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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) -Modell wird seit Jahrzehnten verwendet, um das Verständnis der Parkinson-Krankheit voranzutreiben. In diesem Protokoll zeigen wir, wie man einseitige nigrostriatale Läsionen bei der Ratte durchführt, indem man 6-OHDA in das mediale Vorderhirnbündel injiziert, motorische Defizite beurteilt und Läsionen mit dem Schritttest vorhersagt.

Zusammenfassung

Motorische Symptome der Parkinson-Krankheit (PD) - Bradykinesie, Akinesie und Ruhetremor - sind Folgen der Neurodegeneration dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNc) und des dopaminergen striatalen Defizits. Tiermodelle wurden häufig verwendet, um die menschliche Pathologie im Labor zu simulieren. Nagetiere sind aufgrund ihrer einfachen Handhabung und Wartung die am häufigsten verwendeten Tiermodelle für PD. Darüber hinaus sind die Anatomie und die molekularen, zellulären und pharmakologischen Mechanismen von PD bei Nagetieren und Menschen ähnlich. Die Infusion des Neurotoxins 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in ein mediales Vorderhirnbündel (MFB) von Ratten reproduziert die schwere Zerstörung dopaminerger Neuronen und simuliert PD-Symptome. Dieses Protokoll zeigt, wie die einseitige Mikroinjektion von 6-OHDA im MFB in einem Rattenmodell von PD durchgeführt werden kann, und zeigt die durch 6-OHDA induzierten motorischen Defizite und vorhergesagte dopaminerge Läsionen durch den Schritttest. Das 6-OHDA verursacht eine erhebliche Beeinträchtigung der Anzahl der Schritte, die mit dem kontralateralen Vordermaß durchgeführt werden.

Einleitung

Die wichtigsten neuropathologischen Merkmale von PD sind die chronisch fortschreitende Neurodegeneration dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNc) und das Vorhandensein von Lewy-Körpern, die α-Synuclein-Protein enthalten1. Da die dopaminergen SNc-Neuronen ihre Axone über den nigrostriatalen Weg in das Striatum projizieren, führt die Neurodegeneration von Neuronen in SNc zu einem dopaminergen Defizit im Striatum2. Das Fehlen von Dopamin im Striatum verursacht ein Ungleichgewicht in den Aktivitäten der direkten und indirekten motorischen Kontrollwege, das für die wichtigsten motorischen Symptome von PD verantwortlich ist: Akinesie (langsame Bewegung), Bradykinesie (Schwierigkeiten beim Starten von Bewegungen), Muskelsteifheit und Zittern in Ruhe3,4,5.

Da die molekularen und physiologischen Mechanismen, die am Ausbruch der Parkinson-Krankheit beteiligt sind, noch nicht vollständig verstanden sind, versuchen die derzeit verfügbaren Hauptbehandlungen, die motorischen Symptome durch Pharmakotherapien, Tiefe Hirnstimulation6,7, genetische Therapien8 und Zelltransplantationen zu lindern9. Daher ist die präklinische Forschung von grundlegender Bedeutung, um die Mechanismen aufzuklären, die am Ausbruch von Parkinson beteiligt sind, und neue Methoden für die Früherkennung und neue Therapien zu entdecken, um die Degeneration von Neuronen, die von PD10 betroffen sind, zu verhindern oder zu stoppen.

Tiermodelle wurden häufig verwendet, um die menschliche Pathologie im Labor zu simulieren und zum Fortschritt von Medizin und Wissenschaft beizutragen11,12,13,14. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass die richtige Wahl des Tiermodells für den Erfolg der Studie von grundlegender Bedeutung ist. Daher muss das Tiermodell in drei Hauptaspekten validiert werden: i) Gesichtsvalidität, bei der das Tiermodell die Merkmale der menschlichen Pathologie aufweisen muss; ii) konstruktive Validität, bei der das Tiermodell eine solide theoretische Grundlage haben muss; und iii) prädiktive Validität, bei der Tiermodelle auf Behandlungen in ähnlicher Weise wie klinische Behandlungen ansprechen müssen.

Derzeit werden mehrere Tiere als Tiermodelle für PD verwendet. Zu den Hauptgruppen gehören Säugetiere wie Nagetiere, Primaten, Minischweine, Hunde und Katzen sowie andere Gruppen wie Drosophila und Zebrafische. Nagetiere sind das klassischste Tiermodell für PD und aufgrund ihrer einfachen Handhabung und Wartung das am häufigsten verwendete. Darüber hinaus sind die Anatomie und die molekularen, zellulären und pharmakologischen Mechanismen von PD bei Nagetieren und Menschen ähnlich15.

Ein von Kin und Kollegen im Jahr 2019 veröffentlichter Review analysierte die wichtigsten Tiermodellmethoden, die in den 2000er Jahren für PD verwendet wurden, und stellte fest, dass das am häufigsten verwendete Tiermodell Neurotoxine wie 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) und 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) umfasste. Beide Neurotoxine verursachen mitochondriale Dysregulation in dopaminergen Neuronen im nigrostriatalen Signalweg, was zum Zelltod führt16. Ein weiteres weit verbreitetes Modell beinhaltet die genetische Manipulation durch Mutation in bestimmten Genen, die am Ausbruch von PD beteiligt sind und eine mitochondriale Dysregulation verursachen17. Neurotoxinmodelle werden häufig verwendet, um Therapeutika zu bewerten und zu vergleichen, während genetische Modelle verwendet werden, um die Entwicklung von präventiven Therapien und idiopathischen PD15 zu untersuchen.

Das Neurotoxin MPTP wurde Mitte der 1980er Jahre entdeckt, um Parkinsonismus zu verursachen, nachdem sieben Patienten die Substanz verwendet hatten und schwere PD-Symptome zeigten. Zusätzlich zu den Symptomen sprachen die Patienten auf die Behandlung mit L-DOPA an, wodurch die Forscher das Molekül direkt mit PD in Verbindung brachten. Nachdem der Fall 1986 veröffentlicht worden war, begannen mehrere Forscher, MPTP in der präklinischen PD-Forschung einzusetzen18. Forscher haben herausgefunden, dass MPTP als lipophiles Molekül die Blut-Hirn-Schranke (BHS) überwinden und in MPP + 19 umgewandelt werden kann. Diese toxische Substanz sammelt sich in Neuronen an und verursacht Schäden an Komplex 1 der mitochondrialen Atmungskette, was zum Tod dopaminerger Neuronen führt20.

Das 6-OHDA-Neurotoxinmodell wurde erstmals 196821 verwendet, um die Degeneration von Monoaminneuronen des nigrostriatalen Weges zu induzieren. Das 6-OHDA-Modell wird häufig verwendet, um Neurodegeneration im nigrostriatalen Weg zu verursachen, da es ein Dopaminanalogon ist und für katecholaminhaltige Zellen toxisch ist. Nachdem 6-OHDA in das Gehirn gelangt ist, kann es vom Dopamintransporter (DAT) in dopaminergen Neuronen aufgenommen werden, was zu einer Degeneration des nigrostriatalen Weges führt22. Da 6-OHDA nicht in die BHS eindringt, muss es direkt durch intrazerebrale stereotaktische Injektion verabreicht werden23. Ein Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer wird häufig mit einer 6-OHDA-Mikroinjektion kombiniert, um noradrenerge Fasern zu erhalten und eine selektivere Degeneration dopaminerger Neuronen zu erreichen24.

Nachdem DAT 6-OHDA aufgenommen hat, reichert es sich im Zytosol von Neuronen an, produziert reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und führt zum Zelltod15. Drei verschiedene Läsionsmodelle von 6-OHDA werden häufig verwendet: i) Läsionen zum SNc25,26; ii) Läsionen zum Striatum27,28; iii) Läsionen zum MFB29,30. Läsionen, die im Striatum verursacht werden, führen zu einer langsamen und retrograden Degeneration von dopaminergen Neuronen in SNpc. Im Gegensatz dazu führen Läsionen, die in SNpc und MFB verursacht werden, zu einer schnellen und vollständigen Degeneration von Neuronen, was zu fortgeschritteneren Parkinson-Symptomen führt31.

Die einseitige oder bilaterale Injektion von 6-OHDA kann eine Neurodegeneration in dopaminergen Neuronen verursachen. 6-OHDA verursacht nicht immer schwere Schäden an den Neuronen; Manchmal führt die Injektion zu Teilschäden, die auch zur Simulation der frühen Stadien von PD32 verwendet werden. Die einseitige Injektion wird häufiger verwendet, da das Modell in der Lage ist, die motorischen Defizite des Tieres zu beurteilen und den Zellverlust durch Tests wie die amphetamin/apomorphin-induzierte Rotation und den Schritttest29 vorherzusagen. Bilaterale Injektionen werden am häufigsten zur Bewertung des räumlichen Gedächtnisses und der Erkennung verwendet33.

Der Amphetamin / Apomorphin-induzierte Rotationstest ist ein Verhaltenstest, der häufig verwendet wird, um den Zellverlust im nigrostriatalen Weg vorherzusagen. Es ist definiert als ein Prozess, bei dem die wiederholte Verabreichung von Dopaminagonisten zu einer Intensivierung des Rotationsverhaltens bei 6-OHDA-läsionierten Tieren führt34. Das Rotationsverhalten besteht aus der Quantifizierung der amphetamin-induzierten ipsilateralen Rotation oder der apomorphin-induzierten kontralateralen Wendungen bei einseitig läsionierten Nagetieren. Das medikamenteninduzierte Rotationsverhalten wurde kritisiert, da die Rotation nicht den PD-Symptomen beim Menschen entspricht und durch Variablen wie Toleranz, Sensibilisierung und "Priming" beeinflusst werden kann35.

Priming ist einer der kritischsten Faktoren in diesen Verhaltenstests. Es wurden einige Fälle berichtet, in denen eine Einzeldosis L-DOPA zu einem Versagen des Rotationsverhaltens führte36. Darüber hinaus ist ein weiterer kritischer Faktor im Zusammenhang mit der kombinierten Anwendung des Amphetamin-induzierten Tests und des apomorphin-induzierten Tests für den parallelen Gebrauch, dass sie aufgrund unterschiedlicher Wirkmechanismen unterschiedliche Endpunkte messen, was die Inaktivierung verschiedener Signalmechanismen und Signalwege widerspiegelt. Darüber hinaus ist der Amphetamin-induzierte Test genauer, um nigrostriatale Läsionen über 50-60% zu messen, während der apomorphin-induzierte Test für Läsionen über 80% genauer ist37.

Der Schritttest hat sich als Verhaltenstest herausgestellt, der auf Defizite im Zusammenhang mit dopaminerger Neuronendegeneration und therapeutischen Wirkungen hinweist. Es ermöglicht die Analyse von Akinesie, die durch eine 6-OHDA-Läsion in dopaminergen Neuronen verursacht wird, ohne ein medikamenteninduziertes Verfahren. Darüber hinaus ist der Test seit 1995 gut etabliert und wird häufig verwendet, als er erstmals von Olsson et al.35 beschrieben wurde. Im Jahr 1999 analysierten und verglichen Chang et al.38 auch die Leistung von Ratten im Schritttest mit dem Grad der Degeneration, der durch 6-OHDA verursacht wurde, und fanden heraus, dass Tiere, die im Schritttest schlechter abschnitten, auch eine signifikantere Degeneration von dopaminergen Neuronen aufwiesen.

Der Schritttest ist eine ausgezeichnete Methode, um schwere dopaminerge nigrostriatale Schäden bei 6-OHDA-läsionierten Ratten vorherzusagen. Es gibt Hinweise darauf, dass motorische Defizite im kontralateralen Vorderglied der 6-OHDA-Infusion während des Schritttests auftreten, wenn der Grad des dopaminergen Verlusts in SNc >90% beträgt39. Dieses Papier beschreibt die Protokolle, Methoden und Materialien, die zur Durchführung einer stereotaktischen Operation für die einseitige Infusion von 6-OHDA in den MFB von Ratten verwendet werden, und wie die durch das Toxin verursachten dopaminergen Läsionen durch den Schritttest vorhergesagt werden können.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren folgten den ethischen Grundsätzen des Nationalen Rates für die Kontrolle von Tierversuchen (CONCEA) und des Arouca-Gesetzes (Gesetz 11.794/2008) und wurden von der lokalen Ethikkommission (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5) genehmigt.

1. Herstellung von Drogen

  1. Anästhesie mit Ketamin/Xylazin
    HINWEIS: Die verwendete Dosis von Ketamin beträgt 70 mg / kg und die Dosis von Xylazin beträgt 10 mg / kg.
    1. Zur Herstellung von 1 ml Anästhetikum unter Verwendung von Ketamin 100 mg/ml Lösung und Xylazin 20 mg/ml Lösung kombinieren Sie 0,35 ml Ketaminlösung, 0,25 ml Xylazinlösung und 0,4 ml 0,9% sterile Kochsalzlösung. Verabreichen Sie die Anästhesielösung mit einem Endvolumen von 2 ml/kg.
      HINWEIS: Ketamin kann zusammen mit Xylazin eine Sedierung für 60-80 min erzeugen. Wenn das Tier immer noch Reflexe hat (z. B. Hinterbeinneigung und/oder Blinzelreflex), verabreichen Sie weitere 10% der Einzeldosis.
  2. Imipramin
    HINWEIS: Die individuelle Dosis von Imipramin beträgt 20 mg/kg.
    1. Um 1 ml Imipramin 20 mg / ml Lösung herzustellen, kombinieren Sie 20 mg Imipramin und 1 ml 0,9% sterile Kochsalzlösung. Verabreichen Sie die Imipraminlösung bei einem Endvolumen von 1 ml/kg.
  3. Meloxicam
    HINWEIS: Die individuelle Dosis von Meloxicam beträgt 1 mg/kg.
    1. Um 1 ml Meloxicam 1 mg / ml Lösung herzustellen, kombinieren Sie 0,05 ml Meloxicam 2% und 0,95 ml 0,9% sterile Kochsalzlösung. Verabreichen Sie die Meloxicam-Lösung in einem Endvolumen von 1 ml / kg einmal täglich für zwei Tage.
  4. Ascorbinsäure 0,1%
    1. Um 1 ml 0,1% Ascorbinsäure herzustellen, kombinieren Sie 1 mg Ascorbinsäure und 1 ml 0,9% sterile Kochsalzlösung.
  5. 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)
    HINWEIS: 6-OHDA ist ein Neurotoxin, das verwendet wird, um dopaminerge und noradrenerge Neuronen im Gehirn selektiv zu zerstören. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit Haut und Schleimhäuten von Augen, Nase und Mund. Tragen Sie bei der Handhabung von 6-OHDA doppelte Nitrilhandschuhe, Laborkittel, Einwegkleid, Augenschutz und chirurgische Maske oder Gesichtsschutz. Das Gesamtinfusionsvolumen des Toxins beträgt 4 μL/Tier und die individuelle Menge 10 μg 6-OHDA/Tier.
    1. Zur Herstellung von 1 ml 6-OHDA in einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml werden 2,5 mg 6-OHDA und 1 ml 0,9%ige Kochsalzlösung mit 0,1 % Ascorbinsäure (oben beschrieben) gemischt.
      HINWEIS: 6-OHDA ist lichtempfindlich und wird schneller abgebaut, wenn es hellem Licht ausgesetzt wird. Es muss ordnungsgemäß gehandhabt und in einer vor Licht geschützten Umgebung gelagert werden. Wenn die Farbe der Lösung rötlich ist, verwerfen Sie sie.
  6. Lidocainhydrochlorid (2%)
    1. Bereiten Sie 2% ige Lidocainlösung für die lokale Anwendung auf das Tier vor.
      HINWEIS: Die maximale Dosis, die angewendet werden kann, beträgt 7 mg / kg.
  7. Poly-antibiotische Suspension
    HINWEIS: Die polyantibiotische Suspension mit Streptomycinen und Penicillinen (siehe Materialtabelle) muss zum Zeitpunkt der Anwendung mit dem gesamten Volumen des Verdünnungsmittels hergestellt werden, dessen Ampulle die Durchstechflasche mit dem Pulver begleitet.
    1. Entfernen Sie die metallische Scheibe am Gummistopfen. Desinfizieren Sie den Gummistopfen mit Alkohol.
    2. Injizieren Sie das Verdünnungsmittel mit einer Nadel von 23 G mit einer Spritze in die Durchstechflasche. Entfernen Sie die Nadel und schütteln Sie die Durchstechflasche kräftig, bis die Suspension vollständig homogenisiert ist. Injizieren Sie etwas Luft in die Durchstechflasche und ziehen Sie das gewünschte Volumen der Suspension heraus.
    3. Verabreichen Sie eine tiefe intramuskuläre Injektion und ziehen Sie den Kolben, bevor Sie das Medikament injizieren, um sicherzustellen, dass kein Blutgefäß erreicht wird.
      HINWEIS: Das endgültige Volumen der aufzutragenden Aufhängung beträgt 0,5 ml/kg.

2. Vorbereitung der Materialien

HINWEIS: Befolgen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer die mit dem Sicherheitsdatenblatt gelieferten Anweisungen.

  1. Stereotaktische Apparatur
    1. Stellen Sie das stereotaktische Gerät auf eine stabile und saubere Bank mit der richtigen Beleuchtung, um die Operation durchzuführen. Desinfizieren Sie das Gerät mit 70% Ethanol.
    2. Überprüfen Sie, ob das Ohr und die Schneidezähne des Geräts richtig ausgerichtet sind. Legen Sie eine Wärmedecke an die Stelle, an der das Tier während der Operation platziert wird, um während des Eingriffs warm zu bleiben. Überwachen Sie die Temperatur des Tieres mit einer genauen rektalen Sonde.
      HINWEIS: Die Wärmedecke sollte bei 37,5 ° C liegen, damit das Tier eine Körpertemperatur von 37 ° C beibehält.
  2. Mikroinfusionssystem
    1. Füllen Sie (70-80%) eine Hamilton-Spritze (50 μL oder wie gewünscht), die an einem medizinischen Polyethylen-Mikroschlauch und einer Nadel mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) befestigt ist, und prüfen Sie das System auf Lecks.
    2. Ziehen Sie Luft durch das System, so dass eine einzige Luftblase das ddH2O in der Spritze von der 6-OHDA-Lösung im Mikroröhrchen trennt.
      HINWEIS: Dieses Verfahren vermeidet eine Kontamination der Hamilton-Spritze mit 6-OHDA und ermöglicht die Verwendung mehrerer Ratten am selben Versuchstag.
    3. Positionieren Sie die Hamilton-Spritze auf der Infusionspumpe, so dass sie fest verbunden ist und der Kolben der Spritze parallel zu dem Rahmen ist, der sich bewegt, um sie zu drücken. Stellen Sie die Infusionspumpe auf eine Drehzahl von 0,5 μL/min so ein, dass die Gesamtapplikation von 4 μL 6-OHDA 8 min dauert. Testen Sie das Infusionssystem, indem Sie bestätigen, dass keine Leckagen vorhanden sind und dass die Infusion gemäß der zuvor eingestellten Zeit und Menge erfolgt.
    4. Befestigen Sie die am Mikroröhrchen befestigte Infusionsnadel an der Vorrichtung am Ende des stereotaktischen Arms und überprüfen Sie, ob die Nadel in einem Winkel von 180° zur Oberfläche positioniert ist. Stellen Sie sicher, dass die Nadel gerade und nicht verbogen ist.
      HINWEIS: Überprüfen Sie alle beschriebenen Verfahren sorgfältig, denn wenn eines der Elemente im Infusionssystem nicht richtig funktioniert, kann dies den Erfolg der Operation gefährden.
  3. Naht
    1. Verwenden Sie eine sterile, nicht resorbierbare Nylonnaht mit einer 3/8-Kreisnadel, um den Schnitt nach der Operation zu nähen.
  4. Postoperative Genesungsstelle
    1. Stellen Sie eine saubere und sterilisierte Haltungsbox auf, in der die Tiere überwacht werden können, bis sie vollständig genesen sind (reaktionsschnell auf Berührung und Manipulation). Legen Sie eine Wärmedecke zur Thermoregulation in die Box.
      HINWEIS: Da die Thermoregulation wichtig ist, fügen Sie bei Bedarf eine zusätzliche Wärmequelle hinzu, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.

3. Chirurgischer Eingriff

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g) unter kontrollierten Temperaturbedingungen (22 ± 2 ° C), Luftaustausch (15-20 Austausch / Stunde) und Hell-Dunkel-Zyklen (12 h / 12 h) in Boxen mit 3 oder 4 Tieren mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten.

  1. Wiegen Sie die Tiere, um Gewichtsveränderungen in den Tagen nach der Operation zu überwachen. Berechnen Sie die Dosis der zu verabreichenden Medikamente.
  2. Verabreichen Sie Imipramin intraperitoneal 30 Minuten vor der Operation (~ 10-15 Minuten vor der Verabreichung der Anästhesie), mit einer 27 G Nadel und einer 1 ml Spritze.
    HINWEIS: Das Imipramin blockiert den Noradrenalintransporter (NAT) und verhindert die 6-OHDA-Aufnahme durch noradrenerge Neuronen, wodurch die Läsion für die dopaminergen Neuronen selektiver wird40.
  3. Nach 10-15 Minuten der Verabreichung von Imipramin ist die intraperitoneale Ketamin / Xylazin-Anästhesie mit einer 27-G-Nadel und einer 1-ml-Spritze zu verabreichen. Warten Sie, bis das Tier vollständig betäubt ist. Stellen Sie sicher, dass das Tier unter tiefer Narkose steht, wenn das Tier nicht auf das Einklemmen der Hinterbeine reagiert und keinen Blinzelreflex zeigt.
  4. Rasieren Sie das Fell der Ratte in der Region des Kopfes, in der der Schnitt auftreten wird.
  5. Positionieren Sie die Ratte im stereotaktischen Apparat.
    1. Positionieren Sie den Kopf über der Schneidezahnstange und fixieren Sie die Stange 3,3 mm unterhalb der interauralen Linie.
    2. Positionieren Sie die Ohrstangen jeweils seitlich. Positionieren Sie die Schneidezahnstange und die Ohrstangen so, dass die Oberseite des Schädels gerade und parallel zur Oberfläche verläuft.
    3. Stellen Sie die Nasenklemme ein und testen Sie, ob der Kopf fest ist und sich nicht zu beiden Seiten bewegt.
  6. Tragen Sie sterile Augensalbe auf die Rattenaugen auf, um zu verhindern, dass Hornhäute austrocknen.
  7. Tragen Sie Povidon-Jod auf den einzuschneidenden Bereich auf, um die Stelle zu desinfizieren.
  8. Wenden Sie lokales Lidocain für die Analgesie der Inzisionsregion an; 7 mg/kg nicht überschreiten.
  9. Verabreichen Sie das Meloxicam subkutan mit einer 27 G Nadel und einer 1 ml Spritze.
    HINWEIS: Meloxicam ist ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Analgetikum, das dem Tier hilft, sich nach der Operation zu erholen.
  10. Verabreichen Sie die polyantibiotische Suspension intramuskulär mit einer 23-G-Nadel und einer 1-ml-Spritze.
    HINWEIS: Die polyantibiotische Suspension wird als prophylaktische Behandlung verabreicht, um mögliche bakterielle Infektionen bei der postoperativen Genesung zu vermeiden.
  11. Überprüfen Sie, ob sich das Tier in einem Zustand der Tiefenbetäubung befindet, indem Sie nach Blinzelreflexen oder Hinterbeinreflexen suchen, indem Sie die Hinterpfote mit einer Pinzette einklemmen.
  12. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt von ~ 1, 5 cm in der Region, in der die Mikroinjektion stattfinden wird.
    HINWEIS: Sterile Techniken werden von diesem Punkt bis zum Wundverschluss angewendet.
  13. Reinigen Sie die Schädelregion mit Wattestäbchen und Wattestäbchen, bis Bregma und Lambda zu sehen sind. Markieren Sie den Bregma und den Lambda mit einem sterilisierten feinen Stift.
  14. Überprüfen Sie, ob die dorsal-ventralen (DV) Koordinaten von Bregma und Lambda ähnlich sind. Wenn sie unterschiedlich sind, stellen Sie die Ratte im stereotaktischen Apparat neu ein, da der Kopf der Ratte nicht richtig positioniert ist.
  15. Notieren Sie sich die anteroposterioren (AP) und mediolateralen (ML) Koordinaten des Bregma.
  16. Wechseln Sie zu den AP- und ML-Koordinaten der rechten MFB gemäß 41: AP: -4,3 mm, ML: 1,6 mm von Bregma.
  17. Markieren Sie den Bereich der Trepanation mit einem sterilisierten feinen Stift.
  18. Durchbohren Sie mit einem sterilisierten Bohrer langsam den Schädel des Tieres und achten Sie darauf, die Dura mater nicht zu verletzen.
  19. Positionieren Sie die Mikroinjektionsnadel auf der Dura Mater und notieren Sie sich die DV-Koordinaten. Nehmen Sie eine dünne Nadel und reißen Sie vorsichtig die Dura Mater. Führen Sie die Nadel in die DV-Koordinate (8,3 mm ventral) des MFB ein, wo die Mikroinjektion stattfindet.
  20. Betreiben Sie die Mikroinjektionspumpe, um die 6-OHDA-Lösung in den MFB freizusetzen. Wenn die Mikroinjektion abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Hamilton-Spritze, um festzustellen, ob 4 μL 6-OHDA injiziert wurden.
    HINWEIS: Die Mikroinjektion sollte 8 Minuten dauern.
  21. Warten Sie nach der Verabreichung des 6-OHDA 10 Minuten, bevor Sie die Nadel entfernen, um einen Rückfluss des Arzneimittels zu vermeiden. Entfernen Sie die Mikroinjektionsnadel langsam aus dem Gehirn des Tieres.
  22. Desinfizieren Sie die Schnittregion erneut mit Povidon-Jod.
  23. Nähen Sie den Schnittbereich mit ~3-4 chirurgischen Knoten.
    HINWEIS: Der Knoten sollte nicht zu stark oder zu locker sein.
  24. Entfernen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Gerät und legen Sie sie in eine saubere Box zur Erholung auf die Wärmedecke, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat. Beobachten Sie das Tier alle 15 Minuten, bis es aus der Narkose vollständig erwacht ist.

4. Postoperative Verfahren

  1. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere in den nächsten vier Tagen nach der Operation. Behandeln Sie sie mit Meloxicam subkutan einmal täglich für zwei Tage nach der Operation und passen Sie die Dosis für das Gewicht jedes Tages an.
    HINWEIS: Alle Tiere sollten am dritten Tag nach der Operation auf den Bedarf an Analgetika untersucht werden.
  2. Überprüfen Sie die Einschnitte täglich für mindestens vier Tage, um sicherzustellen, dass sie nicht infiziert sind. Suchen Sie nach Hitze, Schwellungen, Schmerzen, Ausfluss und Rötung, bis die Einschnitte heilen.
  3. Überprüfen Sie den Appetit und den Wasserverbrauch, indem Sie das Körpergewicht des Tieres überwachen. Geben Sie Nassfutter, um die Tiere zum Fressen zu ermutigen. Beobachten Sie den allgemeinen Körperzustand, die Einstellung und die Mobilität täglich für mindestens vier Tage nach der Operation. Entfernen Sie die Nähte 7-10 Tage nach der Operation.
    HINWEIS: Tiere sollten eingeschläfert werden, wenn die in den ethischen Verfahren definierten Endpunkte erreicht sind.

5. Schritttest

  1. Ausbildung
    HINWEIS: Die Tiere sollten drei Tage vor dem Test trainiert werden. Gemäß dem unten beschriebenen Protokoll sollte das Training zweimal täglich, einmal am Morgen und einmal am Nachmittag oder mit einem Abstand von mindestens 2 Stunden zwischen den Sitzungen stattfinden. Verfolgen Sie die Zeit mit einem Timer.
    1. Tag 1
      1. Behandeln Sie die Ratte in der ersten Sitzung, indem Sie sie ~ 1-2 Minuten lang in Handschuhen halten, damit sich die Ratte mit dem Handler / Experimentator vertraut machen kann.
      2. In der zweiten Sitzung wechseln Sie zwischen dem Halten der Ratte für 20 s und dem Ablegen auf den Protokolltisch für 20 s. Wiederholen Sie diesen Trainingsschritt für 3 Minuten, um die Ratte mit dem Versuchsaufbau für den Schritttest vertraut zu machen.
    2. Tag 2
      1. Legen Sie in der ersten Sitzung beide Vorderpfoten der Ratte auf den Protokolltisch, indem Sie ihre Hinterpfoten und den Rücken mit einer Hand halten. Neigen Sie die Ratte kopfüber in einem Winkel von 45° zur ebenen Oberfläche des Protokolltisches nach unten. Bewegen Sie sich horizontal auf dem Tisch von Ende zu Ende, so dass die Ratte mit beiden Pfoten auf den Tisch treten kann (Abdeckung 90 cm in 4 s). Halten Sie die Ratte 10 s lang in Handschuhen, damit sie sich ausruhen kann. Wiederholen Sie dieses Muster für 3 min.
      2. In der zweiten Sitzung legen Sie eine Vorderpfote der Ratte auf den Protokolltisch, indem Sie die andere Vorderpfote mit einer Hand zurückhalten und den Rücken und die Hinterpfoten der Ratte mit der anderen Hand halten (siehe Schritt 5.1.2.1). Bewegen Sie sich horizontal auf dem Tisch von Ende zu Ende in 4 s, so dass die Ratte mit ihrer freien Pfote treten kann. Halten Sie die Ratte 10 s lang in Handschuhen, damit sie sich ausruhen kann, und wiederholen Sie dies mit einer weiteren Vorderpfote, gefolgt von der Ruhezeit. Wiederholen Sie dieses Muster abwechselnd zwischen den beiden Vorderpfoten und ruhen Sie sich 3 Minuten aus.
      3. Wiederholen Sie den Trainingsschritt 3 Mal für jeweils 1 Minute.
    3. Tag 3
      1. Befolgen Sie in der ersten Sitzung das in Schritt 5.1.2.2 beschriebene Verfahren für eine Vorderpfote. Wiederholen Sie dies mit einer weiteren Vorderpfote, gefolgt von der Ruhephase. Wiederholen Sie dieses Muster abwechselnd zwischen den beiden Vorderpfoten und ruhen Sie sich 3 Minuten aus.
      2. Befolgen Sie in der zweiten Sitzung das in Schritt 5.1.2.2 beschriebene Verfahren.
  2. Test
    HINWEIS: Der Schritttest wird vor der Operation, 2 und 4 Wochen nach der stereotaktischen Operation, durchgeführt, um die Akinesie der kontralateralen Vordergliedmaße und die mögliche Verletzung durch 6-OHDA zu bewerten.
    1. Halten Sie die Ratte in einem Winkel von 45 ° zur Oberfläche, immobilisieren Sie ihre Hintergliedmaßen und lassen Sie nur eines der Vordergliedmaßen, wie oben erläutert, für Tag 3 des Trainings auf der Plattform ruhen.
    2. Ziehen Sie die Ratte über eine Entfernung von 90 cm in 4 s nach vorne, wobei die rechte oder linke Pfote auf der Oberfläche ruht.
    3. Machen Sie sich Notizen und quantifizieren Sie die Anzahl der Vorhand-Anpassungsschritte, die mit jeder Pfote in jede Richtung unternommen werden.

Ergebnisse

Beurteilung der dopaminergen Läsion
Der Schritttest ermöglicht die Beurteilung der Akinesie der vorderen Extremität kontralateral zur Läsion und die Auswahl von Tieren mit einer möglichen Läsion des nigrostriatalen Signalwegs, die durch eine 6-OHDA-Infusion induziert wird (Abbildung 1). Der Vergleich der Leistung des kontralateralen Vorderbein-Stepping-Tests vor der Operation und 2 Wochen und 4 Wochen nach der Operation ergab eine Wechselwirkung (F2,74 = ...

Diskussion

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Durchführung einer Operation zur einseitigen Mikroinfusion von 6-OHDA im MFB, das in der Lage ist, robuste Läsionen in den Neuronen des nigrostriatalen Weges zu verursachen und Akinesie beim Tier zu erzeugen. Ebenfalls beschrieben wird das Protokoll für die Durchführung des Schritttests, ein leicht anwendbarer und nichtinvasiver Test, mit dem der Erfolg der Läsionen nachgewiesen und die Akinesie der Vordergliedmaßen beurteilt werden kann. Wie in den repräsentativen Ergebn...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der São Paulo Research Foundation (FAPESP, Zuschuss 2017/00003-0) unterstützt. Wir sind dankbar für die Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES). Wir danken Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner und Dr. Kuei Y. Tseng für die Unterstützung und das Mentoring.

Materialien

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_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acidSigma Aldrich795437https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
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