A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
בפרוטוקול זה, נקודות קוונטיות המצומדות לספייק SARS-CoV-2 רקומביננטי מאפשרות בדיקות מבוססות תאים כדי לפקח על קשירת ספייק ל- hACE2 בקרום הפלזמה ואנדוציטוזיס לאחר מכן של החלבונים הכרוכים לתוך הציטופלסמה.
פיתוח טכנולוגיות חדשות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תאית הקל על שיטות סינון בתפוקה גבוהה לגילוי תרופות. נקודות קוונטיות הן חלקיקים פלואורסצנטיים עם תכונות פוטופיזיות מעולות חדורות פוטולומינציה בהירה ויציבה, כמו גם רצועות פליטה צרות. נקודות קוונטיות הן כדוריות בצורתן, ועם השינוי הנכון של כימיית פני השטח, ניתן להשתמש בהן כדי להטות ביומולקולות עבור יישומים תאיים. מאפיינים אופטיים אלה, בשילוב עם היכולת לתפקד אותם עם ביומולקולות, הופכים אותם לכלי מצוין לחקירת אינטראקציות קולטן-ליגנד וסחר תאי. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בנקודות קוונטיות כדי לעקוב אחר הכריכה והאנדוציטוזיס של חלבון ספייק SARS-CoV-2. פרוטוקול זה יכול לשמש כמדריך לניסויים המעוניינים לנצל נקודות קוונטיות כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון וסחר בהקשר של פיזיולוגיה תאית.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת לחוקרים להציץ לתוך הפעולות הפנימיות של התא באמצעות צבעים מיוחדים1, חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית2, וננו-חלקיקים פלואורסצנטיים בצורה של נקודות קוונטיות (QDs)3. לתסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה של 2019 (SARS-CoV-2) המגפה העולמית, חוקרים השתמשו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להבין כיצד הנגיף אינטראקציה עם התא הן בקרום הפלזמה והן בציטופלסמה. לדוגמה, חוקרים הצליחו לקבל תובנות על הכריכה של חלבון ספייק SARS-CoV-2 על פני השטח של הנגיף לאנזים אנושיים המרת אנגיוטנסין 2 (hACE2) על פני השטח של תאים אנושיים, הפנמה לאחר מכן באמצעות היתוך בקרום הפלזמה, אנדוציטוזיס של קומפלקס חלבון Spike:hACE2 4,5. תובנות נהדרות הושגו גם ליציאה SARS-CoV-2 מהתאים דרך הליזוזום באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות תאית, תכונה ייחודית של נגיפי קורונה שנחשבו בעבר להתרחש באמצעות ניצני שלפוחית מסורתיים מהגולגי, כפי שהוא עם וירוסים רבים אחרים6. טכניקת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית התאית, המהווה עמוד התווך של כמעט כל ההיבטים של המחקר הביולוגי, התקדמה בהכרח ברוחב ובהיקף היישומים שלה, החל מהדמיית סופר-רזולוציה של בעלי חיים שלמים וכלה בהדמיה רב-פרמטרית אוטומטית בעלת תוכן גבוה להקרנת סמים. כאן, מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית בעלת תוכן גבוה מוחלת על המחקר של הזנת תאים SARS-CoV-2 באמצעות QDs פלורסנט מצומדים לחלבון ספייק הנגיפי.
ניתוח תוכן גבוה של תמונות שנוצרו על ידי פלטפורמות הדמיה ביולוגית מאפשר מיצוי גדול יותר של תובנות ביולוגיות יקרות ערך מאשר פרמטרים בודדים כגון עוצמה מלאה, כי ניתן להשיג באמצעות קורא לוחות רב מודאלי7. על-ידי הפרדת האובייקטים בשדה ראייה באמצעות אלגוריתמי פילוח אוטומטיים, ניתן לנתח כל אובייקט או אוכלוסייה של אובייקטים לקבלת פרמטרים כגון עוצמה, שטח ומרקם בכל ערוץ פלואורסצנטי זמין8. שילוב מדידות רבות לתוך ערכות נתונים מרובות משתנים היא גישה שימושית עבור פרופיל פנוטיפי. כאשר הפנוטיפ הרצוי ידוע, כגון הפנמת QD בצורה של puncta, ניתן להשתמש במדידות הקשורות puncta כגון גודל, מספר, ועוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול.
תוכנה לניתוח הדמיית תוכן גבוהה מבוססת ענן יכולה להכיל מגוון גדול של יציאות נתונים של מכשירים, כולל פלטפורמת הדמיית התוכן הגבוהה. באמצעות שרת מבוסס ענן לאחסון תמונות וניתוח מקוון, המשתמש יכול להעלות את הנתונים שלו ממכשיר ההדמיה או מכונן הרשת שבו הנתונים מאוחסנים. חלק הניתוח של הפרוטוקול מתבצע בתוך סביבת תוכנת הענן, וניתן לייצא נתונים במגוון תבניות קובץ להדמיית נתונים במורד הזרם.
נגיף SARS-CoV-2 מורכב מחלבונים לא מבניים ומבניים המסייעים בהרכבו ובשכפולו. לספייק SARS-CoV-2 יש שני תחומים הנקראים S1 ו- S2, כאשר S1 מכיל את תחום איגוד הקולטן האחראי לאינטראקציות hACE2 בקרום הפלזמה9. ספייק נמצא גם לקיים אינטראקציה עם מולקולות אחרות בקרום הפלזמה שעשויות לשמש כקולטנים משותפים בנוסף hACE210,11. לאורך רצף חלבון ספייק ובמיוחד בממשק S1/S2, ישנם אתרי מחשוף פרוטאז המאפשרים היתוך בממברנה לאחר פרוטאז סרין transmembrane 2 (TMPRSS2)12. חלבונים שונים של ספייק SARS-CoV-2 רקומביננטיים הופקו מתחומים מחייבים קולטנים בודדים, ל- S1, S2, S1 עם S2, וגוזמי ספייק שלמים מספקים מסחריים מרובים לשימוש בפעילויות מחקר13.
בעבודה זו, פני השטח של QDs היה פונקציונלי עם גוזמי ספייק רקומביננטי המכילים תג היסטידין (QD-Spike). ה-QDs המיוצרים על ידי המעבדה הימית לחקר ננו-חומרים אופטיים מכילים ליבת קדמיום סלניד ומעטפת אבץ גופרתית14,15. האבץ על פני השטח של QD מתאם את שאריות ההיסטידין בתוך החלבון הרומביננטי כדי ליצור QD פונקציונלי הדומה לחלקיק נגיפי SARS-CoV-2 בצורה ובתפקוד. הדור של חלקיקים והטיית חלבון תואר בעבר באמצעות QD-מצומד קולטן מחייב domain15. שיטה זו מתארת את ההכנות לתרבות התאים, טיפול QD, רכישת תמונה ופרוטוקול ניתוח נתונים שיכול להנחות חוקר בחקר פעילות ספייק SARS-CoV-2 בהקשר הפיזיולוגי של תא אנושי.
קו התא HEK293T המשמש במחקר זה הוא קו תאים מונצח. במחקר זה לא נעשה שימוש בנבדקים אנושיים או בעלי חיים.
1. פולחן תאים וזריעה
2. טיפול בתאים עם QD-ספייק
3. קיבעון וכתמי גרעינים
4. הגדרת רכישה והדמיה
5. ניתוח נתונים
6. ייצוא נתונים
7. לנתח את הנתונים בגיליון אלקטרוני
לאחר הטיפול, QDs יופנמו כמו חלקיקים ייקשרו ACE2 על קרום הפלזמה ולגרום אנדוציטוזיס. באמצעות קו תא מבטא ACE2-GFP, טרנסלוקציה של QDs ו- ACE2 ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר ההפנמה, שני אותות QD ו- ACE2 מראים colocalization חזק. מתמונות אלה ניתן לבצע פילוח תמונות וניתוחים הבאים כדי לחלץ פרמטרים ר?...
השיטה המתוארת במאמר זה מספקת את השלבים הדרושים להדמיית QDs פונקציונליים בתאים אנושיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה. שיטה זו מתאימה ביותר לתאים שבהם אנדוציטוזיס היא המסלול העיקרי של כניסה ויראלית ולא הפעילות של TMPRSS2 והיתוך ממברנה, כפי שהוא מאפשר את המחקר של SARS-CoV-2 ספייק ו hACE2 א...
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר הפנימית של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, NIH. מעבדת המחקר הימית סיפקה מימון באמצעות המכון הפנימי שלה למדעי הננו- מדעים. הכנת ריאגנט נתמכה באמצעות קרן הבסיס NRL COVID-19.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved