Imagerie confocale à haut débit des trimères de pointes SRAS-CoV-2 conjuguées aux points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose dans les cellules HEK293T

Résumé

Dans ce protocole, les points quantiques conjugués au pic recombinant du SARS-CoV-2 permettent aux tests cellulaires de surveiller la liaison du pic à hACE2 au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose ultérieure des protéines liées dans le cytoplasme.

Résumé

Le développement de nouvelles technologies pour la microscopie à fluorescence cellulaire a facilité les méthodes de criblage à haut débit pour la découverte de médicaments. Les points quantiques sont des nanoparticules fluorescentes avec d’excellentes propriétés photophysiques imprégnées d’une photoluminescence brillante et stable ainsi que de bandes d’émission étroites. Les points quantiques sont de forme sphérique et, avec la modification appropriée de la chimie de surface, peuvent être utilisés pour conjuguer des biomolécules pour des applications cellulaires. Ces propriétés optiques, combinées à la capacité de les fonctionnaliser avec des biomolécules, en font un excellent outil pour étudier les interactions récepteur-ligand et le trafic cellulaire. Ici, nous présentons une méthode qui utilise des points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Ce protocole peut être utilisé comme guide pour les expérimentateurs qui cherchent à utiliser des points quantiques pour étudier les interactions et le trafic protéine-protéine dans le contexte de la physiologie cellulaire.

Introduction

La microscopie à fluorescence permet aux chercheurs d’examiner le fonctionnement interne de la cellule à l’aide de colorants ^{spécialisés1}, de protéines fluorescentes génétiquement ^codées2 et de nanoparticules fluorescentes sous forme de points quantiques (QD)³. Pour la pandémie mondiale du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère de 2019 (SARS-CoV-2), les chercheurs ont utilisé la microscopie à fluorescence pour comprendre comment le virus interagit avec la cellule à la fois au niveau de la membrane plasmique et du cytoplasme. Par exemple, les chercheurs ont pu mieux comprendre la liaison de la protéine Spike du SRAS-CoV-2 à la surface du virion à l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2) à la surface des cellules humaines, l’internalisation ultérieure par fusion au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose du complexe protéique Spike:hACE24,5. De grandes connaissances ont également été acquises sur la sortie du SARS-CoV-2 des cellules via le lysosome à l’aide de l’imagerie par fluorescence cellulaire, une caractéristique unique des coronavirus que l’on pensait auparavant se produire via le bourgeonnement traditionnel des vésicules du Golgi, comme c’est le cas avec de nombreux autres ^virus6. Pilier de presque tous les aspects de la recherche biologique, la technique de microscopie à fluorescence cellulaire a nécessairement progressé dans son étendue et son champ d’application, de l’imagerie à super-résolution d’animaux entiers à l’imagerie multiparamétrique automatisée à haut contenu pour le dépistage de drogues. Ici, la microscopie confocale automatisée à haute teneur est appliquée à l’étude de l’entrée des cellules du SARS-CoV-2 à l’aide de QD fluorescents conjugués à la protéine de pointe virale.

L’analyse à haut contenu des images générées par les plates-formes d’imagerie biologique permet une plus grande extraction d’informations biologiques précieuses que des paramètres uniques tels que l’intensité du puits entier, que l’on obtiendrait à l’aide d’un lecteur de plaque ^multimodal7. En séparant les objets dans un champ de vision à l’aide d’algorithmes de segmentation automatisés, chaque objet ou une population d’objets peut être analysé pour des paramètres tels que l’intensité, la surface et la texture dans chaque canal de fluorescence ^disponible8. La combinaison de nombreuses mesures dans des ensembles de données multivariés est une approche utile pour le profilage phénotypique. Lorsque le phénotype souhaité est connu, comme l’internalisation du QD sous forme de puncta, on peut utiliser les mesures liées au puncta telles que la taille, le nombre et l’intensité pour évaluer l’efficacité d’un traitement.

Le logiciel d’analyse d’imagerie à haut contenu basé sur le cloud peut accueillir une grande variété de sorties de données d’instruments, y compris la plate-forme d’imagerie à haut contenu. En utilisant un serveur basé sur le cloud pour le stockage d’images et l’analyse en ligne, l’utilisateur peut télécharger ses données à partir de l’instrument d’imagerie ou du lecteur réseau où les données sont stockées. La partie analyse du protocole est effectuée dans l’environnement logiciel cloud, et les données peuvent être exportées dans une variété de formats de fichiers pour la visualisation des données en aval.

Le virus SARS-CoV-2 est composé de protéines non structurelles et structurelles qui aident à son assemblage et à sa réplication. Le pic du SRAS-CoV-2 a deux domaines appelés S1 et S2, S1 contenant le domaine de liaison aux récepteurs responsable des interactions hACE2 au niveau de la membrane ^plasmique9. Spike a également été trouvé pour interagir avec d’autres molécules à la membrane plasmique qui peuvent agir comme co-récepteurs en plus de hACE210,11. Tout au long de la séquence protéique de pointe et en particulier à l’interface S1/S2, il existe des sites de clivage de la protéase qui permettent la fusion au niveau de la membrane après la sérine transmembranaire protéase 2 (TMPRSS2)¹². Diverses protéines recombinantes de spike du SARS-CoV-2 ont été produites à partir de domaines de liaison de récepteurs individuels, à S1, S2, S1 avec S2 et à des trimères de pointe entiers de plusieurs fournisseurs commerciaux pour une utilisation dans des activités de ^recherche13.

Dans ce travail, la surface des QD a été fonctionnalisée avec des trimères de pointes recombinants contenant une étiquette d’histidine (QD-Spike). Les QD produits par naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section contiennent un noyau de séléniure de cadmium et une coque de sulfure de ^zinc14,15. Le zinc à la surface du QD coordonne les résidus d’histidine dans la protéine recombinante pour former un QD fonctionnalisé qui ressemble à une particule virale du SARS-CoV-2 dans sa forme et sa fonction. La génération des nanoparticules et la conjugaison des protéines ont été décrites précédemment à l’aide du domaine de liaison au récepteur conjugué ^QD15. Cette méthode décrit les préparations de culture cellulaire, le traitement QD, l’acquisition d’images et le protocole d’analyse de données qui peuvent guider un chercheur dans l’étude de l’activité du pic du SRAS-CoV-2 dans le contexte physiologique d’une cellule humaine.

Protocole

La lignée cellulaire HEK293T utilisée dans cette étude est une lignée cellulaire immortalisée. Aucun sujet humain ou animal n’a été utilisé dans cette étude.

1. Culture et ensemencement cellulaire

1. À l’intérieur d’une armoire stérile de biosécurité, en portant de l’équipement de protection individuelle (y compris des gants de laboratoire, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité), préparez le milieu de culture cellulaire en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) et 250 μg/mL de G418.
   1. Pour 500 mL de média, ajoutez 443,75 mL de DMEM, 50 mL de FBS, 5 mL de P/S et 1,25 mL de G418.
   2. Filtrer à travers une fiole filtrante de 0,2 μm et maintenir la stérilité pour éviter la contamination bactérienne.
2. À l’intérieur d’une armoire stérile de biosécurité, ensemencez l’intérieur de 60 puits d’une plaque noire de 96 puits recouverte de poly-D-lysine à fond clair avec 20 000 cellules dans 100 μL par puits de milieu de culture cellulaire. Remplir les 36 puits extérieurs avec 100 μL par puits de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   1. Pour compter les cellules, ajoutez 2 μL d’orange acridine et de coloration à l’iodure de propidium à 18 μL de suspension cellulaire.
   2. Chargez 10 μL de cette solution dans un côté d’une lame de comptage de cellules.
   3. Répétez les étapes 1.2.1. et 1.2.2. pour charger les deux côtés de la diapositive.
   4. Placez la diapositive dans un compteur de cellules automatisé.
   5. Sélectionnez le protocole de comptage de fluorescence et appuyez sur Count. Comptez les deux côtés de la diapositive et calculez la moyenne des deux densités de cellules vivantes.
   6. Pour calculer le volume de suspension cellulaire requis, divisez le nombre total de cellules nécessaires par la densité cellulaire moyenne.
3. Inspectez les puits après l’ensemencement au microscope optique pour vous assurer que la densité et la distribution appropriées ont été atteintes.
4. Incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de _CO2.

2. Traitement des cellules avec QD-Spike

1. Préparer 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) en diluant dans un milieu d’imagerie.
   1. Pour 10 mL de supports d’imagerie, ajouter 130 μL de 7,5 % de BSA et mélanger.
2. Dans un réservoir de 12 puits ou une plaque d’essai, diluer le stock de 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) à 20 nM en utilisant 0,1 % de BSA dans les milieux d’imagerie.
   1. Pour 1 puits de QD-Spike, ajouter 2,27 μL de 440 nM QD-Spike à 47,73 μL de milieu d’imagerie BSA à 0,1 % pour une concentration finale de 20 nM.
   2. Pour générer une dilution série 1:3 à six points (en triplicate), ajoutez 14,26 μL de QD-Spike à 285,74 μL de milieu d’imagerie BSA à 0,1 % pour obtenir la concentration la plus élevée de 20 nM. Ajouter 100 μL de 20 nM QD-Spike à 200 μL de milieu BSA à 0,1 % pour obtenir la deuxième dilution de 6,67 nM QD-Spike. Répétez quatre fois pour générer les six points de concentration.
3. À l’aide d’un aspirateur multicanal, retirez tous les supports usés de chaque puits. À l’aide d’une pipette multicanal, laver une fois avec un support d’imagerie (100 μL/puits).
4. Aspirer 100 μL de supports d’imagerie et ajouter 50 μL/puits de solution QD-Spike.
5. Incuber la plaque pendant 3 h dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de _CO2. Passez à l’étape 4.

3. Fixation et coloration des noyaux

1. À l’intérieur d’une armoire stérile de biosécurité, en portant de l’équipement de protection individuelle (y compris des gants de laboratoire, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité), préparez 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans un support d’imagerie BSA à 0,1 %.
2. Aspirer 50 μL de QD-Spike de chaque puits et ajouter 100 μL/puits de PFA à 4 %.
   1. Ne laissez pas les puits sécher. Utilisez une pipette multicanal automatisée pour éviter le séchage des puits (recommandé).
3. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
4. Laver trois fois avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
5. Préparer le colorant nucléaire rouge foncé en diluant la solution mère de 5 mM à une dilution de 1:1000 dans du PBS.
6. Aspirer le PBS et ajouter 50 μL/puits de colorant nucléaire dilué.
7. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
8. Laver trois fois avec PBS.
9. Imagez la plaque ou le joint à l’aide d’un scellant à plaques pour l’imagerie à une date ultérieure. Conserver la plaque à 4 °C. La fluorescence doit être stable pendant plusieurs semaines ou plus.

4. Configuration de l’acquisition et imagerie

1. Démarrez le logiciel de la plate-forme d’imagerie. Allumez la plate-forme d’imagerie à contenu élevé et le voyant de la barre d’état doit être allumé. Si la machine n’est pas connectée, le logiciel passera en mode d’analyse hors ligne.
2. Connectez-vous à la plateforme d’imagerie.
3. Créez un nouveau protocole d’acquisition.
   1. Sélectionnez Type de plaque comme plaque d’imagerie inférieure transparente à 96 puits.
      REMARQUE: La sélection de plaque dans l’instrument peut varier et peut être personnalisée en chargeant les définitions de plaque correctes qui incluent les dimensions de la plaque telles que la hauteur, la largeur et d’autres distances pour définir l’espacement des puits et les points focaux.
   2. Sélectionnez le mode optique comme confocal et le grossissement comme immersion dans l’eau 40x.
   3. Sélectionnez Binning comme 1.
   4. Choisissez les canaux et les longueurs d’onde d’excitation/émission fluorescentes comme décrit aux étapes 4.3.5-4.3.8. Prenez un instantané lorsque les paramètres sont sélectionnés pour afficher l’image et assurez-vous que les paramètres sont appropriés.
      REMARQUE: Le contraste de phase numérique (DPC) permettra la visualisation de cellules vivantes sans coloration cellulaire ni colorant fluorescent. Il n’est pas recommandé pour les cellules fixes.
   5. Sélectionnez le mode pour DPC tel que Contraste élevé pour produire des corps de cellule bien définis. Prenez un instantané pour confirmer que ce paramètre est approprié, comme indiqué dans la fenêtre d’image.
   6. Sélectionnez le canal FITC à utiliser avec la lignée cellulaire ACE2-GFP qui permet de visualiser le trafic ACE2 dans la cellule.
   7. Pour créer un canal personnalisé pour le canal QD, sélectionnez le menu déroulant triangle du canal et choisissez l’excitation dans la plage de 405 nm et l’émission dans la plage de 608 nm.
   8. Si les cellules ont été fixées et qu’un colorant nucléaire rouge profond a été utilisé, sélectionnez le canal rouge lointain avec une émission supérieure à 630 nm pour délimiter davantage le corps cellulaire et agir comme un masque cellulaire.
   9. Sélectionnez un puits avec un signal QD cytoplasmique puissant pour régler le temps d’exposition, la puissance du laser et la position en hauteur Z. Suivez les étapes de 4.3.10 à 4.3.13.
   10. Vérifiez si la hauteur par défaut produit une image où les cellules se trouvent dans le plan focal souhaité. Si les puncta endocytosés sont l’organite cible, la position Z sera plus basse que si la membrane plasmique est l’organite cible.
   11. Choisissez un temps d’exposition qui produit une image lumineuse avec des niveaux de gris au moins trois fois supérieurs au signal d’arrière-plan. C’est généralement entre 100 et 300 ms. À 20 nM, les niveaux de gris doivent être d’environ 6000 UA en utilisant un temps d’exposition de 200 ms et une puissance laser de 80%.
   12. Vérifiez les niveaux de gris en cliquant avec le bouton droit sur l’image produite avec la fonction Instantané dans chaque couche et en sélectionnant Afficher l’intensité. Ensuite, faites un clic gauche sur l’objet d’intérêt ou l’arrière-plan pour afficher le niveau de gris de ce pixel.
   13. Ajustez la puissance du laser pour affiner l’intensité des objets d’intérêt.
4. Enregistrez le protocole d’acquisition.
5. Basculez sur Exécuter l’expérience et entrez le nom de la plaque.
6. Exécutez l’expérience.

5. Analyse des données

1. Importez des données dans le logiciel d’imagerie.
   1. Après avoir acquis toutes les images, exportez les mesures vers le logiciel d’imagerie. Cela nécessite l’établissement d’un serveur et la création d’un compte. Créez un écran pour les données à exporter dans le logiciel d’imagerie.
2. Dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez Analyse d’image pour commencer à créer le protocole d’analyse.
3. Chargez les mesures de l’expérience d’imagerie en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le fichier dans la liste des écrans et en cliquant sur Sélectionner. La carte en plaques des puits imagés et leurs champs associés doivent être visibles dans le coin inférieur gauche de la fenêtre.
4. Choisissez un puits avec des taches QD cytoplasmiques brillantes pour commencer la segmentation de l’image.
5. Dans le bloc de construction de l’image d’entrée, sélectionnez Correction de champ plat.
6. Ajoutez le bloc de construction suivant au protocole en sélectionnant Rechercher des noyaux.
   1. Ici, utilisez le DPC ou le canal rouge lointain comme marqueur Nuclei.
   2. Sélectionnez d’abord la méthode qui segmente avec précision les objets, puis affinez la segmentation à l’aide du menu déroulant et du réglage des curseurs.
      REMARQUE: Une bonne segmentation définit avec précision la région d’intérêt (ROI) pour le noyau, la cellule et les taches. Seuls les pixels positifs pour le marqueur doivent être capturés dans un retour sur investissement individuel. Le signal de fond doit être exclu. Si l’arrière-plan est capturé dans le roi, la sensibilité de la méthode peut être diminuée ou le seuil d’intensité peut être augmenté pour augmenter la rigueur de l’algorithme de segmentation. Ceci s’applique à tous les blocs de construction Find.
7. Ensuite, ajoutez le bloc de construction Find Cytoplasm pour identifier le cytoplasme.
   1. Dans ce cas, utilisez le canal ACE2-GFP pour la segmentation cytoplasmique.
   2. Sélectionnez la méthode qui identifie le mieux le cytoplasme de chaque cellule.
8. Ensuite, ajoutez le bloc de construction Find Spots pour identifier le puncta QD-Spike.
   1. Sélectionnez les noyaux comme population de retour sur investissement.
   2. Sélectionnez la cellule comme région ROI. Cela capture le puncta dans toute la cellule.
   3. Sélectionnez la méthode qui identifie le mieux le puncta QD dans chaque cellule.
9. Une fois que tous les objets de l’image ont été segmentés et identifiés avec précision dans ce puits, choisissez d’autres puits pour vous assurer que les blocs de construction et les paramètres peuvent être généralement appliqués aux autres puits et à d’autres conditions.
10. Ajoutez les propriétés de calcul de l’intensité pour tous les objets segmentés (noyaux, cytoplasme/cellules et taches).
11. Ajoutez les propriétés de morphologie calculer pour tous les objets segmentés (noyaux, cytoplasme/cellules et taches).
12. Ajoutez les propriétés de calcul de texture pour tous les objets segmentés (noyaux, cytoplasme/cellules et taches).
13. Définissez les résultats en sélectionnant les paramètres de chaque population, y compris les noyaux et les taches. Le nombre d’objets peut être utilisé comme mesure indirecte de la viabilité cellulaire.

6. Exporter des données

1. Cliquez sur Analyse par lots. Attendez la fin de l’analyse avant de passer à l’étape suivante (étape 6.2).
   REMARQUE: L’analyse par lots permet au serveur du logiciel d’analyse d’images de charger le protocole d’analyse à l’aide des mesures sélectionnées pour analyser les données à distance.
2. Exportez le jeu de données vers un ordinateur local ou un lecteur réseau.
   1. Connectez le logiciel d’analyse d’images à une application d’assistance sur l’ordinateur en téléchargeant et en ouvrant un fichier de connexion.
   2. Sélectionnez le type de fichier de résultats (.txt, .csv, .html ou XML natif).
   3. Choisissez les paramètres du dossier de fichiers dans le menu déroulant.

7. Analyser les données dans une feuille de calcul

1. Ouvrez le fichier exporté. S’il s’agit d’un fichier .csv, enregistrez-le en tant que format de fichier .xls pour permettre l’utilisation de tableaux croisés dynamiques. Si le chemin d’accès au fichier est trop long, enregistrez le fichier .xls plus haut dans la hiérarchie des dossiers pour éviter les erreurs d’enregistrement.
2. Ajoutez des colonnes à la feuille de calcul qui désignent les conditions pour chaque puits. Par exemple, le type de cellule, les variantes QD-Spike, les concentrations QD-Spike, le temps d’incubation, etc.
3. Choisissez la fonction Tableau croisé dynamique et créez le tableau en utilisant les conditions ajoutées en tant que lignes et les paramètres mesurés en tant que colonnes. Sélectionnez le calcul pour chaque paramètre, c’est-à-dire Moyenne, Écart type, Médiane, Min, Max ou Count.
4. Normalisez les données pour contrôler les échantillons, y compris les QD non conjugués à 0 % et la concentration la plus élevée de QD-Spike à 100 %.
   REMARQUE: Si vous évaluez l’efficacité d’inhibiteurs tels que les anticorps neutralisants, normalisez les données sur les cellules traitées uniquement sur support (efficacité de 100%) et QD-Spike sans inhibiteur (efficacité de 0%).
5. Tracez les données dans un logiciel graphique.

Résultats

Après le traitement, les QD seront internalisés car la nanoparticule se liera à ACE2 sur la membrane plasmique et induira une endocytose. À l’aide d’une lignée cellulaire exprimant ACE2-GFP, la translocation des QD et de l’ACE2 peut être visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence. Une fois internalisés, les deux signaux QD et ACE2 montrent une forte colocalisation. À partir de ces images, la segmentation de l’image et l’analyse ultérieure peuvent être effectuées pour extraire des param...

Discussion

La méthode décrite dans cet article fournit les étapes nécessaires pour l’imagerie de QD fonctionnalisés dans des cellules humaines à l’aide de la microscopie confocale à haut débit. Cette méthode convient mieux aux cellules où l’endocytose est la principale voie d’entrée virale plutôt que l’activité de TMPRSS2 et de fusion membranaire, car elle permet d’étudier le PIC SARS-CoV-2 et l’endocytose hACE2. En raison de la nature du modèle QD et de l’étiquette His-terminal C sur le trimer Spike...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum Albumin	Gibco	15260-037	Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine	Greiner	655946	Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine Serum	Cytiva/HyClone	SH30071.03	Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus Analyzer	Perkin Elmer	NA	Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62252	Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red	Gibco	11995-065	Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418	InvivoGen	ant-gn-5	Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	Automated cell counter
Luna Automated Cell Counter	Logos Biosystems	NA	Used for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting Slides	Logos Biosystems	L12001	High-content imaging platform
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	Imaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058-021	Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/-	Gibco	10010-023	Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)	custom made by Naval Research Laboratory		Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	Sino Biological	40592-MM57	Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE Express	Gibco	12605-010