파킨슨 병의 6- 히드 록시 도파민 쥐 모델

요약

6-하이드록시도파민(6-OHDA) 모델은 파킨슨병에 대한 이해를 높이기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 내측 전뇌 다발에 6-OHDA를 주입하여 쥐의 일방적 인 nigrostriatal 병변을 수행하는 방법을 보여주고, 운동 결핍을 평가하고, 스테핑 테스트를 사용하여 병변을 예측합니다.

초록

파킨슨 병 (PD)의 운동 증상 - 서맥 운동증, 무감각 및 휴식시 떨림 - 실질적 nigra pars compacta (SNc) 및 도파민성 삼중 결핍에서 도파민성 뉴런의 신경 변성의 결과입니다. 동물 모델은 실험실에서 인간 병리학을 시뮬레이션하는 데 널리 사용되었습니다. 설치류는 취급 및 유지 보수의 용이성으로 인해 PD에 가장 많이 사용되는 동물 모델입니다. 더욱이, PD의 해부학 및 분자, 세포 및 약리학 적 메커니즘은 설치류와 인간에서 유사하다. 쥐의 내측 전뇌 다발(MFB)에 신경독소인 6-하이드록시도파민(6-OHDA)을 주입하면 도파민성 뉴런의 심각한 파괴가 재현되고 PD 증상을 시뮬레이션합니다. 이 프로토콜은 PD의 래트 모델에서 MFB에서 6-OHDA의 일방적 미세주사를 수행하는 방법을 보여주고, 6-OHDA에 의해 유도된 운동 결핍 및 스테핑 테스트를 통해 예측된 도파민성 병변을 보여준다. 6-OHDA는 대측성 앞다리로 수행되는 여러 단계에서 심각한 손상을 일으 킵니다.

서문

PD의 주요 신경 병리학 적 특징은 흑질파 콤팩타 (SNc)에서 도파민성 뉴런의 만성 진행성 신경 변성과 α 시누클레인 단백질을 함유 한 Lewy 바디의 존재^입니다1. SNc 도파민성 뉴런이 악성협 경로를 통해 축삭돌기를 선조체로 투사함에 따라, SNc에서 뉴런의 신경변성은 선조체²에서 도파민성 결핍을 초래한다. 선조체에 도파민이 없으면 PD의 주요 운동 증상 인 운동 운동 (느린 움직임), 서동 운동 (운동 시작의 어려움), 근육 경직 및 휴식시 떨림^3,4,5.

PD의 발병에 관여하는 분자 및 생리학적 메카니즘이 아직 완전히 이해되지 않았기 때문에, 현재 이용가능한 주요 치료법들은 약물요법, 심뇌 자극^6,7, 유전 요법⁸, 및 세포 이식⁹을 통해 운동 증상을 완화시키려고 노력한다. 따라서, 전임상 연구는 PD의 발병에 관여하는 기전을 밝히고 ^PD10에 의해 영향을 받는 뉴런의 퇴행을 예방하거나 정지시키기 위한 조기 진단 및 새로운 치료법을 위한 새로운 방법론을 발견하는 데 필수적이다.

동물 모델은 실험실에서 인간의 병리학을 시뮬레이션하는 데 널리 사용되어 의학 및 과학의 발전에 기여합니다.^11,12,13,14. 그러나 동물 모델의 올바른 선택이 연구의 성공을위한 기본이라는 것을 강조하는 것이 중요합니다. 따라서 동물 모델은 세 가지 주요 측면에서 검증되어야합니다 : i) 동물 모델이 인간 병리학의 특성을 가져야하는 얼굴 타당성; ii) 동물 모델이 견고한 이론적 근거를 가져야하는 건설적인 타당성; iii) 동물 모델이 임상 치료와 유사한 방식으로 치료에 반응해야하는 예측 타당성.

현재, 몇몇 동물들이 PD를 위한 동물 모델로서 사용되고 있다. 주요 그룹에는 설치류, 영장류, 미니 피그, 개 및 고양이와 같은 포유류 및 초파리 및 제브라 피쉬와 같은 다른 그룹이 포함됩니다. 설치류는 PD를위한 가장 고전적인 동물 모델이며 취급 및 유지 보수의 용이성으로 인해 가장 많이 사용됩니다. 또한, PD의 해부학 및 분자, 세포 및 약리학적 메카니즘은 설치류 및 인간에서 유사하다¹⁵.

2019 년 Kin과 동료들이 발표 한 리뷰는 2000 년대에 PD에 사용 된 주요 동물 모델 방법론을 분석한 결과, 가장 많이 사용되는 동물 모델은 6-하이드록시도파민 (6-OHDA) 및 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘 (MPTP)과 같은 신경 독소와 관련이 있음을 발견했습니다. 두 신경독소 모두 니그로스트리아 경로의 도파민성 뉴런에서 미토콘드리아 조절 장애를 일으켜 세포 사멸을 초래합니다¹⁶. 널리 사용되는 또 다른 모델은 PD의 발병에 관여하는 특정 유전자의 돌연변이를 통한 유전자 조작을 포함하며, 이는 미토콘드리아 조절 장애를 일으킨다¹⁷. 신경독소 모델은 일반적으로 치료제를 평가하고 비교하는 데 사용되는 반면, 유전자 모델은 예방 요법 및 특발성 ^PD15의 개발을 연구하는 데 사용됩니다.

신경독소 MPTP는 일곱 명의 환자가 이 물질을 사용한 후 1980년대 중반에 파킨슨증을 일으키는 것으로 밝혀졌으며 심각한 PD 증상을 나타내었다. 증상 외에도 환자들은 L-DOPA로 치료하여 연구원이 분자를 PD에 직접 연결하게했습니다. 이 사건이 1986년에 발표된 후, 몇몇 연구자들은 전임상 PD 연구¹⁸에서 MPTP를 사용하기 시작했다. 연구자들은 친유성 분자 인 MPTP가 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과하여 MPP ^{+ 19}로 전환 될 수 있음을 발견했습니다. 이 독성 물질은 뉴런 내부에 축적되어 미토콘드리아 호흡 사슬의 복합체 1에 손상을 일으켜 도파민성 뉴런²⁰의 죽음을 초래합니다.

6-OHDA 신경독소 모델은 ¹⁹⁶⁸²¹년 니그로스트리아 경로의 모노아민 뉴런의 변성을 유도하기 위해 처음 사용되었다. 6-OHDA 모델은 도파민 유사체이며 카테콜아민 함유 세포에 독성이 있기 때문에 nigrostriatal 경로에서 신경 변성을 일으키는 데 일반적으로 사용됩니다. 6-OHDA가 뇌에 들어간 후, 도파민성 뉴런에서 도파민 수송체 (DAT)에 의해 흡수되어 nigrostriatal 경로의 퇴행을 초래할 수 있습니다²². 6-OHDA는 BBB에 침투하지 않기 때문에, 뇌출혈성 입체택시 주사²³을 통해 직접 투여되어야 한다. 노르아드레날린 재흡수 억제제는 종종 6-OHDA 미세주사와 결합하여 노르아드레날린 섬유를 보존하고 도파민성 뉴런의 보다 선택적 변성을 제공합니다²⁴.

DAT가 6-OHDA를 섭취한 후, 뉴런의 시토졸에 축적되어 반응성 산소 종(ROS)을 생성하고 세포 사멸을 유도합니다¹⁵. 6-OHDA의 세 가지 상이한 병변 모델이 빈번하게 사용된다: i) ^SNc25,26에 대한 병변; ii) 선조체에 병변^27,28; iii) ^MFB29,30에 대한 병변. 선조체에서 발생하는 병변은 SNpc에서 도파민성 뉴런의 느리고 역행적인 퇴화를 초래한다. 대조적으로, SNpc 및 MFB에서 야기된 병변은 뉴런의 급속하고 총체적인 퇴행을 초래하여, 더 진행된 파킨슨병 증상으로 이어진다³¹.

6-OHDA의 일방적 또는 양측 주사는 도파민성 뉴런에서 신경 변성을 일으킬 수 있습니다. 6-OHDA가 항상 뉴런에 심각한 손상을 일으키는 것은 아닙니다. 때때로, 주사는 부분적인 손상을 초래하며, 이는 또한 ^PD32의 초기 단계를 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 일방적 인 주사는 암페타민 / 아포모르핀 유도 회전 및 스테핑 테스트²⁹와 같은 테스트를 통해 동물의 운동 결핍을 평가하고 세포 손실을 예측하는 모델의 능력으로 인해 더 일반적으로 사용됩니다. 양측 주사는 공간 기억과 인식을 평가하는데 가장 많이 사용된다³³.

암페타민/아포모르핀 유도 회전 검사는 nigrostriatal 경로에서 세포 손실을 예측하는 데 일반적으로 사용되는 행동 검사입니다. 도파민 작용제의 반복 투여가 6-OHDA-병변 동물에서 회전 거동을 강화시키는 과정으로 정의된다³⁴. 회전 거동은 일방적으로 병변 설치류에서 암페타민으로 유도된 동측성 회전 또는 아포모르핀-유도된 대측성 회전을 정량화하는 것으로 구성된다. 약물-유도된 회전 거동은 회전이 인간의 PD 증상과 일치하지 않으며 내성, 감작 및 "프라이밍"³⁵과 같은 변수에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 비판을 받아왔다.

프라이밍은 이러한 행동 테스트에서 가장 중요한 요소 중 하나입니다. L-DOPA의 단일 투여가 회전 거동에 실패를 초래하는 일부 사례가 보고되었다³⁶. 추가적으로, 암페타민-유도된 검정 및 병용 사용을 위한 아포모르핀-유도된 시험의 조합된 적용과 관련된 또 다른 중요한 인자는 상이한 작용 기작 때문에 상이한 종점을 측정하고, 상이한 신호전달 메커니즘 및 경로의 불활성화를 반영한다는 것이다. 또한, 암페타민 유도 검사는 50-60 % 이상의 nigrostriatal 병변을 측정하는 것이 더 정확하지만 아포모르핀 유도 검사는 80 % 이상의 병변에 대해 더 정확합니다 ³⁷.

스테핑 테스트는 도파민성 뉴런 변성 및 치료 효과와 관련된 결핍을 나타내는 행동 테스트로 등장했습니다. 그것은 약물 유도 절차없이 도파민성 뉴런에서 6-OHDA 병변에 의해 야기 된 무감각증의 분석을 가능하게합니다. 또한이 테스트는 Olsson et ^al.35에 의해 처음 설명 된 1995 년부터 잘 확립되고 일반적으로 사용되었습니다. 1999 년 Chang et ^al.38 은 또한 스테핑 테스트에서 쥐의 성능을 6-OHDA에 의한 퇴화 수준과 분석하고 비교했으며 스테핑 테스트에서 더 나쁜 성능을 수행 한 동물도 도파민성 뉴런의 더 중요한 변성을 가지고 있음을 발견했습니다.

스테핑 테스트는 6-OHDA 병변 쥐에서 심각한 도파민성 nigrostriatal 손상을 예측하는 훌륭한 방법입니다. 증거에 따르면 SNc의 도파민성 손실 정도가 >90 % ³⁹ 일 때 스테핑 테스트 중에 6-OHDA 주입의 대측성 앞다리에 운동 결핍이 나타납니다. 이 논문은 쥐의 MFB에 6-OHDA를 일방적으로 주입하기 위해 입체 택시 수술을 수행하는 데 사용되는 프로토콜, 방법론 및 재료와 스테핑 테스트를 통해 독소에 의해 유발되는 도파민성 병변을 예측하는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 국가 동물 실험 통제 협의회 (CONCEA) 및 Arouca Law (Law 11.794/2008)의 윤리적 원칙을 따랐으며 지역 윤리위원회 (CEUA-FFCLRP / USP (18.5.35.59.5))의 승인을 받았습니다.

1. 약물의 제조

1. 케타민/자일라진을 사용한 마취
   참고 : 사용 된 케타민의 용량은 70 mg / kg이며 자일라진의 용량은 10 mg / kg입니다.
   1. 케타민 100mg/mL 용액과 크실라진 20mg/mL 용액을 사용하여 마취제 1mL를 준비하려면 케타민 용액 0.35mL, 자일라진 용액 0.25mL, 0.9% 멸균 식염수 0.4mL를 섞는다. 마취 용액을 2 mL / kg의 최종 부피로 투여하십시오.
      참고 : 케타민은 자일라진과 함께 60-80 분 동안 진정 작용을 일으킬 수 있습니다. 동물이 여전히 반사 신경을 가지고 있다면 (예를 들어, 뒷다리 피칭 및 / 또는 깜박이는 반사), 개별 복용량의 10 %를 추가로 투여하십시오.
2. 이미프라민
   참고 : 사용 된 imipramine의 개별 용량은 20mg / kg입니다.
   1. 이미프라민 20mg/mL 용액 1mL를 준비하려면 이미프라민 20mg과 0.9% 멸균 식염수 1mL를 섞는다. 이미프라민 용액을 1 mL/kg의 최종 부피로 투여하십시오.
3. 멜록시캄
   참고 : 사용 된 멜록시캄의 개별 용량은 1mg / kg입니다.
   1. 멜록시캄 1mg/mL 용액 1mL를 준비하려면 멜록시캄 2% 0.05mL와 0.9% 멸균 식염수 0.95mL를 섞는다. 멜록시캄 용액을 이틀 동안 하루에 한 번 1 mL / kg의 최종 부피로 투여하십시오.
4. 아스코르브산 0.1%
   1. 0.1% 아스코르브산 1mL를 준비하려면 아스코르브산 1mg과 0.9% 멸균 식염수 1mL를 섞는다.
5. 6-하이드록시도파민(6-오다)
   참고 : 6-OHDA는 뇌의 도파민성 및 노르 아드레날린 성 뉴런을 선택적으로 파괴하는 데 사용되는 신경 독소입니다. 눈, 코 및 입의 피부 및 점막과의 직접적인 접촉을 피하십시오. 6-OHDA를 취급 할 때는 이중 니트릴 장갑, 실험실 코트, 일회용 가운, 눈 보호 및 외과 용 마스크 또는 안면 보호구를 착용하십시오. 독소의 총 주입 부피는 4 μL / 동물이며, 개별 양은 6-OHDA / 동물의 10 μg입니다.
   1. 2.5mg/mL의 최종 농도로 1mL의 6-OHDA를 준비하려면 6-OHDA 2.5mg과 0.1% 아스코르브산이 포함된 0.9% 식염수 용액 1mL를 혼합합니다(상기 설명).
      참고: 6-OHDA는 빛에 민감하며 밝은 빛에 노출되면 더 빨리 분해됩니다. 빛으로부터 보호되는 환경에서 적절하게 취급되고 저장되어야 합니다. 용액의 색이 붉은 색이면 버리십시오.
6. 리도카인 염산염 (2%)
   1. 동물에게 국소 적용하기 위해 2 % 리도카인 용액을 준비하십시오.
      참고 : 적용 할 수있는 최대 용량은 7mg / kg입니다.
7. 폴리 항생제 현탁액
   참고 : 스트렙토 마이신과 페니실린이있는 폴리 항생제 현탁액 ( 재료 표 참조)은 적용 당시 희석제 전체 부피로 준비해야하며, 앰플은 바이알과 분말과 함께 제공됩니다.
   1. 고무 마개에 있는 금속 디스크를 제거합니다. 고무 마개를 알코올로 소독하십시오.
   2. 23 G의 바늘이있는 주사기를 사용하여 희석제를 바이알에 주입하십시오. 바늘을 제거하고 현탁액이 완전히 균질화 될 때까지 바이알을 격렬하게 흔든다. 바이알에 약간의 공기를 주입하고 원하는 양의 현탁액을 철회하십시오.
   3. 깊은 근육 주사를 투여하고 약물을 주입하기 전에 플런저를 당겨 혈관에 도달하지 않도록하십시오.
      참고: 적용되는 현탁액의 최종 부피는 0.5 mL/kg입니다.

2. 재료의 제조

참고: 화학 물질을 취급할 때는 항상 재료 안전 데이터 시트와 함께 제공된 지침을 따르십시오.

1. 입체 택시 장치
   1. 스테레오 택시 장치를 적절한 조명으로 안정적이고 깨끗한 벤치에 올려 놓고 수술을 수행하십시오. 장치를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
   2. 장치의 귀와 절개 막대가 올바르게 정렬되어 있는지 확인하십시오. 수술 중에 동물을 배치 할 수있는 열 담요를 놓아 시술 중에 따뜻하게 유지하십시오. 정확한 직장 프로브로 동물의 온도를 모니터링하십시오.
      참고 : 열 담요는 동물이 37 ° C의 체온을 유지할 수 있도록 37.5 ° C에 있어야합니다.
2. 미세주입 시스템
   1. 의료용 폴리에틸렌 마이크로튜빙에 부착된 해밀턴 주사기(50 μL 또는 원하는 대로)를 채우고(70-80%), 바늘을 이중 증류수(_ddH2O)로 채우고 시스템을 통해 누출이 있는지 확인합니다.
   2. 단일 기포가 주사기 내의 _ddH2O를 마이크로튜브 내의 6-OHDA 용액으로부터 분리하도록 시스템을 통해 공기를 끌어당깁니다.
      참고 :이 절차는 해밀턴 주사기를 6-OHDA로 오염시키는 것을 피하고 동일한 실험 일에 여러 마리의 쥐를 사용할 수 있습니다.
   3. 해밀턴 주사기를 주입 펌프에 올려 놓으면 주사기가 단단히 부착되고 주사기의 플런저가 밀어 넣기 위해 움직일 프레임과 평행합니다. 주입 펌프를 0.5 μL / min의 속도로 설정하여 4 μL의 6-OHDA의 총 적용이 8 분 동안 지속되도록하십시오. 누출이 없으며 이전에 설정 한 시간과 부피에 따라 주입이 발생하는지 확인하여 주입 시스템을 테스트하십시오.
   4. 마이크로 튜브에 부착 된 주입 바늘을 입체 택시 암 끝의 장치에 부착하고 바늘이 표면에 180 ° 각도로 위치하는지 확인하십시오. 바늘이 똑바로 구부러지지 않았는지 확인하십시오.
      참고 : 주입 시스템의 항목 중 하나가 올바르게 작동하지 않으면 수술의 성공을 위태롭게 할 수 있으므로 설명 된 모든 절차를주의 깊게 확인하십시오.
3. 봉합 사
   1. 3/8 원형 바늘이있는 멸균 나일론 비 흡수성 봉합사를 사용하여 수술 후 절개를 봉합하십시오.
4. 수술 후 회복 부위
   1. 완전히 회복 될 때까지 동물을 모니터링 할 수있는 깨끗하고 멸균 된 하우징 박스를 놓습니다 (터치 및 조작에 반응). 온도 조절을 위해 상자에 열 담요를 넣으십시오.
      참고: 온도 조절이 중요하므로 필요한 경우 체온을 유지하기 위해 보충 열원을 포함시키십시오.

3. 수술 절차

참고: 이 프로토콜에서, 성인 수컷 Sprague-Dawley 래트 (200-250 g)는 온도 (22 ± 2 °C), 공기 교환 (15-20 교환 / 시간) 및 밝은 어둠의 사이클 (12 h / 12 h)의 통제 된 조건 하에서 유지되었으며, 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 3 마리 또는 4 마리의 동물이있는 상자로 그룹화되었습니다.

1. 수술 후 며칠 동안 체중 변화를 모니터링하기 위해 동물의 무게를 측정하십시오. 투여 할 약물의 복용량을 계산하십시오.
2. 이미프라민을 수술 30분 전(마취 투여 전 ~10-15분), 27G 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 복강내 투여한다.
   참고: 이미프라민은 노르아드레날린 수송체(NAT)를 차단하고 노르아드레날린 뉴런에 의한 6-OHDA 흡수를 방지하여 병변을 도파민성 뉴런에 더 선택적으로 만듭니다⁴⁰.
3. 이미프라민 투여 후 10-15분 후, 27G 바늘과 1 mL 주사기를 사용하여 복강내 케타민/자일라진 마취를 투여한다. 동물이 완전히 마취 될 때까지 기다리십시오. 동물이 뒷다리 꼬집음에 반응하지 않고 깜박이는 반사를 보이지 않을 때 동물이 깊은 마취 상태에 있는지 확인하십시오.
4. 절개가 발생할 머리 부위에서 쥐의 모피를 면도하십시오.
5. 쥐를 입체 택시 장치에 위치시킨다.
   1. 머리를 절치 막대 위에 놓고 막대를 인터럴 라인 아래 3.3mm 고정하십시오.
   2. 한 번에 한쪽의 이어 바를 배치합니다. 절치 막대와 귀 막대를 배치하여 두개골 상단이 직선이고 표면과 평행하도록 하십시오.
   3. 코 클램프를 조정하고 머리가 단단하고 양쪽으로 움직이지 않는지 테스트하십시오.
6. 각막이 마르지 않도록 쥐 눈에 멸균 안과 연고를 바르십시오.
7. 포비돈 - 요오드를 절개 할 부위에 바르면 부위를 소독 할 수 있습니다.
8. 절개 부위의 진통제에 대한 국소 리도카인을 적용; 7 mg / kg을 초과하지 마십시오.
9. 멜록시캄을 27 G 바늘 및 1 mL 주사기를 사용하여 피하 투여한다.
   참고 : Meloxicam은 수술 후 동물의 회복을 돕는 비 스테로이드 성 항염증 진통제입니다.
10. 폴리항생제 현탁액을 23 G 바늘 및 1 mL 주사기를 사용하여 근육내 투여한다.
    참고 : 폴리 항생제 현탁액은 수술 후 회복에서 가능한 박테리아 감염을 피하기 위해 예방 적 치료로 투여됩니다.
11. 뒷발을 핀셋으로 꼬집어 깜박이는 반사 신경이나 뒷다리 반사 신경을 확인하여 동물이 깊은 마취 상태에 있는지 확인하십시오.
12. 메스로 미세 주사가 발생할 부위에서 ~ 1.5cm의 절개를하십시오.
    참고 : 멸균 기술은이 시점부터 상처가 닫힐 때까지 적용됩니다.
13. Bregma와 Lambda가 보일 때까지 면봉과 면봉으로 두개골 부위를 청소하십시오. Bregma와 Lambda를 멸균 된 고급 펜으로 표시하십시오.
14. Bregma와 Lambda의 등쪽-복부(DV) 좌표가 비슷한지 확인합니다. 그들이 다른 경우, 쥐의 머리가 올바르게 위치하지 않기 때문에 입체 택시 장치에서 쥐를 다시 조정하십시오.
15. Bregma의 전후(AP) 및 평범한(ML) 좌표를 적어 둡니다.
16. ⁴¹에 따라 오른쪽 MFB의 AP 및 ML 좌표로 이동하십시오 : AP : -4.3 mm, ML : 1.6 mm 브레그마에서.
17. 멸균 된 미세 펜으로 떨림의 영역을 표시하십시오.
18. 멸균 된 드릴로 천천히 동물의 두개골을 관통하여 경막이 손상되지 않도록주의하십시오.
19. 미세주사 바늘을 경막 매트에 놓고 DV 좌표를 확인합니다. 얇은 바늘을 가져 와서 경막 매트를 부드럽게 파열시킵니다. 미세 주입이 일어날 MFB의 DV 좌표 (8.3mm 복부)에 바늘을 삽입하십시오.
20. 미세주입 펌프를 작동시켜 6-OHDA 용액을 MFB 내로 방출한다. 미세 주입이 끝나면 해밀턴 주사기를 점검하여 4μL의 6-OHDA가 주입되었는지 확인하십시오.
    참고 : 미세 주사는 8 분 동안 지속되어야합니다.
21. 6-OHDA의 투여 후, 약물의 역류를 피하기 위해 바늘을 제거하기 전에 10 분 동안 기다리십시오. 미세 주사 바늘을 동물의 뇌에서 천천히 제거하십시오.
22. 포비돈 요오드로 절개 부위를 다시 소독하십시오.
23. 절개 부위를 ~ 3-4 개의 수술 매듭으로 봉합하십시오.
    참고: 매듭이 너무 강하거나 너무 느슨해서는 안 됩니다.
24. 입체 택시 장치에서 쥐를 제거하고 동물이 마취에서 완전히 회복 될 때까지 열 담요 위의 회복을 위해 깨끗한 상자에 넣으십시오. 마취에서 완전히 깨어날 때까지 15 분마다 동물을 관찰하십시오.

4. 수술 후 절차

1. 수술 후 다음 나흘 동안 동물의 체중을 모니터링하십시오. 수술 후 이틀 동안 하루에 한 번 피하 멜록시캄으로 치료하고 매일 체중에 맞게 복용량을 조정하십시오.
   참고 : 모든 동물은 수술 후 셋째 날에 진통제의 필요성을 평가해야합니다.
2. 적어도 나흘 동안 매일 절개를 검사하여 감염되지 않았는지 확인하십시오. 절개가 치유 될 때까지 열, 붓기, 통증, 배출 및 발적을 찾으십시오.
3. 동물의 체중을 모니터링하여 식욕과 물 소비량을 확인하십시오. 동물들이 먹도록 격려하기 위해 젖은 사료를주십시오. 수술 후 적어도 나흘 동안 매일 일반적인 신체 상태, 태도 및 이동성을 관찰하십시오. 수술 후 7-10 일 후에 봉합사를 제거하십시오.
   참고: 윤리적 절차에 정의된 종점에 도달한 경우 동물을 안락사시켜야 합니다.

5. 스테핑 테스트

1. 훈련
   참고 : 동물은 시험 전에 사흘 동안 훈련해야합니다. 아래에 설명 된 프로토콜에 따르면, 훈련은 하루에 두 번, 아침에 한 번, 오후에 한 번, 또는 세션 사이에 적어도 2 시간의 간격으로 이루어져야합니다. 타이머를 사용하여 시간을 추적합니다.
   1. 1일차
      1. 첫 번째 세션에서는 쥐가 핸들러 / 실험자에게 익숙해 질 수 있도록 ~ 1-2 분 동안 장갑을 끼고 쥐를 다루십시오.
      2. 두 번째 세션에서는 쥐를 20 초 동안 잡고 20 초 동안 프로토콜 테이블에 배치하는 것을 번갈아 가며 사용합니다. 이 훈련 단계를 3분 동안 반복하여 쥐에게 스테핑 테스트를 위한 실험 설정을 익히십시오.
   2. 2일째
      1. 첫 번째 세션에서는 뒷발을 잡고 한 손으로 쥐의 앞발을 프로토콜 테이블에 놓습니다. 먼저 쥐를 아래쪽으로 기울여 프로토콜 테이블의 평평한 표면에 45° 각도로 기울입니다. 테이블에서 끝에서 끝까지 수평으로 움직여 쥐가 양쪽 발로 테이블을 밟을 수있게하십시오 (4 초에 90cm를 덮으십시오). 쥐를 장갑에 10 초 동안 잡고 휴식을 취하십시오. 이 패턴을 3 분 동안 반복하십시오.
      2. 두 번째 세션에서는 한 손으로 다른 앞발을 뒤로 잡고 다른 손으로 쥐의 등받이와 뒷발을 잡고 프로토콜 테이블에 쥐의 앞발 하나를 놓습니다 (5.1.2.1 단계 참조). 4 초 안에 테이블에서 끝에서 끝까지 수평으로 움직여 쥐가 자유로운 발로 밟을 수있게하십시오. 쥐를 장갑에 10 초 동안 잡고 휴식을 취하고 다른 앞발로 반복하고 휴식 기간을 반복하십시오. 이 패턴을 반복하고 두 앞발을 번갈아 가며 3 분 동안 휴식을 취하십시오.
      3. 훈련 단계를 각각 1 분 동안 3 번 반복하십시오.
   3. 3 일째
      1. 첫 번째 세션에서는 하나의 앞발에 대해 5.1.2.2 단계에서 설명한 절차를 따르십시오. 다른 앞발로 반복하고 나머지 기간을 반복하십시오. 이 패턴을 반복하고 두 앞발을 번갈아 가며 3 분 동안 휴식을 취하십시오.
      2. 두 번째 세션에서는 5.1.2.2단계에서 설명한 절차를 따릅니다.
2. 테스트
   참고 : 스테핑 테스트는 수술 전, 입체 택시 수술 후 2 및 4 주 후에 수행되어 대측성 앞다리의 무감각 및 6-OHDA로 인한 부상 가능성을 평가합니다.
   1. 쥐를 표면에 45 ° 각도로 잡고 뒷다리를 고정시키고 위에서 설명한 것처럼 앞다리 중 하나만 플랫폼에 놓을 수 있도록하십시오 훈련 3 일째.
   2. 쥐를 4 초 안에 90cm의 거리로 앞으로 드래그하고 오른쪽 또는 왼쪽 발이 표면에 놓여 있습니다.
   3. 메모를하고 각 발이 각 방향으로 수행 된 포핸드 조정 단계의 수를 정량화하십시오.

결과

도파민성 병변 평가
스테핑 테스트는 병변에 대측하는 전방 사지의 무감각 증을 평가하고 6-OHDA 주입에 의해 유도 된 nigrostriatal 경로의 가능한 병변을 가진 동물의 선택을 가능하게합니다 (그림 1). 대측성 앞다리 스테핑 시험 전술과 수술 후 2주 및 4주의 성능을 비교한 결과, 시간(수술 전, 2주 및 4주)과 치료(가짜 수술 및 6-OHDA-병변) 사이의 상호작용(_F2,74

토론

이 논문은 MFB에서 6-OHDA의 일방적 인 미세 주입을위한 수술을 수행하기위한 프로토콜을 설명하며, nigrostriatal 경로의 뉴런에 강력한 병변을 유발하고 동물에서 무감각 증을 생성 할 수 있습니다. 또한 스테핑 테스트를 수행하기 위한 프로토콜이 설명되며, 병변의 성공을 증명하고 앞다리 무감각증을 평가하는데 사용될 수 있는 쉽게 적용 가능하고 비침습적 검사이다. 대표적인 결과에서 제시된 바?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OHDA	Sigma Aldrich	H4381	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	795437	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL	Hamilton	80539	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine	Alfa Aeser	J63723	https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump	Insight	EFF-311	https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino)	Ourofino		https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic	Zoetis		https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic	Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus	Insight	EFF-331	https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN