: נפח ההשעיה הסופי שיש להחיל הוא 0.5 מ"ל /ק"ג.

2. הכנת חומרים

הערה: בצע תמיד את ההוראות המופיעות עם גיליון נתוני בטיחות החומרים בעת טיפול בכימיקלים.

1. מנגנון סטריאוטקסי
   1. מניחים את המכשיר הסטריאוטקסי על ספסל יציב ונקי עם תאורה נאותה לביצוע הניתוח. לחטא את המנגנון עם 70% אתנול.
   2. בדוק אם עמודות האוזן והחותכות של ההתקן מיושרות כראוי. מניחים שמיכה תרמית שבה החיה תוצב במהלך הניתוח כדי להתחמם במהלך ההליך. נטר את הטמפרטורה של החיה באמצעות בדיקה רקטלית מדויקת.
      הערה: השמיכה התרמית צריכה להיות בטמפרטורה של 37 °C (5 °F), כך החיה שומרת על טמפרטורת גוף של 37 °C (60 °F).
2. מערכת מיקרו-עירוי
   1. מלא (70-80%) מזרק המילטון (50 μL או לפי הצורך) מחובר microtubing פוליאתילן ברמה רפואית ומחט עם מים מזוקקים כפולים (_ddH2O) ולבדוק דליפות דרך המערכת.
   2. משוך אוויר דרך המערכת כך שבועת אוויר אחת מפרידה את _ddH2O במזרק מפתרון 6-OHDA במיקרו-טיוב.
      הערה: הליך זה נמנע מזיהום מזרק המילטון עם 6-OHDA ומאפשר שימוש במספר חולדות באותו יום ניסיוני.
   3. מקם את מזרק המילטון על משאבת העירוי כך שהוא מחובר היטב ואת הבוכנה של המזרק מקביל למסגרת כי יזוז לדחוף אותו. הגדר את משאבת העירוי למהירות של 0.5 μL / min כך היישום הכולל של 4 μL של 6-OHDA נמשך 8 דקות. בדוק את מערכת העירוי על ידי אישור כי אין דליפות וכי עירוי מתרחשת על פי הזמן והנפח שנקבעו בעבר.
   4. חבר את מחט העירוי המחוברת למיקרו-צינור למנגנון בקצה הזרוע הסטריאוטקסית ובדוק שהמחט ממוקמת בזווית של 180° לפני השטח. ודא שהמחט ישרה ולא כפופה.
      הערה: בדוק את כל ההליכים המתוארים בזהירות כי אם אחד הפריטים במערכת העירוי לא עובד כראוי, זה עלול לסכן את ההצלחה של הניתוח.
3. תפר
   1. השתמש תפר ניילון סטרילי שאינו נספג עם מחט 3/8 מעגל כדי לתפור את החתך לאחר הניתוח.
4. אתר שחזור פוסט-כירורגי
   1. מניחים תיבת דיור נקייה ומעוקרת שבה ניתן לפקח על בעלי חיים עד להתאוששות מלאה (מגיבים למגע ומניפולציה). שים שמיכה תרמית בקופסה עבור thermoregulation.
      הערה: כמו thermoregulation חשוב, לכלול מקור חום משלים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במידת הצורך.

3. הליך כירורגי

הערה: בפרוטוקול זה, עכברושים זכר בוגר Sprague-Dawley (200-250 גרם) נשמרו בתנאים מבוקרים של טמפרטורה (22 ± 2 °C (60 °F), חילופי אוויר (15-20 חילופים / שעה), ומחזורים כהים בהירים (12 שעות / 12 שעות), מקובצים בקופסאות עם 3 או 4 בעלי חיים, עם גישה חופשית למזון ומים.

1. לשקול את בעלי החיים כדי לפקח על שינויים במשקל בימים שלאחר הניתוח. חשב את המינון של תרופות להינתן.
2. לנהל imipramine intraperitoneally 30 דקות לפני הניתוח (~ 10-15 דקות לפני מתן הרדמה), באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מ"ל.
   הערה: imipramine יחסום את טרנספורטר noradrenaline (NAT) ולמנוע ספיגה 6-OHDA על ידי נוירונים noradrenergic, מה שהופך את הנגע סלקטיבי יותר נוירונים ^{דופאמין40}.
3. לאחר 10-15 דקות של הממשל של imipramine, לנהל את הרדמה קטמין/ xylazine intraperitoneal באמצעות מחט 27 גרם ומזרק 1 מ"ל. חכה עד שהחיה תהיה מורדמת לחלוטין. ודא כי החיה נמצאת תחת הרדמה עמוקה כאשר החיה אינה מגיבה לצביטת רגל אחורית ואינה מראה רפלקס מצמוץ.
4. לגלח את פרוות החולדה באזור הראש שבו החתך יתרחש.
5. מקם את החולדה במנגנון הסטריאוטקסי.
   1. מקם את הראש מעל מוט החותכת ותקן את הסרגל 3.3 מ"מ מתחת לקו הבין-לאומי.
   2. מקם את מוטות האוזן, צד אחד בכל פעם. מקם את מוט החותכת ואת מוטות האוזן כך שהחלק העליון של הגולגולת יהיה ישר ומקביל לפני השטח.
   3. התאם את מהדק האף ובדוק שהראש מוצק ואינו זז לשני הצדדים.
6. החל משחה עיניים סטרילית על עיני החולדה כדי למנוע קרניות להתייבש.
7. החל povidone-יוד על האזור להיות חרות לחטא את האתר.
8. החל לידוקאין מקומי עבור משכך כאבים של אזור החתך; אין לחרוג מ-7 מ"ג/ק"ג.
9. לנהל את meloxicam תת עורית באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מ"ל.
   הערה: Meloxicam הוא משכך כאבים אנטי דלקתי nonsteroidal שיסייע החיה להתאושש לאחר הניתוח.
10. לנהל את ההשעיה הפולי-אנטיביוטיקה תוך שרירית באמצעות מחט 23 G ומזרק 1 מ"ל.
    הערה: ההשעיה הפולי-אנטיביוטית ניתנת כטיפול מניעתי כדי למנוע זיהומים חיידקיים אפשריים בהתאוששות שלאחר המוות.
11. בדוק כי החיה נמצאת במצב של הרדמה עמוקה על ידי בדיקת רפלקסים מצמוץ או רפלקסים גפיים אחוריים על ידי צביטת הכף האחורית עם פינצטה.
12. עם אזמל, לבצע חתך של ~ 1.5 ס"מ באזור שבו המיקרו-מניפולציה תתרחש.
    הערה: טכניקות סטריליות מיושמות מנקודה זו עד לסגירת הפצע.
13. נקו את אזור הגולגולת עם מטליות כותנה וניצני כותנה עד שניתן יהיה לראות את ברגמה ולמבדה. סמן את הברגמה ואת למבדה עם עט דק מעוקר.
14. ודא כי הקואורדינטות הגב-גחון (DV) של ברגמה ולמבדה דומות. אם הם שונים, התאם מחדש את החולדה במנגנון הסטריאוטקסי מכיוון שראש החולדה אינו ממוקם כראוי.
15. שים לב לקואורדינטות הקדמיות (AP) והמדיולטרליות (ML) של ברגמה.
16. עבור לקואורדינטות AP ו- ML של MFB הנכון על פי ⁴¹: AP: -4.3 מ"מ, ML: 1.6 מ"מ מברגמה.
17. סמן את האזור של trepanation עם עט דק מעוקר.
18. עם מקדחה מעוקרת, לאט לאט לנקב את הגולגולת של החיה, דואג לא לפצוע את הדורה מאטר.
19. מקם את מחט המיקרו-חדירה על דורה מאטר ושים לב לקואורדינטות ה- DV. קח מחט דקה וקרע בעדינות את הדורה מאטר. הכנס את המחט לקואורדינטת ה- DV (8.3 מ"מ גחון) של ה- MFB, שם יתקיים המיקרו-נגיחה.
20. הפעל את משאבת המיקרו-חדירה כדי לשחרר את פתרון 6-OHDA לתוך ה- MFB. כאשר המיקרו-נגיחה תסתיים, בדוק את מזרק המילטון כדי לראות אם 4 μL של 6-OHDA הוזרק.
    הערה: המיקרו-חדירה אמורה להימשך 8 דקות.
21. לאחר מתן של 6-OHDA, לחכות 10 דקות לפני הסרת המחט כדי למנוע זרימה אחורית של התרופה. הסר את מחט המיקרו-חדירה באיטיות ממוחו של בעל החיים.
22. לחטא את אזור החתך שוב עם povidone-יוד.
23. תפר את אזור החתך עם ~ 3-4 קשרים כירורגיים.
    הערה: הקשר לא צריך להיות חזק מדי או רופף מדי.
24. הסר את החולדה מהמנגנון הסטריאוטקסי והנח אותו בקופסה נקייה להתאוששות על השמיכה התרמית עד שהחיה התאוששה לחלוטין מהרדמה. שימו לב לבעל החיים כל 15 דקות עד שהוא ער לחלוטין מהרדמה.

4. הליכים לאחר הניתוח

1. עקוב אחר משקל החיות בארבעת הימים הבאים לאחר הניתוח. לטפל בהם עם meloxicam תת עורית פעם ביום במשך יומיים לאחר הניתוח, התאמת המינון עבור המשקל של כל יום.
   הערה: יש להעריך את כל בעלי החיים לצורך במשככי כאבים ביום השלישי לאחר הניתוח.
2. בדוק את החתכים מדי יום במשך ארבעה ימים לפחות כדי לוודא שהם לא נגועים. חפש חום, נפיחות, כאב, פריקה ואדמומיות עד שהחתכים יחלימו.
3. בדוק את התיאבון ואת צריכת המים על ידי ניטור משקל הגוף של החיה. תן מזון רטוב כדי לעודד את בעלי החיים לאכול. שים לב למצב הכללי של הגוף, לגישה ולניידות מדי יום במשך ארבעה ימים לפחות לאחר הניתוח. הסר את התפרים 7-10 ימים לאחר הניתוח.
   הערה: יש להרדים בעלי חיים אם מגיעים לנקודות הקצה המוגדרות בהליכים האתיים.

5. מבחן דריכה

1. הדרכה
   הערה: יש לאמן את בעלי החיים במשך שלושה ימים לפני הבדיקה. על פי הפרוטוקול המתואר להלן, אימון צריך להתרחש פעמיים ביום, פעם בבוקר ופעם אחר הצהריים, או עם מרווח של לפחות 2 שעות בין מפגשים. עקוב אחר השעה באמצעות טיימר.
   1. יום 1
      1. בפגישה הראשונה, להתמודד עם החולדה על ידי החזקתו בכפפות במשך ~ 1-2 דקות כדי לאפשר לחולדה להכיר את המטפל / הנסיין.
      2. בפגישה השנייה, לסירוגין בין החזקת החולדה במשך 20 שניות והנחתו על שולחן הפרוטוקול במשך 20 שניות. חזור על שלב אימון זה במשך 3 דקות כדי להכיר את החולדה עם ההתקנה הניסיונית למבחן הצעדה.
   2. יום 2
      1. בפגישה הראשונה, מניחים את שתי נקבות החולדה על שולחן הפרוטוקול על ידי החזקת כפותיה האחוריות ובחזרה ביד אחת. הטה את העכברוש כלפי מטה עם הראש כלפי מטה בזווית של 45° אל פני השטח השטוחים של שולחן הפרוטוקול. הזז אופקית על השולחן מקצה לקצה, ומאפשר לחולדה לדרוך על השולחן עם שתי כפות הרגליים (לכסות 90 ס"מ ב 4 s). להחזיק את החולדה בכפפות במשך 10 שניות, ומאפשר לו לנוח; חזור על דפוס זה במשך 3 דקות.
      2. בפגישה השנייה, הניחו קדמת הבמה אחת של החולדה על שולחן הפרוטוקול על ידי החזקת הפתח השני ביד אחת והחזקת גב החולדה וכפות הרגליים האחוריות ביד השנייה (ראו שלב 5.1.2.1). הזז אופקית על השולחן מקצה לקצה ב 4 s, ומאפשר החולדה לדרוך עם כף הרגל החופשית שלה. החזק את החולדה בכפפות במשך 10 שניות, ומאפשר לה לנוח, ולחזור עם עוד forepaw, ואחריו את תקופת המנוחה. חזור על דפוס זה, לסירוגין בין שני forepaws, ולנוח במשך 3 דקות.
      3. חזור על שלב האימון 3 פעמים במשך 1 דקות כל אחד.
   3. יום 3
      1. בהפעלה הראשונה, בצע את ההליך המתואר בשלב 5.1.2.2 עבור קדימה אחת. חזור על הפעולה עם קדמתן נוספת, ואחריה תקופת המנוחה. חזור על דפוס זה, לסירוגין בין שני forepaws, ולנוח במשך 3 דקות.
      2. בהפעלה השנייה, בצע את ההליך המתואר בשלב 5.1.2.2.
2. מבחן
   הערה: מבחן הצעדה מבוצע לפני הניתוח, 2 ו 4 שבועות לאחר ניתוח סטריאוטקסי, כדי להעריך את האקנזיה של הקדמי הנגדי ואת הפגיעה האפשרית הנגרמת על ידי 6-OHDA.
   1. החזק את החולדה בזווית של 45° אל פני השטח, משתק את גפיו האחוריות ומאפשר רק לאחד הקדמיים לנוח על הרציף, כפי שהוסבר לעיל, ליום 3 של אימון.
   2. גררו את החולדה קדימה למרחק של 90 ס"מ ב-4 שניות, כאשר כף הרגל הימנית או השמאלית מונחת על פני השטח.
   3. רשום הערות וכימת את מספר הצעדים להתאמת כף היד הננקטים עם כל כף רגל לכל כיוון.

תוצאות

הערכת נגע דופאמין
מבחן הצעדה מאפשר הערכה של האקינזיה של הגפיים הקדמיות בניגוד לנגע ובחירת בעלי חיים עם נגע אפשרי של המסלול הניגרוסטריאטלי המושרה על ידי עירוי 6-OHDA (איור 1). ההשוואה בין הביצועים של מבחן הצעדים הנגדי לפני ההפסקה ושבועיים וארבעה שבועות לאחר הניתוח ח...

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע ניתוח למיקרו-עירום חד-צדדי של 6-OHDA ב- MFB, המסוגל לגרום לנגעים חזקים בתאי העצב של המסלול הניגרוסטריאטלי וליצור אקנזיה בחיה. כמו כן מתואר הפרוטוקול לביצוע מבחן הצעד, מבחן ישים בקלות ולא פולשני שניתן להשתמש בו כדי להוכיח את הצלחת הנגעים ולהעריך את אקנה קדמי. כפי שהו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OHDA	Sigma Aldrich	H4381	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	795437	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL	Hamilton	80539	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine	Alfa Aeser	J63723	https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump	Insight	EFF-311	https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino)	Ourofino		https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic	Zoetis		https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic	Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus	Insight	EFF-331	https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN