Parkinson Hastalığının 6-hidroksidopamin Sıçan Modeli

Özet

6-hidroksidopamin (6-OHDA) modeli, Parkinson Hastalığının anlaşılmasını ilerletmek için on yıllardır kullanılmaktadır. Bu protokolde, medial ön beyin demetine 6-OHDA enjekte ederek, motor eksiklikleri değerlendirerek ve basamaklama testini kullanarak lezyonları tahmin ederek sıçanda tek taraflı nigrostriatal lezyonların nasıl gerçekleştirileceğini gösteriyoruz.

Özet

Parkinson hastalığının (PD) motor semptomları -bradikinezi, akinezi ve istirahatte titreme- substantia nigra pars compacta (SNc) ve dopaminerjik striatal defisitteki dopaminerjik nöronların nörodejenerasyonunun sonuçlarıdır. Hayvan modelleri, laboratuvarda insan patolojisini simüle etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kemirgenler, kullanım ve bakım kolaylığı nedeniyle PD için en çok kullanılan hayvan modelleridir. Ayrıca, PD'nin anatomisi ve moleküler, hücresel ve farmakolojik mekanizmaları kemirgenlerde ve insanlarda benzerdir. Nörotoksinin, 6-hidroksidopaminin (6-OHDA), sıçanların medial bir ön beyin demetine (MFB) infüzyonu, dopaminerjik nöronların ciddi tahribatını yeniden üretir ve PD semptomlarını simüle eder. Bu protokol, PD'nin bir sıçan modelinde MFB'de 6-OHDA'nın tek taraflı mikroenjeksiyonunun nasıl yapılacağını gösterir ve 6-OHDA'nın neden olduğu motor eksiklikleri gösterir ve basamaklama testi ile dopaminerjik lezyonları tahmin eder. 6-OHDA, kontralateral ön ayakla gerçekleştirilen adım sayısında önemli bozulmaya neden olur.

Giriş

PD'nin başlıca nöropatolojik özellikleri, substantia nigra pars compacta'daki (SNc) dopaminerjik nöronların kronik ilerleyici nörodejenerasyonu ve α-sinüklein proteini içeren Lewy cisimlerinin ^{varlığıdır1}. SNc dopaminerjik nöronlar aksonlarını nigrostriatal yoldan striatuma yansıtırken, SNc'deki nöronların nörodejenerasyonu striatumda dopaminerjik bir eksiklik ile ^{sonuçlanır2}. Striatumda dopamin yokluğu, PD'nin ana motor semptomlarından sorumlu olan doğrudan ve dolaylı motor kontrol yollarının faaliyetlerinde dengesizliğe neden olur: akinezi (yavaş hareket), bradikinezi (hareketlere başlamada zorluk), kas sertliği ve istirahatte titreme3,4,5.

PH'nin başlangıcında rol oynayan moleküler ve fizyolojik mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamadığından, şu anda mevcut olan başlıca tedaviler, farmakoterapiler, derin beyin stimülasyonu6,7, genetik ^tedaviler8 ve hücre ^nakli9 yoluyla motor semptomları hafifletmeyi amaçlamaktadır. Bu nedenle, preklinik araştırmalar, PD'nin başlangıcında yer alan mekanizmaları aydınlatmak ve erken tanı için yeni metodolojiler ve ^PD10'dan etkilenen nöronların dejenerasyonunu önlemek veya durdurmak için yeni tedaviler keşfetmek için temeldir.

Hayvan modelleri, laboratuvarda insan patolojisini simüle etmek için yaygın olarak kullanılmış, tıp ve bilimin ilerlemesine katkıda bulunmuştur11,12,13,14. Bununla birlikte, hayvan modelinin doğru seçiminin çalışmanın başarısı için temel olduğunu vurgulamak önemlidir. Bu nedenle, hayvan modeli üç ana açıdan doğrulanmalıdır: i) hayvan modelinin insan patolojisinin özelliklerine sahip olması gereken yüz geçerliliği; ii) hayvan modelinin sağlam bir teorik temele sahip olması gereken yapıcı geçerlilik; ve iii) hayvan modellerinin tedavilere klinik tedaviye benzer şekilde yanıt vermesi gereken öngörücü geçerlilik.

Şu anda, PD için hayvan modelleri olarak birkaç hayvan kullanılmaktadır. Ana gruplar arasında kemirgenler, primatlar, minidomuzlar, köpekler ve kediler gibi memeliler ve drosophila ve zebra balığı gibi diğer gruplar bulunur. Kemirgenler, PD için en klasik hayvan modelidir ve kullanım ve bakım kolaylıkları nedeniyle en çok kullanılanlardır. Ek olarak, PD'nin anatomisi ve moleküler, hücresel ve farmakolojik mekanizmaları kemirgenlerde ve insanlarda ^benzerdir15.

Kin ve meslektaşları tarafından 2019 yılında yayınlanan bir derleme, 2000'lerde PD için kullanılan başlıca hayvan modeli metodolojilerini analiz etti ve en çok kullanılan hayvan modelinin 6-hidroksidopamin (6-OHDA) ve 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) gibi nörotoksinleri içerdiğini buldu. Her iki nörotoksin de nigrostriatal yoldaki dopaminerjik nöronlarda mitokondriyal disregülasyona neden olarak hücre ölümüne yol ^açar16. Yaygın olarak kullanılan bir diğer model, PD'nin başlangıcında yer alan spesifik genlerdeki mutasyon yoluyla genetik manipülasyonu içerir ve mitokondriyal disregülasyona neden ^olur17. Nörotoksin modelleri, terapötikleri değerlendirmek ve karşılaştırmak için yaygın olarak kullanılırken, genetik modeller önleyici tedavilerin ve idiyopatik ^PD15'in gelişimini incelemek için kullanılır.

Nörotoksin MPTP'nin, yedi hasta maddeyi kullandıktan ve ciddi PD semptomları sergiledikten sonra 1980'lerin ortalarında parkinsonizme neden olduğu keşfedildi. Semptomlara ek olarak, hastalar L-DOPA ile tedaviye yanıt verdiler, bu da araştırmacıların molekülü doğrudan PD'ye bağlamasını sağladı. Vaka 1986 yılında yayınlandıktan sonra, birkaç araştırmacı klinik öncesi PD araştırmalarında MPTP kullanmaya ^başladı18. Araştırmacılar, lipofilik bir molekül olan MPTP'nin kan-beyin bariyerini (BBB) geçebileceğini ve MPP ^{+ 19'a} dönüştürülebileceğini bulmuşlardır. Bu toksik madde nöronların içinde birikir ve mitokondriyal solunum zincirinin kompleks 1'ine zarar vererek dopaminerjik nöronların ölümüne yol ^açar20.

6-OHDA nörotoksin modeli ilk olarak ^196821'de nigrostriatal yolun monoamin nöronlarının dejenerasyonunu indüklemek için kullanılmıştır. 6-OHDA modeli, bir dopamin analoğu olduğu ve katekolamin içeren hücreler için toksik olduğu için nigrostriatal yolda nörodejenerasyona neden olmak için yaygın olarak kullanılır. 6-OHDA beyne girdikten sonra, dopaminerjik nöronlardaki dopamin taşıyıcısı (DAT) tarafından alınabilir ve nigrostriatal yolun dejenerasyonuna yol ^açabilir22. 6-OHDA BBB'ye nüfuz etmediğinden, doğrudan intraserebral stereotaksik enjeksiyon yoluyla ^{uygulanmalıdır23}. Bir noradrenalin geri alım inhibitörü, noradrenerjik lifleri korumak ve dopaminerjik nöronların daha seçici bir dejenerasyonunu sağlamak için genellikle 6-OHDA mikroenjeksiyonu ile ^{birleştirilir24}.

DAT 6-OHDA'yı aldıktan sonra, nöronların sitosolünde birikecek, reaktif oksijen türleri (ROS) üretecek ve hücre ölümüne yol ^{açacaktır15}. 6-OHDA'nın üç farklı lezyon modeli sıklıkla kullanılır: i) ^SNc25,26'ya lezyonlar; ii) striatuma ^{lezyonlar27,28}; iii) ^MFB29,30'a lezyonlar. Striatumda neden olan lezyonlar, SNpc'de dopaminerjik nöronların yavaş ve retrograd dejenerasyonuna neden olur. Buna karşılık, SNpc ve MFB'de neden olan lezyonlar, nöronların hızlı ve toplam dejenerasyonuna neden olarak daha ileri parkinson semptomlarına yol ^açar31.

Tek taraflı veya bilateral 6-OHDA enjeksiyonu, dopaminerjik nöronlarda nörodejenerasyona neden olabilir. 6-OHDA her zaman nöronlarda ciddi hasara neden olmaz; Bazen, enjeksiyon ^PD32'nin erken aşamalarını simüle etmek için de kullanılan kısmi hasara neden olur. Tek taraflı enjeksiyon, modelin hayvanın motor açıklarını değerlendirme ve amfetamin / apomorfin kaynaklı rotasyon ve basamaklama ^testi29 gibi testlerle hücre kaybını tahmin etme kabiliyeti nedeniyle daha yaygın olarak kullanılır. Bilateral enjeksiyonlar en çok uzamsal hafızayı ve tanımayı değerlendirmek için ^{kullanılır33}.

Amfetamin / apomorfin kaynaklı rotasyon testi, nigrostriatal yolaktaki hücre kaybını tahmin etmek için yaygın olarak kullanılan davranışsal bir testtir. Dopamin agonistlerinin tekrar tekrar uygulanmasının 6-OHDA lezyonlu hayvanlarda rotasyonel davranışın yoğunlaşmasına yol açtığı bir süreç olarak ^{tanımlanır34}. Rotasyonel davranış, tek taraflı lezyonlu kemirgenlerde amfetamin kaynaklı ipsilateral rotasyon veya apomorfin kaynaklı kontralateral dönüşlerin ölçülmesinden oluşur. İlaca bağlı rotasyonel davranış eleştirilmiştir, çünkü rotasyon insanlarda PD semptomlarına karşılık gelmez ve tolerans, duyarlılaşma ve "astarlama" gibi değişkenlerden ^{etkilenebilir35}.

Astarlama, bu davranış testlerinde en kritik faktörlerden biridir. Tek doz L-DOPA'nın rotasyonel davranışlarda başarısızlığa yol açtığı bazı vakalar ^{bildirilmiştir36}. Ek olarak, paralel kullanım için amfetamin kaynaklı test ve apomorfin kaynaklı testin kombine uygulanmasıyla ilgili bir diğer kritik faktör, farklı sinyal mekanizmalarının ve yolaklarının inaktivasyonunu yansıtan farklı etki mekanizmaları nedeniyle farklı uç noktaları ölçmeleridir. Ayrıca, amfetamin kaynaklı test% 50-60'ın üzerindeki nigrostriatal lezyonları ölçmek için daha doğruyken, apomorfin ile indüklenen test% 80'in üzerindeki lezyonlar için daha ^doğrudur37.

Step testi, dopaminerjik nöron dejenerasyonu ve terapötik etkileri ile ilgili eksiklikleri gösteren davranışsal bir test olarak ortaya çıkmıştır. Dopaminerjik nöronlarda 6-OHDA lezyonunun neden olduğu akinezinin ilaca bağlı bir prosedür olmadan analiz edilmesini sağlar. Ayrıca, test Olsson ve ^ark.35 tarafından ilk kez tanımlandığı 1995 yılından beri iyi kurulmuş ve yaygın olarak kullanılmaktadır. 1999 yılında, Chang ve ^ark.38 ayrıca basamaklama testindeki sıçanların performansını 6-OHDA'nın neden olduğu dejenerasyon seviyesi ile analiz etmiş ve karşılaştırmış ve basamaklama testinde daha kötü performans gösteren hayvanların da dopaminerjik nöronların daha anlamlı bir dejenerasyonuna sahip olduğunu bulmuşlardır.

Step testi, 6-OHDA lezyonlu sıçanlarda ciddi dopaminerjik nigrostriatal hasarı tahmin etmek için mükemmel bir yöntemdir. Kanıtlar, SNc'deki dopaminerjik kayıp derecesinin% >90 olduğu basamak testi sırasında 6-OHDA infüzyonunun kontralateral ön ayağında motor eksikliklerin ortaya çıktığını ^{göstermektedir39}. Bu yazıda, sıçanların MFB'sine 6-OHDA'nın tek taraflı infüzyonu için stereotaksik cerrahi yapmak için kullanılan protokoller, metodolojiler ve materyaller ve toksinin neden olduğu dopaminerjik lezyonların basamak testi ile nasıl tahmin edileceği açıklanmaktadır.

Protokol

Hayvanları içeren tüm prosedürler, Ulusal Hayvan Deneylerinin Kontrolü Konseyi (CONCEA) ve Arouca Yasası'nın (Yasa 11.794/2008) etik ilkelerini takip etti ve yerel etik komitesi (CEUA-FFCLRP / USP (18.5.35.59.5) tarafından onaylandı.

1. İlaçların hazırlanması

1. Ketamin/Ksilazin ile anestezi
   NOT: Kullanılan ketamin dozu 70 mg / kg'dır ve ksilazin dozu 10 mg / kg'dır.
   1. Ketamin 100 mg / mL çözeltisi ve ksilazin 20 mg / mL çözeltisi kullanarak 1 mL anestezik hazırlamak için, 0.35 mL ketamin çözeltisi, 0.25 mL ksilazin çözeltisi ve 0.4 mL% 0.9 steril tuzlu su çözeltisini birleştirin. Anestezik solüsyonu 2 mL/kg'lık son hacimde uygulayın.
      NOT: Ketamin, ksilazin ile birlikte 60-80 dakika boyunca sedasyon üretebilir. Hayvanın hala refleksleri varsa (örneğin, arka bacak atışı ve / veya yanıp sönme refleksi), bireysel dozun% 10'unu uygulayın.
2. Imipramin
   NOT: Kullanılan bireysel imipramin dozu 20 mg / kg'dır.
   1. 1 mL imipramin 20 mg / mL çözeltisi hazırlamak için, 20 mg imipramin ve 1 mL% 0.9 steril salin çözeltisini birleştirin. İmipramin çözeltisini 1 mL/kg'lık son hacimde uygulayın.
3. Meloksikam
   NOT: Kullanılan bireysel meloksikam dozu 1 mg / kg'dır.
   1. 1 mL meloksikam 1 mg / mL çözeltisi hazırlamak için,% 2 0.05 mL meloksikam ve% 0.95 mL% 0.9 steril salin çözeltisini birleştirin. Meloksikam çözeltisini iki gün boyunca günde bir kez 1 mL / kg'lık son bir hacimde uygulayın.
4. Askorbik asit% 0.1
   1. 1 mL% 0.1 askorbik asit hazırlamak için, 1 mg askorbik asit ve 1 mL% 0.9 steril tuzlu su çözeltisini birleştirin.
5. 6-hidroksidopamin (6-OHDA)
   NOT: 6-OHDA, beyindeki dopaminerjik ve noradrenerjik nöronları seçici olarak yok etmek için kullanılan bir nörotoksindir. Gözlerin, burnun ve ağzın cilt ve mukoza zarlarıyla doğrudan temastan kaçının. 6-OHDA kullanırken çift nitril eldiven, laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık önlük, göz koruması ve cerrahi maske veya yüz kalkanı kullanın. Toksinin toplam infüzyon hacmi 4 μL / hayvandır ve bireysel miktar 10 μg 6-OHDA / hayvandır.
   1. 2.5 mg / mL'lik bir son konsantrasyonda 1 mL 6-OHDA hazırlamak için,% 0.1 askorbik asit içeren 2.5 mg 6-OHDA ve% 0.9 salin çözeltisinin 1 mL'sini karıştırın (yukarıda tarif edilmiştir).
      NOT: 6-OHDA ışığa duyarlıdır ve parlak ışığa maruz kaldığında daha hızlı bozulur. Işıktan korunan bir ortamda uygun şekilde kullanılmalı ve saklanmalıdır. Çözeltinin rengi kırmızımsı ise, atın.
6. Lidokain hidroklorür (%2)
   1. Hayvana yerel uygulama için% 2 lidokain çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Uygulanabilecek maksimum doz 7 mg/kg'dır.
7. Poli-antibiyotik süspansiyonu
   NOT: Streptomisinler ve penisilinler içeren poli-antibiyotik süspansiyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız), uygulama sırasında, ampulü şişeye toz ile eşlik eden tüm seyreltici hacmi ile hazırlanmalıdır.
   1. Kauçuk tıpa üzerindeki metalik diski çıkarın. Kauçuk tıpayı alkolle dezenfekte edin.
   2. 23 G'lık bir iğne ile bir şırınga kullanarak, seyrelticiyi şişeye enjekte edin. İğneyi çıkarın ve süspansiyon tamamen homojenize olana kadar şişeyi kuvvetlice sallayın. Şişeye biraz hava enjekte edin ve istenen süspansiyon hacmini geri çekin.
   3. Derin bir kas içi enjeksiyon uygulayın, hiçbir kan damarına ulaşılmadığından emin olmak için ilacı enjekte etmeden önce pistonu çekin.
      NOT: Uygulanacak süspansiyonun son hacmi 0,5 mL/kg'dır.

2. Malzemelerin hazırlanması

NOT: Kimyasalları işlerken her zaman malzeme güvenlik bilgi formunda verilen talimatları izleyin.

1. Stereotaksik aparat
   1. Stereotaksik cihazı, ameliyatı gerçekleştirmek için uygun aydınlatmaya sahip sabit ve temiz bir tezgaha yerleştirin. Aparatı% 70 etanol ile dezenfekte edin.
   2. Cihazın kulak ve kesici çubuklarının doğru hizalanmış olup olmadığını kontrol edin. İşlem sırasında sıcak kalmak için ameliyat sırasında hayvanın yerleştirileceği yere termal bir battaniye yerleştirin. Hayvanın sıcaklığını doğru bir rektal prob ile izleyin.
      NOT: Termal battaniye 37.5 ° C'de olmalıdır, böylece hayvan vücut ısısı 37 ° C'lik bir vücut sıcaklığını korur.
2. Mikroinfüzyon sistemi
   1. Tıbbi sınıf polietilen mikrotüpe ve çift damıtılmış suya (_ddH2O) sahip bir iğneye bağlı bir Hamilton şırıngasını (50 μL veya istenildiği gibi) doldurun (%70-80) ve sistemden sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
   2. Havayı sistemden çekin, böylece tek bir hava kabarcığı şırıngadaki _ddH2O'yu mikrotüp içindeki 6-OHDA çözeltisinden ayırır.
      NOT: Bu prosedür, Hamilton şırıngasının 6-OHDA ile kirlenmesini önler ve aynı deney gününde birkaç sıçanın kullanılmasına izin verir.
   3. Hamilton şırıngasını infüzyon pompası üzerine yerleştirin, böylece sıkıca tutturulur ve şırınganın pistonu, itmek için hareket edecek çerçeveye paralel olur. İnfüzyon pompasını 0,5 μL/dak hıza ayarlayın, böylece toplam 4 μL 6-OHDA uygulaması 8 dakika sürer. İnfüzyon sistemini, sızıntı olmadığını ve infüzyonun önceden ayarlanan zaman ve hacme göre gerçekleştiğini doğrulayarak test edin.
   4. Mikrotüpe bağlı infüzyon iğnesini stereotaksik kolun ucundaki aparata takın ve iğnenin yüzeye 180 ° açıyla yerleştirildiğini kontrol edin. İğnenin düz olduğundan ve bükülmediğinden emin olun.
      NOT: Açıklanan tüm prosedürleri dikkatlice kontrol edin, çünkü infüzyon sistemindeki öğelerden herhangi biri düzgün çalışmazsa, ameliyatın başarısını tehlikeye atabilir.
3. Dikiş
   1. Ameliyattan sonra insizyonu dikmek için 3/8 daire iğneli steril naylon emilemeyen bir dikiş kullanın.
4. Ameliyat sonrası iyileşme bölgesi
   1. Tamamen iyileşene kadar hayvanların izlenebileceği temiz ve sterilize edilmiş bir muhafaza kutusu yerleştirin (dokunma ve manipülasyona duyarlı). Termoregülasyon için kutuya termal bir battaniye koyun.
      NOT: Termoregülasyon önemli olduğundan, gerekirse vücut ısısını korumak için ek bir ısı kaynağı ekleyin.

3. Cerrahi prosedür

NOT: Bu protokolde, yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları (200-250 g), kontrollü sıcaklık (22 ± 2 ° C), hava değişimi (15-20 değişim / saat) ve açık-karanlık döngüler (12 saat / 12 saat) koşulları altında, yiyecek ve suya serbest erişimi olan 3 veya 4 hayvanlı kutularda gruplandırılmış olarak tutulmuştur.

1. Ameliyatı takip eden günlerde kilo değişikliklerini izlemek için hayvanları tartın. Uygulanacak ilaçların dozunu hesaplayın.
2. 27 G iğne ve 1 mL şırınga kullanarak, imipramini ameliyattan 30 dakika önce intraperitoneal olarak (anestezi uygulamadan önce ~ 10-15 dakika) uygulayın.
   NOT: İmapramin, noradrenalin taşıyıcısını (NAT) bloke edecek ve noradrenerjik nöronlar tarafından 6-OHDA alımını önleyecek ve lezyonu dopaminerjik nöronlara daha seçici hale ^{getirecektir40}.
3. Imipramin uygulamasından 10-15 dakika sonra, 27 G iğne ve 1 mL şırınga kullanarak intraperitoneal ketamin / ksilazin anestezisini uygulayın. Hayvan tamamen uyuşturulana kadar bekleyin. Hayvan arka bacak sıkışmasına cevap vermediğinde ve göz kırpma refleksi göstermediğinde hayvanın derin anestezi altında olduğunu doğrulayın.
4. Sıçanın kürkünü, insizyonun gerçekleşeceği baş bölgesinde tıraş edin.
5. Sıçanı stereotaksik cihaza yerleştirin.
   1. Kafayı kesici çubuğun üzerine yerleştirin ve çubuğu işitsel çizginin 3,3 mm altına sabitleyin.
   2. Kulak çubuklarını her seferinde bir tarafa yerleştirin. Kesici çubuğu ve kulak çubuklarını, kafatasının üst kısmı düz ve yüzeye paralel olacak şekilde konumlandırın.
   3. Burun kelepçesini ayarlayın ve başın sağlam olduğunu ve her iki tarafa da hareket etmediğini test edin.
6. Korneaların kurumasını önlemek için sıçan gözlerine steril oftalmik merhem uygulayın.
7. Bölgeyi dezenfekte etmek için kesilecek bölgeye povidon-iyot uygulayın.
8. Kesi bölgesinin analjezisi için lokal lidokain uygulayın; 7 mg/kg'ı geçmemelidir.
9. Meloksikamı 27 G'lik bir iğne ve 1 mL'lik bir şırınga kullanarak deri altından uygulayın.
   NOT: Meloksikam, hayvanın ameliyat sonrası iyileşmesine yardımcı olacak steroid olmayan bir anti-enflamatuar analjeziktir.
10. Poli-antibiyotik süspansiyonunu 23 G'lik bir iğne ve 1 mL'lik bir şırınga kullanarak kas içinden uygulayın.
    NOT: Poli-antibiyotik süspansiyonu, ameliyat sonrası iyileşmede olası bakteriyel enfeksiyonları önlemek için profilaktik bir tedavi olarak uygulanır.
11. Arka pençeyi cımbızla sıkıştırarak göz kırpma reflekslerini veya arka bacak reflekslerini kontrol ederek hayvanın derin anestezi durumunda olup olmadığını kontrol edin.
12. Bir neşter ile, mikroenjeksiyonun gerçekleşeceği bölgede ~ 1.5 cm'lik bir kesi yapın.
    NOT: Bu noktadan yara kapanana kadar steril teknikler uygulanır.
13. Bregma ve Lambda görülene kadar kafatası bölgesini pamuklu çubuklar ve pamuklu tomurcuklarla temizleyin. Bregma ve Lambda'yı sterilize edilmiş ince bir kalemle işaretleyin.
14. Bregma ve Lambda'nın dorsal-ventral (DV) koordinatlarının benzer olup olmadığını kontrol edin. Eğer farklılarsa, sıçanın başı doğru şekilde konumlandırılmadığından stereotaksik aparattaki sıçanı yeniden ayarlayın.
15. Bregma'nın anteroposterior (AP) ve mediolateral (ML) koordinatlarını not edin.
16. Bregma'dan ⁴¹: AP: -4.3 mm, ML: 1.6 mm'ye göre sağ MFB'nin AP ve ML koordinatlarına geçin.
17. Trepanasyon bölgesini sterilize edilmiş ince bir kalemle işaretleyin.
18. Sterilize edilmiş bir matkapla, dura materine zarar vermemeye özen göstererek hayvanın kafatasını yavaşça delin.
19. Mikroenjeksiyon iğnesini dura mater üzerine yerleştirin ve DV koordinatlarını not edin. İnce bir iğne alın ve dura materini nazikçe yırtın. İğneyi, mikroenjeksiyonun gerçekleşeceği MFB'nin DV koordinatına (8,3 mm ventral) yerleştirin.
20. 6-OHDA çözeltisini MFB'ye serbest bırakmak için mikroenjeksiyon pompasını çalıştırın. Mikroenjeksiyon bittiğinde, 4 μL 6-OHDA enjekte edilip edilmediğini görmek için Hamilton şırıngasını kontrol edin.
    NOT: Mikroenjeksiyon 8 dakika sürmelidir.
21. 6-OHDA'nın uygulanmasından sonra, ilacın geri akışını önlemek için iğneyi çıkarmadan önce 10 dakika bekleyin. Mikroenjeksiyon iğnesini hayvanın beyninden yavaşça çıkarın.
22. Kesi bölgesini povidon-iyot ile tekrar dezenfekte edin.
23. Kesi bölgesini ~3-4 cerrahi düğüm ile dikişleyin.
    NOT: Düğüm çok güçlü veya çok gevşek olmamalıdır.
24. Sıçanı stereotaksik aparattan çıkarın ve hayvan anesteziden tamamen iyileşene kadar termal battaniyenin üzerinde iyileşmek için temiz bir kutuya yerleştirin. Anesteziden tamamen uyanana kadar hayvanı her 15 dakikada bir gözlemleyin.

4. Postoperatif işlemler

1. Ameliyattan sonraki dört gün boyunca hayvanların ağırlığını izleyin. Ameliyattan sonraki iki gün boyunca günde bir kez deri altından meloksikam ile tedavi edin ve dozu her günün ağırlığı için ayarlayın.
   NOT: Tüm hayvanlar ameliyattan sonraki üçüncü gün analjezik ihtiyacı açısından değerlendirilmelidir.
2. Enfekte olmadıklarından emin olmak için insizyonları en az dört gün boyunca günlük olarak kontrol edin. Kesiler iyileşene kadar ısı, şişlik, ağrı, akıntı ve kızarıklık olup olmadığına bakın.
3. Hayvanın vücut ağırlığını izleyerek iştahı ve su tüketimini kontrol edin. Hayvanları yemeye teşvik etmek için ıslak yem verin. Ameliyattan sonra en az dört gün boyunca genel vücut durumunu, tutumunu ve hareketliliğini günlük olarak gözlemleyin. Ameliyattan 7-10 gün sonra dikişleri alın.
   NOT: Etik prosedürlerde tanımlanan bitiş noktalarına ulaşılması halinde hayvanlar ötenazi yapılmalıdır.

5. Adım atma testi

1. Antrenman
   NOT: Hayvanlar testten üç gün önce eğitilmelidir. Aşağıda açıklanan protokole göre, eğitim günde iki kez, sabah bir kez ve öğleden sonra bir kez veya seanslar arasında en az 2 saat aralıklarla yapılmalıdır. Bir zamanlayıcı kullanarak saati izleyin.
   1. 1. Gün
      1. İlk seansta, sıçanın işleyici / deneyci ile tanışmasını sağlamak için sıçanı ~ 1-2 dakika eldivenlerde tutarak tutun.
      2. İkinci seansta, sıçanı 20 s tutmak ve 20 s için protokol masasına yerleştirmek arasında geçiş yapın. Sıçanı basamaklama testi için deney düzeneğine alıştırmak için bu eğitim adımını 3 dakika boyunca tekrarlayın.
   2. 2. Gün
      1. İlk seansta, sıçanın her iki ön pençesini de arka pençelerini tutarak ve bir elinizle geri tutarak protokol masasına yerleştirin. Sıçanı, protokol masasının düz yüzeyine 45°'lik bir açıyla baş aşağı doğru eğin. Masanın üzerinde uçtan uca yatay olarak hareket ettirin, sıçanın her iki pençeyle de masaya basmasına izin verin (4 saniyede 90 cm örtün). Sıçanı eldivenlerde 10 s tutun ve dinlenmesine izin verin; Bu kalıbı 3 dakika boyunca tekrarlayın.
      2. İkinci seansta, diğer ön pençeyi bir elinizle geriye doğru tutarak ve sıçanın sırt ve arka pençelerini diğer elinizle tutarak sıçanın bir ön pençesini protokol masasına yerleştirin (bkz. adım 5.1.2.1). Masanın üzerinde 4 saniye içinde uçtan uca yatay olarak hareket ettirin ve sıçanın serbest pençesiyle adım atmasına izin verin. Sıçanı eldivenlerde 10 s tutun, dinlenmesine izin verin ve başka bir ön pençe ile tekrarlayın, ardından dinlenme süresi izleyin. İki ön pençe arasında değişen bu deseni tekrarlayın ve 3 dakika dinlenin.
      3. Eğitim adımını her biri 1 dakika boyunca 3 kez tekrarlayın.
   3. 3. Gün
      1. İlk seansta, bir ön pençe için adım 5.1.2.2'de açıklanan prosedürü izleyin. Başka bir ön pençe ile tekrarlayın, ardından dinlenme süresi gelir. İki ön pençe arasında değişen bu deseni tekrarlayın ve 3 dakika dinlenin.
      2. İkinci oturumda, adım 5.1.2.2'de açıklanan yordamı izleyin.
2. Test
   NOT: Step testi, ameliyattan önce, stereotaksik cerrahiden 2 ve 4 hafta sonra, kontralateral ön ayağın akinezisini ve 6-OHDA'nın neden olduğu olası yaralanmayı değerlendirmek için yapılır.
   1. Sıçanı yüzeye 45 ° 'lik bir açıyla tutun, arka bacaklarını hareketsiz hale getirin ve ön ayaklardan sadece birinin, yukarıda açıklandığı gibi, eğitimin 3. günü için platformda durmasına izin verin.
   2. Sıçanı, sağ veya sol pençe yüzeyde duracak şekilde 4 saniyede 90 cm'lik bir mesafe boyunca ileri doğru sürükleyin.
   3. Notlar alın ve her bir pençe ile her yönde atılan forehand ayarlama adımlarının sayısını ölçün.

Sonuçlar

Dopaminerjik lezyon değerlendirmesi
Basamaklama testi, lezyona karşı ön ekstremitenin akinezisinin değerlendirilmesini ve 6-OHDA infüzyonunun neden olduğu nigrostriatal yolun olası bir lezyonu olan hayvanların seçilmesini sağlar (Şekil 1). Kontralateral ön ayak stepleme testinin cerrahi öncesi ve ameliyattan 2 hafta 4 hafta sonraki performansının karşılaştırılması, zaman (ameliyat öncesi, 2 ve 4 hafta sonra) ile tedavi (sahte ameliyat ve 6-OHDA lezy...

Tartışmalar

Bu yazıda, nigrostriatal yolun nöronlarında sağlam lezyonlara neden olabilen ve hayvanda akinezi üretebilen, MFB'de 6-OHDA'nın tek taraflı mikroinfüzyonu için cerrahi yapmak için bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, lezyonların başarısını kanıtlamak ve ön ayak akinezisini değerlendirmek için kullanılabilecek kolay uygulanabilir ve noninvaziv bir test olan stepping testini gerçekleştirme protokolü de açıklanmaktadır. Temsili sonuçlarda sunulduğu gibi, 6-OHDA alan hayvanlar, yaralanmaya kar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OHDA	Sigma Aldrich	H4381	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	795437	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL	Hamilton	80539	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine	Alfa Aeser	J63723	https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump	Insight	EFF-311	https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino)	Ourofino		https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic	Zoetis		https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic	Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus	Insight	EFF-331	https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN