HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

要約

このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。

要約

細胞蛍光顕微鏡法の新技術の開発により、創薬のためのハイスループットスクリーニング方法が容易になりました。量子ドットは、明るく安定したフォトルミネッセンスと狭い発光帯を吹き込んだ優れた光物性を有する蛍光ナノ粒子である。量子ドットは球状の形状であり、表面化学を適切に修正して、細胞用途のために生体分子を共役するために使用することができる。これらの光学特性は、生体分子でそれらを機能化する能力と相まって、受容体 - リガンド相互作用および細胞輸送を調査するための優れたツールとなる。ここでは、量子ドットを使用してSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合およびエンドサイトーシスを追跡する方法を提示する。このプロトコルは、細胞生理学の文脈におけるタンパク質間相互作用およびトラッキングを研究するために量子ドットを利用しようとしている実験家のためのガイドとして使用することができる。

概要

蛍光顕微鏡により、研究者は特殊な色素¹、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質²、および量子ドット(QD)³の形の蛍光ナノ粒子を使用して、細胞の内部の仕組みを覗くことができます。2019年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV-2)の世界的なパンデミックのために、研究者は蛍光顕微鏡法を使用して、ウイルスが原形質膜と細胞質の両方で細胞とどのように相互作用するかを理解しました。例えば、研究者らは、ビリオン表面のSARS-CoV-2スパイクタンパク質とヒト細胞表面のヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)との結合、その後の原形質膜での融合によるインターナリゼーション、およびスパイク:hACE2タンパク質複合体のエンドサイトーシスに関する洞察を得ることができました^4,5。また、他の多くのウイルスと同様に、ゴルジ体から出芽する伝統的な小胞を介して発生すると考えられていたコロナウイルスのユニークな特徴である細胞蛍光イメージングを使用して、リソソームを介して細胞からSARS-CoV-2が出ることについても大きな洞察が得られました⁶。生物学的研究のほぼすべての側面の柱である細胞蛍光顕微鏡技術は、動物全体の超解像イメージングから薬物スクリーニングのための自動高含有量マルチパラメトリックイメージングまで、その幅広さと応用範囲において必然的に進歩してきました。ここでは、自動高含量共焦点顕微鏡法が、ウイルススパイクタンパク質にコンジュゲートした蛍光QDを用いたSARS-CoV-2細胞侵入の研究に適用される。

生物学的イメージングプラットフォームによって生成された画像のハイコンテンツ分析は、マルチモーダルプレートリーダーを使用して取得するウェル全体の強度などの単一のパラメータよりも、貴重な生物学的洞察のより大きな抽出を可能にします⁷。自動セグメンテーションアルゴリズムを使用して視野内のオブジェクトを分離することにより、各オブジェクトまたはオブジェクトの集団を、利用可能な各蛍光チャネルの強度、面積、テクスチャなどのパラメータについて分析できます⁸。多くの測定値を多変量データセットに結合することは、表現型プロファイリングに便利なアプローチです。プンクタの形態のQDインターナリゼーションなどの所望の表現型が知られている場合、サイズ、数、強度などのプンクタに関連する測定値を使用して、治療の有効性を評価することができる。

クラウドベースのハイコンテンツイメージング解析ソフトウェアは、ハイコンテンツイメージングプラットフォームを含む多種多様な機器データ出力に対応できます。画像ストレージとオンライン分析にクラウドベースのサーバーを使用することで、ユーザーはイメージング機器またはデータが保存されているネットワークドライブからデータをアップロードできます。プロトコルの分析部分はクラウドソフトウェア環境内で行われ、ダウンストリームのデータ視覚化のためにさまざまなファイル形式でデータをエクスポートできます。

SARS-CoV-2ウイルスは、その集合および複製を助ける非構造的および構造的タンパク質からなる。SARS-CoV-2スパイクはS1とS2と呼ばれる2つのドメインを有し、S1は原形質膜におけるhACE2相互作用に関与する受容体結合ドメインを含む⁹。スパイクはまた、hACE210,11に加えて共受容体として作用し得る原形質膜において他の分子と相互作用することが見出^{されている。}スパイクタンパク質配列全体、特にS1/S2界面には、膜貫通後の膜における融合を可能にするプロテアーゼ切断部位がセリンプロテアーゼ2(TMPRSS2)^{12に存在する}。個々の受容体結合ドメインから、S1、S2、S1、およびスパイク三量体全体を研究活動に使用するために、複数の商業ベンダーからS1、S2、およびスパイク三量体全体に対して、さまざまな組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質が産生されています¹³。

この研究において、QDsの表面を、ヒスチジンタグを含む組換えスパイク三量体(QD-Spike)で官能化した。海軍研究所光学ナノ材料部門によって製造されたQDは、セレン化カドミウムコアと硫化亜鉛シェル^14,15を含む。QD表面上の亜鉛は、組換えタンパク質内のヒスチジン残基を調整して、SARS-CoV-2ウイルス粒子に形態および機能的に類似した機能化されたQDを形成する。ナノ粒子の生成およびタンパク質コンジュゲーションは、QD結合型受容体結合ドメインを用いて先に記載した¹⁵。この方法は、ヒト細胞の生理学的文脈におけるSARS-CoV-2スパイク活性を研究する際に研究者を導くことができる細胞培養調製物、QD処理、画像取得、およびデータ解析プロトコルを記述する。

プロトコル

本研究で用いたHEK293T細胞株は、不死化細胞株である。ヒトまたは動物の被験者は、この研究において使用されなかった。

1. 細胞の培養と播種

1. 滅菌バイオセーフティキャビネット内で、個人用保護具(ラボグローブ、ラボコート、安全メガネを含む)を着用し、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、および250μg/mL G418を補充して細胞培養培地を準備します。
   1. 500 mL の培地に、443.75 mL の DMEM、50 mL の FBS、5 mL の P/S、および 1.25 mL の G418 を加えます。
   2. 0.2μmのフィルターフラスコを通してろ過し、細菌汚染を避けるために無菌性を維持してください。
2. 滅菌バイオセーフティキャビネットの内部に、黒色の透明底のポリD-リジンコーティングされた96ウェルプレートの内部60ウェルに、細胞培養培地1ウェルあたり100μLで20,000個の細胞を播種する。外側の36ウェルを1ウェルあたり100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たします。
   1. 細胞を計数するために、2 μLのアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム染色剤を18 μLの細胞懸濁液に加える。
   2. この溶液10 μLを細胞計数スライドの片側にロードします。
   3. 手順 1.2.1 を繰り返します。および 1.2.2.をクリックしてスライドの両側を読み込みます。
   4. スライドを自動セルカウンターに置きます。
   5. 蛍光カウントプロトコルを選択し、カウントを押し ます。スライドの両側を数え、2 つの生細胞密度の平均を計算します。
   6. 必要な細胞懸濁液の体積を計算するには、必要な細胞の総数を平均細胞密度で除算する。
3. 播種後のウェルを光学顕微鏡で検査し、適切な密度と分布が達成されていることを確認します。
4. プレートを5%_CO2で37°Cの加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。

2. QDスパイクによる細胞の処理

1. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)をイメージング培地で希釈して調製する。
   1. 10 mL のイメージング培地に、130 μL の 7.5% BSA を加えて混合します。
2. 12 ウェルリザーバーまたはアッセイプレートで、イメージング培地中の 0.1% BSA を使用して、440 nM QD-スパイク (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) ストックを 20 nM に希釈します。
   1. 1ウェルのQD-スパイクについて、2.27 μL の 440 nM QD-スパイクを 47.73 μL の 0.1% BSA イメージング培地に添加し、最終濃度を 20 nM にします。
   2. 6 点 1:3 の連続希釈 (3 連) を生成するには、14.26 μL の QD-Spike を 285.74 μL の 0.1% BSA イメージング培地に追加して、最高濃度の 20 nM にします。200 μL の 0.1% BSA 培地に 100 μL の 20 nM QD-スパイクを加え、6.67 nM QD-スパイクの第 2 希釈を行います。4 回繰り返して、6 つの濃度ポイントを生成します。
3. マルチチャンネルアスピレーターを使用して、使用済みのメディアをすべて各ウェルから取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、イメージングメディア(100 μL/ウェル)で1回洗浄します。
4. 100 μL のイメージング培地を吸引し、50 μL/ウェルの QD-スパイク溶液を再び添加します。
5. プレートを5%_CO2で37°Cの加湿インキュベーターで3時間インキュベートする。ステップ 4 に進みます。

3. 固定と核染色

1. 滅菌バイオセーフティキャビネット内で、個人用保護具(ラボグローブ、ラボコート、安全メガネを含む)を着用し、0.1%BSAイメージングメディアに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を準備します。
2. 各ウェルから50 μLのQD-スパイクを吸引し、100 μL/ウェルの4% PFAを加える。
   1. 井戸を乾かさないでください。ウェルの乾燥を避けるために、自動マルチチャンネルピペットを使用してください(推奨)。
3. 室温で15分間インキュベートする。
4. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄する。
5. 5mM原液をPBSで1:1000希釈に希釈して深赤色核色素を調製した。
6. PBSを吸引し、希釈した核色素を50 μL/ウェル戻します。
7. 室温で30分間インキュベートする。
8. PBSで3回洗ってください。
9. 後日撮像するためのプレートシーラーを用いてプレートまたはシールを撮像する。プレートを4°Cで保管する。 蛍光は数週間以上安定している必要があります。

4. 集録のセットアップとイメージング

1. イメージングプラットフォーム用のソフトウェアを起動します。ハイコンテンツイメージングプラットフォームをオンにすると、ステータスバーのライトが点灯します。マシンが接続されていない場合、ソフトウェアはオフライン分析モードに入ります。
2. イメージングプラットフォームにログインします。
3. 新しい集録プロトコルを作成します。
   1. 96 ウェルクリアボトムイメージングプレートとして プレートタイプ を選択します。
      メモ:機器のプレート選択はさまざまであり、高さ、幅、その他の距離などのプレート寸法を含む正しいプレート定義をロードして、ウェル間隔と焦点を定義することによってカスタマイズできます。
   2. 共焦点として 光学モード を選択し、倍率を40倍の水浸漬として選択します。
   3. [ビン分割] を 1 として選択します。
   4. ステップ4.3.5-4.3.8で説明されているようにチャンネルと蛍光励起/発光波長を選択します。設定が選択されたときにスナップショットを撮って画像を表示し、設定が適切であることを確認します。
      注:デジタル位相コントラスト(DPC)により、細胞染色や蛍光色素を使用せずに生細胞を視覚化できます。固定セルにはお勧めできません。
   5. 「ハイコントラスト」などの DPC の モード を選択して、明確に定義された細胞体を生成します。スナップショットを撮って、イメージウィンドウに表示されるように、この設定が適切であることを確認します。
   6. 細胞内のACE2トラフィッキングの可視化を可能にするACE2-GFP細胞株で使用する FITCチャネル を選択します。
   7. QDチャンネルのカスタムチャンネルを作成するには、チャンネルの三角形のドロップダウンメニューを選択し、405nm範囲の励起と608nm範囲の発光を選択します。
   8. 細胞を固定し、深赤色の核色素を使用した場合は、630nmを超える発光を有する遠赤色チャネルを選択して、細胞体をさらに描写し、細胞マスクとして作用させる。
   9. 細胞質QD信号が強いウェルを選択して、露光時間、レーザーパワー、Z高さ位置を設定します。4.3.10 から 4.3.13 までの手順に従います。
   10. デフォルトの高さで、セルが目的の焦点面にある画像が生成されるかどうかを確認します。エンドサイトーシス穿刺が標的細胞小器官である場合、Z位は原形質膜が標的細胞小器官である場合よりも低くなる。
   11. 背景信号の少なくとも 3 倍のグレーレベルを持つ明るい画像を生成する露光時間を選択します。これは通常、100 ~ 300 ミリ秒です。20 nM では、グレー レベルは 200 ミリ秒の露光時間と 80 ミリ秒のレーザー出力を使用して約 6000 a.u. になります。
   12. 各チャンネルのスナップショット機能で生成された画像を右クリックし、[ 強度を表示]を選択してグレーレベルを確認します。次に、目的のオブジェクトまたは背景を左クリックして、そのピクセルのグレーレベルを表示します。
   13. レーザー出力を調整して、目的のオブジェクトの強度を微調整します。
4. 集録プロトコルを保存します。
5. [ 実験の実行 ] に切り替えて、[ プレート名] を入力します。
6. 実験を実行します。

5. データ解析

1. イメージングソフトウェアにデータをインポートします。
   1. すべての画像を取得したら、測定値をイメージングソフトウェアにエクスポートします。これには、サーバーを確立し、アカウントを作成する必要があります。イメージングソフトウェアにエクスポートするデータの画面を作成します。
2. イメージング ソフトウェアで、[ 画像解析 ] を選択して解析プロトコルの構築を開始します。
3. 画像化実験の測定値を読み込むには、画面リストでファイルを右クリックし、[ 選択]をクリックします。画像化された井戸とそれに関連するフィールドのプレートマップは、ウィンドウの左下隅に表示されます。
4. 明るい細胞質QDスポットのあるウェルを選択して、画像セグメンテーションを開始します。
5. 入力イメージの構成要素で、「フラットフィールド補正」を選択します。
6. 次の構成要素をプロトコルに追加するには、[ Nuclei の検索] を選択します。
   1. ここでは、DPCまたは遠赤色チャネルをNucleiマーカーとして使用します。
   2. 最初にオブジェクトを正確にセグメント化する方法を選択し、ドロップダウンメニューを使用してスライダを調整してセグメンテーションを微調整します。
      注: 適切なセグメンテーションは、核、細胞、およびスポットの関心領域 (ROI) を正確に定義します。マーカーに対して正のピクセルのみが、個々のROI内でキャプチャする必要があります。バックグラウンド信号は除外する必要があります。バックグラウンドがROIに取り込まれる場合、本方法の感度を低下させることができ、または強度の閾値を増加させて、セグメンテーションアルゴリズムのストリンジェンシーを増加させることができる。これは、すべての検索ビルディングブロックに適用されます。
7. 次に、[ 細胞質の検索] ビルディング ブロック を追加して、細胞質を識別します。
   1. この場合、細胞質セグメンテーションにACE2-GFPチャネルを使用する。
   2. 各細胞の細胞質を最もよく識別する方法を選択します。
8. 次に、[ スポットの検索] ビルディング ブロック を追加して、QD スパイク プンクタを識別します。
   1. ROI 母集団として [核 ] を選択します。
   2. ROI 領域としてセルを選択します。これは、細胞全体のプンクタをキャプチャします。
   3. 各セルの QD 穿刺を最もよく識別する方法を選択します。
9. 画像内のすべてのオブジェクトがセグメント化され、このウェル内で正確に識別されたら、他のウェルを選択して、ビルディングブロックと設定を他のウェルやその他の条件に一般的に適用できるようにします。
10. セグメント化されたすべてのオブジェクト(核、細胞質/細胞、およびスポット)の 強度の計算プロパティ を追加します。
11. セグメント化されたすべてのオブジェクト(核、細胞質/細胞、およびスポット)の 形態計算プロパティ を追加します。
12. セグメント化されたすべてのオブジェクト(核、細胞質/細胞、スポット)の テクスチャプロパティの計算 を追加します。
13. 核や斑点を含む各母集団のパラメータを選択して、結果を定義します。オブジェクトの数は、細胞生存率の間接的な尺度として使用できます。

6. データのエクスポート

1. バッチ分析をクリックします。分析が完了するのを待ってから、次のステップに進みます (ステップ 6.2)。
   メモ: バッチ分析により、画像解析ソフトウェアサーバーは、選択した測定値を使用して解析プロトコルをロードし、データをリモートで分析できます。
2. データセットをローカル コンピューターまたはネットワーク ドライブにエクスポートします。
   1. 接続ファイルをダウンロードして開いて、画像解析ソフトウェアをコンピュータ上のヘルパーアプリケーションに接続します。
   2. 結果ファイルの種類 (.txt、.csv、.html、またはネイティブ XML) を選択します。
   3. ドロップダウンメニューで ファイルフォルダ 設定を選択します。

7. スプレッドシート内のデータを分析する

1. エクスポートしたファイルを開きます。.csvファイルの場合は、.xlsファイル形式で保存して、ピボットテーブルを使用できるようにします。ファイル パスが長すぎる場合は、保存時のエラーを回避するために、フォルダー階層の上位にある.xls ファイルを保存します。
2. 各ウェルの条件を指定する列をスプレッドシートに追加します。例えば、細胞型としては、QD−スパイク変異体、QD−スパイク濃度、インキュベーション時間等が挙げられる。
3. ピボットテーブル関数を選択し、追加された条件を行として、測定パラメータを列として使用してテーブルを作成します。各パラメータの計算(平均、標準偏差、中央値、最小値、最大値、またはカウント)を選択します。
4. 非共役QDを0%、最高濃度のQD-スパイクを含む対照サンプルにデータを正規化します。
   注:中和抗体などの阻害剤の有効性を評価する場合は、データを培地のみの処理細胞(100%有効性)および阻害剤なしのQD-スパイク(0%有効性)に正規化します。
5. グラフ作成ソフトウェアでデータをプロットします。

結果

治療すると、ナノ粒子が原形質膜上のACE2に結合し、エンドサイトーシスを誘導するため、QDは内在化される。ACE2-GFP発現細胞株を用いて、QDおよびACE2の両方の転座を蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。一旦内部化されると、2つのQDおよびACE2シグナルは強い共局在化を示す。これらの画像から、画像セグメンテーションおよびその後の分析を実行して、スポットカウントなどの関連?...

ディスカッション

この記事で説明する方法は、ハイスループット共焦点顕微鏡を使用してヒト細胞中の機能化QDをイメージングするために必要な手順を提供します。この方法は、SARS-CoV-2スパイクおよびhACE2エンドサイトーシスの研究を可能にするため、TMPRSS2の活性および膜融合ではなく、エンドサイトーシスがウイルス侵入の主な経路である細胞に最も適している。QDモデルの性質と市販のスパイク三量体上?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum Albumin	Gibco	15260-037	Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine	Greiner	655946	Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine Serum	Cytiva/HyClone	SH30071.03	Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus Analyzer	Perkin Elmer	NA	Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62252	Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red	Gibco	11995-065	Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418	InvivoGen	ant-gn-5	Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	Automated cell counter
Luna Automated Cell Counter	Logos Biosystems	NA	Used for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting Slides	Logos Biosystems	L12001	High-content imaging platform
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	Imaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058-021	Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/-	Gibco	10010-023	Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)	custom made by Naval Research Laboratory		Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	Sino Biological	40592-MM57	Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE Express	Gibco	12605-010