Imaging confocale ad alto rendimento di trimeri spike SARS-CoV-2 coniugati quantum dot per tracciare il legame e l'endocitosi nelle cellule HEK293T

Riepilogo

In questo protocollo, i punti quantici coniugati al picco RICOMBINANTE SARS-CoV-2 consentono saggi basati su cellule per monitorare il legame dello spike a hACE2 sulla membrana plasmatica e la successiva endocitosi delle proteine legate nel citoplasma.

Abstract

Lo sviluppo di nuove tecnologie per la microscopia a fluorescenza cellulare ha facilitato i metodi di screening ad alto rendimento per la scoperta di farmaci. I punti quantici sono nanoparticelle fluorescenti con eccellenti proprietà fotofisiche intrise di fotoluminescenza luminosa e stabile e bande di emissione strette. I punti quantici sono di forma sferica e, con la corretta modifica della chimica superficiale, possono essere utilizzati per coniugare biomolecole per applicazioni cellulari. Queste proprietà ottiche, unite alla capacità di funzionalizzarle con biomolecole, le rendono un ottimo strumento per studiare le interazioni recettore-ligando e il traffico cellulare. Qui, presentiamo un metodo che utilizza punti quantici per tracciare il legame e l'endocitosi della proteina spike SARS-CoV-2. Questo protocollo può essere utilizzato come guida per gli sperimentatori che cercano di utilizzare i punti quantici per studiare le interazioni proteina-proteina e il traffico nel contesto della fisiologia cellulare.

Introduzione

La microscopia a fluorescenza consente ai ricercatori di scrutare il funzionamento interno della cellula utilizzando coloranti ^{specializzati1}, proteine fluorescenti geneticamente ^codificate2 e nanoparticelle fluorescenti sotto forma di punti quantici (QD)³. Per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus della pandemia globale del 2019 (SARS-CoV-2), i ricercatori hanno impiegato la microscopia a fluorescenza per capire come il virus interagisce con la cellula sia sulla membrana plasmatica che nel citoplasma. Ad esempio, i ricercatori sono stati in grado di ottenere informazioni sul legame della proteina Spike SARS-CoV-2 sulla superficie del virione all'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) sulla superficie delle cellule umane, sulla successiva internalizzazione tramite fusione alla membrana plasmatica e sull'endocitosi del complesso proteico Spike:^hACE24,5. Sono state acquisite anche grandi intuizioni sull'uscita di SARS-CoV-2 dalle cellule attraverso il lisosoma utilizzando l'imaging a fluorescenza cellulare, una caratteristica unica dei coronavirus precedentemente ritenuta verificarsi tramite vescicole tradizionali in erba dal Golgi, come è con molti altri ^virus6. Un pilastro di quasi tutti gli aspetti della ricerca biologica, la tecnica di microscopia a fluorescenza cellulare è necessariamente avanzata nella sua ampiezza e portata di applicazioni dall'imaging a super-risoluzione di animali interi all'imaging multiparametrico automatizzato ad alto contenuto per lo screening dei farmaci. Qui, la microscopia confocale automatizzata ad alto contenuto viene applicata allo studio dell'ingresso delle cellule SARS-CoV-2 utilizzando QD fluorescenti coniugati alla proteina spike virale.

L'analisi ad alto contenuto delle immagini generate da piattaforme di imaging biologico consente una maggiore estrazione di preziose informazioni biologiche rispetto a singoli parametri come l'intensità del pozzo intero, che si otterrebbe utilizzando un lettore di lastre multimodale7. Separando gli oggetti in un campo visivo utilizzando algoritmi di segmentazione automatizzati, ogni oggetto o una popolazione di oggetti può essere analizzato per parametri quali intensità, area e trama in ciascun canale di fluorescenza ^disponibile8. La combinazione di molte misurazioni in set di dati multivariati è un approccio utile per la profilazione fenotipica. Quando il fenotipo desiderato è noto, come l'internalizzazione QD sotto forma di puncta, è possibile utilizzare le misurazioni relative al puncta come dimensioni, numero e intensità per valutare l'efficacia di un trattamento.

Il software di analisi di imaging ad alto contenuto basato su cloud può ospitare un'ampia varietà di output di dati strumentali, inclusa la piattaforma di imaging ad alto contenuto. Utilizzando un server basato su cloud per l'archiviazione delle immagini e l'analisi online, l'utente è in grado di caricare i propri dati dallo strumento di imaging o dall'unità di rete in cui sono archiviati i dati. La parte di analisi del protocollo viene condotta all'interno dell'ambiente software cloud e i dati possono essere esportati in una varietà di formati di file per la visualizzazione dei dati a valle.

Il virus SARS-CoV-2 è composto da proteine non strutturali e strutturali che aiutano nel suo assemblaggio e replicazione. Lo spike SARS-CoV-2 ha due domini chiamati S1 e S2, con S1 contenente il dominio di legame del recettore responsabile delle interazioni hACE2 sulla membrana ^plasmatica9. Spike è stato anche trovato per interagire con altre molecole sulla membrana plasmatica che possono agire come co-recettori in aggiunta a ^hACE210,11. In tutta la sequenza della proteina spike e in particolare all'interfaccia S1/S2, ci sono siti di scissione della proteasi che consentono la fusione sulla membrana dopo la serina proteasi 2 transmembrana (TMPRSS2)¹². Varie proteine Spike RICOMBINANTI SARS-CoV-2 sono state prodotte da singoli domini di legame del recettore, a S1, S2, S1 con S2 e trimeri spike interi da più fornitori commerciali per l'uso in attività di ^ricerca13.

In questo lavoro, la superficie dei QD è stata funzionalizzata con trimeri spike ricombinanti che contengono un tag di istidina (QD-Spike). I QD prodotti dalla Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section contengono un nucleo di seleniuro di cadmio e un guscio di solfuro di ^zinco14,15. Lo zinco sulla superficie QD coordina i residui di istidina all'interno della proteina ricombinante per formare un QD funzionalizzato che assomiglia a una particella virale SARS-CoV-2 nella forma e nella funzione. La generazione delle nanoparticelle e della coniugazione proteica è stata precedentemente descritta utilizzando il dominio di legame del recettore coniugato ^QD15. Questo metodo descrive i preparati di coltura cellulare, il trattamento QD, l'acquisizione di immagini e il protocollo di analisi dei dati che possono guidare un ricercatore nello studio dell'attività di SARS-CoV-2 Spike nel contesto fisiologico di una cellula umana.

Protocollo

La linea cellulare HEK293T utilizzata in questo studio è una linea cellulare immortalata. In questo studio non sono stati utilizzati soggetti umani o animali.

1. Coltivazione e semina cellulare

1. All'interno di un armadio sterile per la biosicurezza, indossando dispositivi di protezione individuale (inclusi guanti da laboratorio, cappotto da laboratorio e occhiali di sicurezza), preparare il terreno di coltura cellulare integrando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina / streptomicina (P / S) e 250 μg / mL G418.
   1. Per 500 mL di supporti, aggiungere 443,75 mL di DMEM, 50 mL di FBS, 5 mL di P/S e 1,25 mL di G418.
   2. Filtrare attraverso un pallone filtrante da 0,2 μm e mantenere la sterilità per evitare la contaminazione batterica.
2. All'interno di un armadio sterile per la biosicurezza, seminare i 60 pozzetti interni di una piastra a 96 pozzetti rivestita di poli-D-lisina nera, con fondo chiaro, rivestita in poli-D-lisina con 20.000 cellule in 100 μL per pozzetto di terreno di coltura cellulare. Riempire i 36 pozzetti esterni con 100 μL per pozzetto di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   1. Per contare le cellule, aggiungere 2 μL di acridina arancione e macchia di ioduro di propidio a 18 μL di sospensione cellulare.
   2. Caricare 10 μL di questa soluzione in un lato di una slitta di conteggio delle celle.
   3. Ripetere i passaggi 1.2.1. e 1.2.2. per caricare entrambi i lati della diapositiva.
   4. Posizionare la diapositiva in un contatore di celle automatizzato.
   5. Selezionare il protocollo di conteggio della fluorescenza e premere Conta. Contare entrambi i lati della diapositiva e calcolare la media delle due densità di cellule vive.
   6. Per calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto, dividere il numero totale di celle necessarie per la densità media delle celle.
3. Ispezionare i pozzetti dopo la semina al microscopio ottico per assicurarsi che siano state raggiunte una densità e una distribuzione adeguate.
4. Incubare la piastra durante la notte in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di _CO2.

2. Trattamento delle cellule con QD-Spike

1. Preparare l'albumina sierica bovina allo 0,1% (BSA) diluendo in mezzi di imaging.
   1. Per 10 mL di supporti di imaging, aggiungere 130 μL di BSA al 7,5% e mescolare.
2. In un serbatoio o in una piastra di saggio a 12 pozzi, diluire lo stock QD-Spike da 440 nM (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) a 20 nM utilizzando lo 0,1% di BSA nei mezzi di imaging.
   1. Per 1 pozzetto di QD-Spike, aggiungere 2,27 μL di 440 nM QD-Spike a 47,73 μL di mezzo di imaging BSA allo 0,1% per una concentrazione finale di 20 nM.
   2. Per generare una diluizione seriale 1:3 a sei punti (in triplice copia), aggiungere 14,26 μL di QD-Spike a 285,74 μL di mezzo di imaging BSA allo 0,1% per ottenere la massima concentrazione di 20 nM. Aggiungere 100 μL di 20 nM QD-Spike a 200 μL di 0,1% di BSA per effettuare la seconda diluizione di 6,67 nM QD-Spike. Ripeti quattro volte per generare i sei punti di concentrazione.
3. Utilizzando un aspiratore multicanale, rimuovere tutti i supporti esauriti da ciascun pozzetto. Utilizzando una pipetta multicanale, lavare una volta con un supporto di imaging (100 μL / pozzetto).
4. Aspirare 100 μL di supporti di imaging e aggiungere di nuovo 50 μL/pozzetto della soluzione QD-Spike.
5. Incubare la piastra per 3 ore in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di _CO2. Continuare con il passaggio 4.

3. Fissazione e colorazione dei nuclei

1. All'interno di un armadio sterile per la biosicurezza, indossando dispositivi di protezione individuale (inclusi guanti da laboratorio, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza), preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in uno 0,1% di supporti di imaging BSA.
2. Aspirare 50 μL di QD-Spike da ciascun pozzetto e aggiungere 100 μL/pozzetto del 4% di PFA.
   1. Non lasciare asciugare i pozzetti. Utilizzare una pipetta multicanale automatizzata per evitare l'essiccazione dei pozzetti (consigliato).
3. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare tre volte con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
5. Preparare il colorante nucleare rosso intenso diluendo la soluzione madre da 5 mM a 1:1000 diluizione in PBS.
6. Aspirare il PBS e aggiungere di nuovo 50 μL/pozzetto di colorante nucleare diluito.
7. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
8. Lavare tre volte con PBS.
9. Immagine della piastra o del sigillo utilizzando un sigillante per lastre per l'imaging in un secondo momento. Conservare il piatto a 4 °C. La fluorescenza dovrebbe essere stabile per diverse settimane o più.

4. Configurazione dell'acquisizione e imaging

1. Avviare il software per la piattaforma di imaging. Accendi la piattaforma di imaging ad alto contenuto e la spia sulla barra di stato dovrebbe essere accesa. Se la macchina non è collegata, il software entrerà in modalità di analisi offline.
2. Accedi alla piattaforma di imaging.
3. Creare un nuovo protocollo di acquisizione.
   1. Selezionare Tipo di piastra come piastra di imaging inferiore trasparente a 96 pozzetti.
      NOTA: la selezione della piastra nello strumento può variare e può essere personalizzata caricando le definizioni corrette della piastra che includono dimensioni della piastra come altezza, larghezza e altre distanze per definire la spaziatura del pozzo e i punti focali.
   2. Selezionare la modalità ottica come confocale e l'ingrandimento come immersione in acqua 40x.
   3. Selezionare Binning come 1.
   4. Scegliere i canali e le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione fluorescenti come descritto nei passaggi 4.3.5-4.3.8. Scatta un'istantanea quando le impostazioni sono selezionate per visualizzare l'immagine e assicurarti che le impostazioni siano appropriate.
      NOTA: Digital Phase Contrast (DPC) consentirà la visualizzazione di cellule vive senza una macchia cellulare o un colorante fluorescente. Non è raccomandato per le celle fisse.
   5. Selezionare la modalità per DPC, ad esempio Contrasto elevato, per produrre corpi cellulari ben definiti. Scatta un'istantanea per confermare che questa impostazione è appropriata, come mostrato nella finestra dell'immagine.
   6. Selezionare il canale FITC da utilizzare con la linea cellulare ACE2-GFP che consente la visualizzazione del traffico ACE2 all'interno della cella.
   7. Per creare un canale personalizzato per il canale QD, selezionare il menu a discesa a triangolo per il canale e scegliere l'eccitazione nell'intervallo 405 nm e l'emissione nell'intervallo 608 nm.
   8. Se le cellule sono state fissate e si è utilizzato un colorante nucleare rosso intenso, selezionare il canale rosso lontano con emissione superiore a 630 nm per delineare ulteriormente il corpo cellulare e agire come una maschera cellulare.
   9. Selezionare un pozzo con un forte segnale QD citoplasmatico per impostare il tempo di esposizione, la potenza del laser e la posizione dell'altezza Z. Seguire i passaggi da 4.3.10-4.3.13.
   10. Verificate se l'altezza predefinita produce un'immagine in cui le celle si trovano nel piano focale desiderato. Se i puncta endocitosi sono l'organello bersaglio, la posizione Z sarà inferiore rispetto a se la membrana plasmatica è l'organello bersaglio.
   11. Scegli un tempo di esposizione che produca un'immagine luminosa con livelli di grigio almeno tre volte superiori al segnale di sfondo. Questo è in genere tra 100 e 300 ms. A 20 nM, i livelli di grigio dovrebbero essere di circa 6000 u.a. utilizzando un tempo di esposizione di 200 ms e una potenza laser dell'80%.
   12. Controlla i livelli di grigio facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine prodotta con la funzione Istantanea in ciascun canale e selezionando Mostra intensità. Quindi, fai clic con il pulsante sinistro del mouse sull'oggetto di interesse o sullo sfondo per visualizzare il livello di grigio per quel pixel.
   13. Regola la potenza del laser per mettere a punto l'intensità degli oggetti di interesse.
4. Salvare il protocollo di acquisizione.
5. Passare a Esegui esperimento e immettere il nome della piastra.
6. Eseguire l'esperimento.

5. Analisi dei dati

1. Importare i dati nel software di imaging.
   1. Dopo aver acquisito tutte le immagini, esportare le misurazioni nel software di imaging. Ciò richiede la creazione di un server e la creazione di un account. Creare una schermata per i dati da esportare nel software di imaging.
2. Nel software di imaging, selezionare Analisi immagini per iniziare a creare il protocollo di analisi.
3. Caricare le misurazioni dall'esperimento di imaging facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file nell'elenco delle schermate e facendo clic su Seleziona. La mappa delle lastre dei pozzi ripresi e dei campi associati dovrebbe essere visibile nell'angolo in basso a sinistra della finestra.
4. Scegli un pozzo con punti QD citoplasmatici luminosi per iniziare la segmentazione dell'immagine.
5. Nel blocco predefinito dell'immagine di input, selezionare Correzione campo piatto.
6. Aggiungere il blocco predefinito successivo al protocollo selezionando Trova nuclei.
   1. Qui, usa il DPC o il canale rosso lontano come marcatore nuclei.
   2. Selezionare prima il metodo che segmenta accuratamente gli oggetti, quindi ottimizzare la segmentazione utilizzando il menu a discesa e regolando i cursori.
      NOTA: una buona segmentazione definisce con precisione la regione di interesse (ROI) per il nucleo, la cellula e le macchie. Solo i pixel positivi per il marcatore devono essere acquisiti all'interno di un singolo ROI. Il segnale di sfondo dovrebbe essere escluso. Se lo sfondo viene catturato nel ROI, la sensibilità del metodo può essere diminuita o la soglia di intensità può essere aumentata per aumentare il rigore dell'algoritmo di segmentazione. Questo è applicabile a tutti i blocchi predefiniti Trova.
7. Quindi, aggiungi il blocco di costruzione Trova citoplasma per identificare il citoplasma.
   1. In questo caso, utilizzare il canale ACE2-GFP per la segmentazione citoplasmatica.
   2. Seleziona il metodo che meglio identifica il citoplasma di ogni cellula.
8. Quindi, aggiungi il blocco di costruzione Trova punti per identificare la puntata QD-Spike.
   1. Selezionare Nuclei come popolazione ROI.
   2. Selezionare la cella come area ROI. Questo cattura il puncta all'interno dell'intera cellula.
   3. Selezionare il metodo che meglio identifica il QD puncta in ogni cella.
9. Una volta che tutti gli oggetti nell'immagine sono stati segmentati e identificati con precisione in questo pozzo, scegliere altri pozzi per garantire che i blocchi e le impostazioni di costruzione possano essere generalmente applicati agli altri pozzi e ad altre condizioni.
10. Aggiungere il Calcola proprietà di intensità per tutti gli oggetti segmentati (nuclei, citoplasma/cellule e macchie).
11. Aggiungi il Calcola proprietà morfologiche per tutti gli oggetti segmentati (nuclei, citoplasma/cellule e macchie).
12. Aggiungere il Calcola proprietà texture per tutti gli oggetti segmentati (nuclei, citoplasma/cellule e macchie).
13. Definisci i risultati selezionando i parametri per ogni popolazione, inclusi nuclei e punti. Il numero di oggetti può essere utilizzato come misura indiretta della vitalità cellulare.

6. Esporta i dati

1. Fare clic su Analisi batch. Attendere il completamento dell'analisi prima di procedere al passaggio successivo (passaggio 6.2).
   NOTA: l'analisi batch consente al server software di analisi delle immagini di caricare il protocollo di analisi utilizzando le misurazioni selezionate per analizzare i dati in remoto.
2. Esportare il set di dati in un computer locale o in un'unità di rete.
   1. Collegare il software di analisi delle immagini a un'applicazione di supporto sul computer scaricando e aprendo un file di connessione.
   2. Selezionare il tipo di file dei risultati (.txt, .csv, .html o XML nativo).
   3. Scegli le impostazioni della cartella file con il menu a discesa.

7. Analizza i dati in un foglio di calcolo

1. Aprire il file esportato. Se si tratta di un file .csv, salvarlo come formato di file .xls per consentire l'utilizzo di tabelle pivot. Se il percorso del file è troppo lungo, salvare il file .xls più in alto nella gerarchia di cartelle per evitare errori di salvataggio.
2. Aggiungere colonne al foglio di calcolo che designano le condizioni per ogni pozzo. Ad esempio, il tipo di cellula, le varianti QD-Spike, le concentrazioni QD-Spike, il tempo di incubazione, ecc.
3. Scegliere la funzione Tabella pivot e creare la tabella utilizzando le condizioni aggiunte come Righe e i parametri misurati come Colonne. Selezionare il calcolo per ciascun parametro, ad esempio Media, Deviazione standard, Mediana, Min, Max o Conteggio.
4. Normalizzare i dati per controllare i campioni, inclusi i QD non coniugati come 0% e la più alta concentrazione di QD-Spike come 100%.
   NOTA: Se si valuta l'efficacia di inibitori come gli anticorpi neutralizzanti, normalizzare i dati alle cellule trattate solo con media (efficacia al 100%) e QD-Spike senza inibitore (efficacia allo 0%).
5. Traccia i dati in un software di creazione grafica.

Risultati

Dopo il trattamento, i QD saranno internalizzati poiché la nanoparticella si legherà ad ACE2 sulla membrana plasmatica e indurrà l'endocitosi. Utilizzando una linea cellulare che esprime ACE2-GFP, la traslocazione di QD e ACE2 può essere visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una volta internalizzati, i due segnali QD e ACE2 mostrano una forte colocalizzazione. Da queste immagini è possibile eseguire la segmentazione delle immagini e la successiva analisi per estrarre parametri rilevanti come il con...

Discussione

Il metodo descritto in questo articolo fornisce i passaggi necessari per l'imaging di QD funzionalizzati in cellule umane utilizzando la microscopia confocale ad alto rendimento. Questo metodo è più adatto per le cellule in cui l'endocitosi è la principale via di ingresso virale piuttosto che l'attività di TMPRSS2 e fusione di membrana, in quanto consente lo studio dell'endocitosi SARS-CoV-2 Spike e hACE2. A causa della natura del modello QD e del C-terminal His-tag sul trimero Spike disponibile in commercio, qualsia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum Albumin	Gibco	15260-037	Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine	Greiner	655946	Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine Serum	Cytiva/HyClone	SH30071.03	Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus Analyzer	Perkin Elmer	NA	Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62252	Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red	Gibco	11995-065	Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418	InvivoGen	ant-gn-5	Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	Automated cell counter
Luna Automated Cell Counter	Logos Biosystems	NA	Used for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting Slides	Logos Biosystems	L12001	High-content imaging platform
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	Imaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058-021	Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/-	Gibco	10010-023	Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)	custom made by Naval Research Laboratory		Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	Sino Biological	40592-MM57	Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE Express	Gibco	12605-010