סימולציה מבוססת מבנה ודגימה של תנועות חלבון פקטור שעתוק לאורך דנ"א מצעד בקנה מידה אטומי לדיפוזיה גסה-גרגרית

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לחשוף דינמיקה מבנית של דיפוזיה חד-ממדית של חלבון לאורך דנ"א, תוך שימוש בחלבון מקדם שעתוק צמחי WRKY כמערכת מופתית. לשם כך יושמו הן סימולציות של דינמיקה מולקולרית אטומיסטית והן של דינמיקה מולקולרית גסה, יחד עם דגימות חישוביות נרחבות.

Abstract

החלקה חד-ממדית (1-D) של חלבון גורם שעתוק (TF) לאורך הדנ"א חיונית להפצה מקלה של ה-TF כדי לאתר את אתר הדנ"א של המטרה לצורך ויסות גנטי. זיהוי רזולוציה של זוג בסיסים (bp) של ה-TF מחליק או דורך על הדנ"א הוא עדיין מאתגר מבחינה ניסיונית. לאחרונה ביצענו סימולציות של דינמיקה מולקולרית של כל האטום (MD) הלוכדות דריכה ספונטנית של 1-bp של חלבון TF קטן בתחום WRKY לאורך הדנ"א. בהתבסס על נתיב הדריכה WRKY של 10 מיקרו-μs שהתקבל מהדמיות כאלה, הפרוטוקול כאן מראה כיצד לבצע דגימות קונפורמיות נרחבות יותר של מערכות TF-DNA, על ידי בניית מודל מצב מרקוב (MSM) עבור דריכה של חלבון 1-bp, עם מספרים שונים של מצבי מיקרו ומאקרו שנבדקו לבניית MSM. על מנת לבחון חיפוש דיפוזיה תהליכי 1-D של חלבון ה-TF יחד עם דנ"א עם בסיס מבני, הפרוטוקול מראה עוד כיצד לבצע סימולציות MD גסות-גרגרים (CG) כדי לדגום דינמיקה ארוכת טווח של המערכת. מודלים וסימולציות כאלה של CG שימושיים במיוחד כדי לחשוף את ההשפעות האלקטרוסטטיות של חלבון-דנ"א על תנועות הדיפוזיה התהליכיות של חלבון ה-TF מעל עשרות מיקרו-שניות, בהשוואה לתת-מיקרו-שניות לתנועות דריכה של חלבוני מיקרו-שניות שנחשפו מהדמיות הכל-אטומיות.

Introduction

גורמי שעתוק (TF) מחפשים את דנ"א המטרה כדי לקשור ולווסת שעתוק גנים ופעילויות קשורות¹. מלבד הדיפוזיה התלת-ממדית (התלת-ממדית), הוצע כי הדיפוזיה הקלה של TF חיונית לחיפוש דנ"א של מטרה, שבו החלבונים יכולים גם להחליק או לקפוץ לאורך דנ"א חד-ממדי (1D), או לקפוץ עם העברה בין-סגמנטלית על הדנ"א 2,3,4,4,5,6,7.

במחקר שנערך לאחרונה, ערכנו עשרות סימולציות של מיקרו-שניות (μs) של דינמיקה מולקולרית של שיווי משקל אטומי (MD) על TF צמחי - חלבון תחום WRKY על ה-DNA⁸. דריכה שלמה של 1 bp של WRKY על דנ"א פולי-A בתוך מיקרו-שניות נלכדה. נצפו התנועות של החלבון לאורך חריץ הדנ"א וקשרי המימן (HBs) דינמיקת שבירת-רפורמה. בעוד שמסלול כזה מייצג נתיב אחד שנדגם, עדיין חסר נוף כולל של דריכה חלבונית. כאן אנו מראים כיצד להרחיב דגימות חישוביות סביב נתיב דריכת החלבון שנלכד בתחילה עם מודל מצב מרקוב (MSM) שנבנה, אשר יושמו באופן נרחב להדמיית מגוון מערכות ביומולקולריות הכוללות שינויים קונפורמיים משמעותיים והפרדת קנה מידה של זמן 9,10,11,12,13,13,14,15,16, 17,18,19. המטרה היא לחשוף את ההרכב הקונפורמי והמצבים המטא-יציבים של דיפוזיית חלבון ה-TF לאורך הדנ"א לצעד מחזורי אחד.

בעוד שסימולציית MD לעיל חושפת רזולוציה אטומית של תנועות החלבון עבור 1 bp על הדנ"א, הדינמיקה המבנית של דיפוזיה תהליכית ארוכת שנים של TF לאורך DNA באותה רזולוציה גבוהה כמעט ואינה נגישה. עם זאת, ביצוע סימולציות MD גסות-גרגרים (CG) ברמת השאריות הוא נגיש מבחינה טכנית. ניתן להרחיב למעשה את סולם הזמן של סימולציית CG לעשרות או מאות פעמים יותר מהסימולציות האטומיות 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. כאן, אנו מראים את סימולציות ה- CG שנערכו על ידי הטמעת תוכנת CafeMol שפותחה על ידי מעבדת טקדה³⁰.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מציגים תחילה את ההדמיות האטומיות של החלבון בתחום WRKY לאורך דנ"א פולי-A ואת בניית ה-MSM, המתמקדות בדגימת תנועות הדריכה של החלבון במשך 1 bp בלבד לאורך הדנ"א. לאחר מכן אנו מציגים את המידול וההדמיות של CG של אותה מערכת חלבון-דנ"א, אשר מרחיבים את הדגימה החישובית לדיפוזיה התהליכית של חלבונים על פני עשרות bps לאורך הדנ"א.

כאן, אנו משתמשים בתוכנת GROMACS ^31,32,33 כדי לבצע סימולציות MD וב-MSMbuilder³⁴ כדי לבנות את ה-MSM עבור תמונות קונפורמיות שנדגמו, כמו גם כדי להשתמש ב-VMD³⁵ כדי להמחיש את הביו-מולקולות. הפרוטוקול דורש שהמשתמש יוכל להתקין וליישם את התוכנה לעיל. ההתקנה והיישום של תוכנת CafeMol³⁰ נחוצה לאחר מכן לביצוע סימולציות CG MD. ניתוחים נוספים של המסלולים וההדמיה מתבצעים גם ב- VMD.

Protocol

1. בניית מודל מצב מרקוב (MSM) מהדמיות MD אטומיות

1. מסלול דריכה ספונטני של חלבונים ואיסוף מבנים ראשוניים
   1. השתמש במסלול MD של 10-μs שהושג בעבר ב-10-μs all-atom^{MD 8} כדי לחלץ 10000 פריימים באופן שווה מנתיב דריכה "קדימה" של 1 bp (כלומר, מסגרת אחת עבור כל ננו-שניה). המספר הכולל של המסגרות צריך להיות גדול מספיק כדי לכלול את כל הקונפורמציות הייצוגיות.
   2. הכן את נתיב המעבר עם 10000 מסגרות ב- VMD על-ידי לחיצה על קובץ > שמור קואורדינטות, הקלד חלבון או גרעין בתיבה אטומים נבחרים ובחר מסגרות בתיבה מסגרות, לחץ על שמור כדי לקבל את המסגרות הדרושות.
      הערה: מסלול סימולציה של 10 μs all-atom MD שהושג בעבר (נקרא כאן "מסלול דריכה קדימה" עבור WRKY דריכה למרחק של 1-bp על דנ"א הומוגני של פולי-A⁸ של 34 bp שימש כנתיב הראשוני לשיגור דגימות קונפורמיות נוספות. עם זאת, שים לב שברוב הפרקטיקות נבנה נתיב ראשוני, על ידי ביצוע סימולציות MD מנווטות או ממוקדות, או יישום שיטות כלליות ליצירת נתיב וכו'.36,37,38,38,39.
   3. יישור הציר הארוך של דנ"א הייחוס (מהמבנה הגבישי) לציר ה-x, והגדר את מרכז המסה הראשוני (COM) של הדנ"א המלא של 34 bp במקור מרחב הקואורדינטות לנוחות של ניתוח נתונים נוסף. לשם כך, לחץ על הרחבות > Tk Console ב- VMD והקלד בחלון הפקודה של מסוף Tk:
      מקור סיבוב.tcl
      את סקריפט tcl ניתן למצוא בקובץ משלים 3.
   4. לאחר מכן חישבו את השורש-הממוצע-ריבוע-מרחק (RMSD) של עמוד השדרה של החלבון על-ידי יישור הדנ"א המרכזי של 10 bp (A 14 עד 23 ו-T 14' עד 23') לזה מהמבנה הגבישי⁴⁰, וה-RMSD מייצג מדדים גיאומטריים של המערכות (ראו איור 1A). עשה זאת על ידי לחיצה על VMD > הרחבות > ניתוח > כלי מסלול RMSD וסוג גרעין ושאריות 14 עד 23 ו- 46 עד 55 בתיבת בחירת האטום, לחץ על ישר ולאחר מכן על תיבת RMSD כדי לחשב את ערכי RMSD.
   5. חישוב דרגת הסיבוב של החלבון סביב DNA Θ(t) במישור y-z ב-MATLAB על-ידי הקלדת הפקודה
      rad2deg(atan(z/y))
      כאשר המיקום הזוויתי הראשוני מוגדר כ- Θ(0)=0, כפי שנערך בעבר⁸.
   6. הקלד את הפקודה הבאה ב- MATLAB⁴¹ כדי להשתמש בשיטות K-means 42,43,44 וסווג את 10000 המבנים ל- 25 אשכולות על-ידי הקלדה:
      [idx, C]=kmeans( X, 25)
      כאן X היא מטריצה דו-ממדית של RMSD וזווית סיבובית של WRKY על הדנ"א. אסוף את המבנים של 25 מרכזי אשכולות אלה לסימולציות MD נוספות.
      הערה: מאחר שהחלבון RMSD שנדגם ביחס לדנ"א מכסה טווח של כ-25 Å, אנו בוחרים ב-25 אשכולות שבהם יש צביר אחד לכל אנגסטרום.
2. ביצוע סבב 1^st של סימולציות MD והגדרות הסימולציה
   1. בנה מערכות אטומיסטיות עבור 25 המבנים על ידי שימוש בתוכנת GROMACS 5.1.2³² תחת שדה כוח parmbsc1⁴⁵ ובאמצעות קובץ buildsystem.sh מקובץ משלים 2 במעטפת.
   2. בצע סימולציות MD של 60-ns עבור 25 מערכות אלה תחת אנסמבל NPT עם שלב זמן של 2 fs על ידי הקלדת הפקודה הבאה במעטפת:
      gmx_mpi grompp -f md.mdp -c npt.gro -p topol.top -o md.tpr
      gmx_mpi mdrun -deffnm md
3. אשכולות 1^סנט מסלולי MD עגולים
   1. הסר את 10 ה- ns הראשונים של כל מסלול סימולציה על-ידי הקלדת פגז:
      gmx_mpi trjcat -f md.xtc -b 10000 -e 600000 -o newtraj.xtc
      ולאסוף קונפורמציות ממסלולים של 25 × 50 ns עבור אשכולות כדי להכין את מבני הקלט לדגימות הנרחבות יותר הבאות (2 סימולציות MD בסיבוב^השני ).
      הערה: כדי להפחית את ההשפעה מהנתיב הראשוני ולאפשר שיווי משקל מקומי, הוסרו 10-ns מהתקופה הראשונית של הסימולציות.
   2. בחר זוגות מרחקים בין חלבון לדנ"א כפרמטרים של קלט עבור היטל ניתוח רכיבים שאינם תלויים בזמן (tICA)46,47,48. השתמש בפקודה make_ndx ב- GROMACS כדי לעשות זאת:
      gmx_mpi make_ndx -f קלט.pdb -o index.ndx
      הערה: כאן נבחרו אטומי החלבון CA והאטומים הכבדים (NH1, NH2, OH, NZ, NE2, ND2) של שאריות Y119, K122, K125, R131, Y133, Q146, K144, R135, W116, R117, Y134, K118, Q121 שיכולים ליצור קשרי מימן (HBs) עם נוקלאוטיד הדנ"א, אשר מתחברים עם אטומי O1P O2P ו-N6 של נוקלאוטיד הדנ"א (A14-20, ט19-23). חומצות האמינו שנבחרו יכולות ליצור HBs יציבים או גשרי מלח עם DNA.
   3. העתק את אינדקס האטום שנבחר לעיל מקובץ index.ndx לקובץ טקסט חדש (אינדקס.dat). קבל את המידע הזוגי בין אטומים אלה על ידי סקריפט הפיתון מקובץ משלים 1 generate_atom_indices.py והקלד:
      python2.6 אינדקס generate_atom_indices.py.dat > AtomIndices.txt
      זה יוצר את 415 זוגות המרחקים בין חלבון לדנ"א.
   4. חשב את 415 זוגות המרחקים מכל מסלול על-ידי הקלדת הפקודה הבאה בחלון הפקודה של MSMbuilder:
      msmb AtomPairsFeaturizer -out pair_features --pair_indices AtomIndices.txt --הפניות מובילות.pdb --trjs "מסלולים/*.xtc" --pair_features טרנספורמציה --צעד 5
   5. בצע tICA כדי להקטין את ממד הנתונים על שני הרכיבים הראשונים שאינם תלויים בזמן (tICs) או וקטורים על ידי הקלדה:
      msmb tICA -i .. /tica_rc_a/tmp/ -o tica_results --n_components 2 --lag_time 10 --גמא 0.05 -t tica_results.h5
      הערה: tICA היא שיטת הפחתת ממדים המחשבת את eigenvalue של מטריצת המתאם המפגרת בזמן כדי לקבוע את דרגות החופש המרגיעות האיטיות ביותר של מערכת הסימולציה על ידי המשוואה:
      
      כאשר X_i(t) הוא הערך של קואורדינטת התגובה i-th בזמן t, ו- X_j(t+Δt) הוא הערך של קואורדינטת התגובה j-th בזמן t+Δt. הוא ערך הציפייה של המכפלה של מסלולי הסימולציה הכוללים X_i(t) ו-X_j(t + Δt). הכיוונים לאורך דרגות החופש המרגיעות האיטיות ביותר תואמים את ה- eigenvalues הגדולים ביותר של מטריצת המתאם המפגרת בזמן לעיל . כאן, נראה כי 2 tICs הם קבוצה מינימלית להבחנה בין שלושה מקרוסטטים בבניית MSM שלנו (טופלה מאוחר יותר). ניתן גם לחשב את מטריצה כללית ריילי מניין (GMRQ) ציון⁴⁹, למשל, כדי לחקור קבוצה אופטימלית של רכיבים לשימוש.
   6. השתמש בפקודה ב- MSMbuilder כדי לקבץ את מערכי הנתונים הצפויים ל- 100 אשכולות בשיטת K-center^43,44 (ראה איור 1B):
      msmb KCenters -i ./tica_results.h5 -o kcenters_output -t kcenters_output --n_clusters 100.
      בחר את המבנה המרכזי של כל אשכול כמבנה ההתחלתי של הסיבוב^השני של סימולציות MD. שמור על מידע הסימולציה של 100 המבנים המדומים, כולל מיקומים, טמפרטורות, לחצים וכו ', למעט המהירויות.
      הערה: לאחר הסיבוב הראשון של 25 סימולציות, הזיכרון של הנתיב הראשוני הופחת, כך שאנו מייצרים יותר אשכולות, למשל, 100 אשכולות, בסיבוב השני, כדי להרחיב באופן משמעותי את הדגימות הקונפורמיות.
4. ביצוע סימולציות MD נרחבות בסיבוב^השני
   1. בצע סימולציות MD של 60-ns החל מ-100 המבנים הראשוניים הללו לאחר הטלת מהירויות ראשוניות אקראיות על כל האטומים. הוסף את המהירויות הראשוניות האקראיות על ידי הפעלת יצירת המהירות בקובץ mdp, כלומר, שינוי הקובץ md.mdp gen_vel = לא gen_vel = כן.
   2. הסר את 10 ה- ns הראשונים של כל סימולציה כמתואר בשלב 1.3.1, אסוף 2,500,000 תמונות מ- 100 × 50 ns מסלולים באופן שווה כדי לבנות את ה- MSM.
      הערה: שים לב שבבניית המקרוסטטים המאוחרת יותר, נמצאו מספר קטן של מצבים מחוץ לנתיב עם אוכלוסייה נמוכה במיוחד (~0.2%, בתחתית מישור X-Θ). מצבים אלה מחוץ לנתיב מסווגים כמקרו-מדינה אחת כאשר המספר הכולל של מקרו-סטטים מוגדר כ-3 עד 6 (איור 2B). מכיוון שמקרוסטייט בעל אוכלוסייה כה נמוכה כולל רק 3 מסלולים, שהוסרו בסופו של דבר, התוצאות המוצגות בפרוטוקול זה אכן התקבלו מ-97 × מסלולים של 50 ns, עם סך של 2,425,000 פריימים או תמונות.
5. אשכולות מסלולי MD בסיבוב^השני
   1. ביצוע tICA עבור מסלולי הסיבוב^השני כפי שנעשה בעבר. הקלד ב- MSMbuilder:
      msmb tICA -i .. /tica_rc_a/tmp/ -o tica_results --n_components 2 --lag_time 10 --גמא 0.05 -t tica_results.h5
   2. חישב את ציר הזמן המשתמע כדי לאמת פרמטרים עבור מספרי זמן השהיית המתאם Δt ומיקרוסטטים (ראו איור 1C),
      
      כאשר τ מייצג את זמן ההשהיה המשמש לבניית מטריצת הסתברות המעבר (TPM); μ_k(τ) מייצג את kth eigenvalue של ה- TPM תחת זמן השהיה של τ. השתמש בסקריפט python מקובץ משלים 1 עבור פייתון זה BuildMSMsAsVaryLagTime.py -d .. / -f .. /trajlist_num -i 50 -m 1000 -t 10 -n 20 -s 500.
   3. שנה את מספר τ ו- microstates של זמן ההשהיה על-ידי שינוי הפרמטרים שבהם נעשה שימוש לעיל:
      פייתון BuildMSMsAsVaryLagTime.py -d .. / -f .. /trajlist_num -i 50 -m 1000 -t 5 10 20 30 40 -n 20 -s 20 200 400 500 800 2000
      הערה: המערכת נחשבת למרקוביאנית כאשר עקומות ציר הזמן המשתמעות מתחילות להתיישר עם הפרדת קנה המידה של הזמן. לאחר מכן, בחר את ה- Dt כזמן השהיית המתאם, ואת τ את זמן ההשהיה שבו ציר הזמן המשתמע מתחיל להתיישר כדי לבנות MSM.
   4. בהתאם לכך, בחר מספר גדול יחסית (אך לא גדול מדי) של מצבים, N = 500, וזמן עיכוב מתאם קצר יחסית Δt = 10 ns. נמצא כי זמן ההשהיה הוא τ =10 ns לבניית MSM.
   5. סווג את ההתאמות ל-500 אשכולות (ראו איור 1D) באמצעות הפקודה:
      msmb KCenters -i ./tica_results.h5 -o kcenters_output -t kcenters_output --n_clusters 500
6. בניית MSM
   1. רכזו את 500 המיקרוסטטים ל-3-6 מקרוסטטים כדי לגלות את מספר המאקרוסטטים המתאימים ביותר על פי אלגוריתם PCCA+⁵⁰ ב-MSMbuilder, על ידי שימוש בכתב הפיתון בקובץ משלים 1 msm_lumping_usingPCCAplus.py. זהה רשת קינטית מופחתת של מודלים לשינויים הקונפורמיים החיוניים ביותר של ביו-מולקולות, על-ידי בניית מספר קטן של מקרו-סטטים, כלומר על קיבוץ קינטי של מאות מיקרוסטטים כמתואר מתחת^ל-17,51.
   2. ממפה את הקונפורמציות הגבוהות ל-X (תנועת החלבון לאורך ציר ארוך הדנ"א) ואת זווית הסיבוב של החלבון לאורך הדנ"א עבור כל מקרו-סטאט כמתואר בשלבים 1.1.3 ו-1.1.4 (לדוגמה, אין מצב עם אוכלוסייה נמוכה מדי < 1%; ראו איור 2C). לאחר מכן מצא את 3 המקרוסטטים המייצגים בצורה הטובה ביותר את המערכת (איור 1E) . ראו איור 2D לקבלת תמונות של תנועת החלבון לאורך הדנ"א וזווית סיבוב החלבון סביב הדנ"א.
      הערה: בעבודה קודמת שיצרה את נתיב הדריכה קדימה של חלבון ספונטני של 10 מיקרו-μs, ערכנו בנוסף סימולציות MD של שיווי משקל של 5 x 4 מיקרו-μs כדי להרחיב באופן מתון את הדגימות. הראינו את המיפוי של הנתיב הקדמי המקורי (ראו איור 2A משמאל) ומסלולי דגימה נוספים של 4 מיקרו-מיקרו-μs בנתיב קדימה שנערכו בעבר (ראו איור 2A מימין)⁸. מוצג המיפוי של 100 × 50 ns המקוריים (ראו איור 2B משמאל)⁸ ומסלולים של 97 × 50 ns ששימשו בעבודה זו (ראו איור 2B מימין).
7. חישוב זמני המעבר הראשונים הממוצעים (MFPT)
   1. בצע חמישה מסלולים של 10 אלפיות השנייה מונטה קרלו (MC) בהתבסס על ה- TPM של MSM של 500 מיקרו-מדינה כאשר זמן ההשהיה של 10 ns מוגדר כשלב הזמן של MC. חשב את MFPT⁵² בין כל זוג של מקרוסטטים (איור 3) על ידי כתב הפיתון בקובץ משלים 1 פייתון פיתון mfpt_msm3.py.
   2. חשב את השגיאה הממוצעת והסטנדרטית של ה- MFPT באמצעות קובץ bash בקובץ משלים 2, הקלד:
      sh mfpt_analysis.bash

2. ביצוע סימולציה של גרגירים גסים (CG) כדי לדגום דינמיקה ארוכת טווח

1. בצע סימולציות CG באמצעות תוכנת CafeMol 3.0³⁰. ראה את הגדרות הסימולציה של CG שצוינו בקובץ תצורת הקלט עם סיומת .inp, כולל מבני קלט, פרמטרי סימולציה, קבצי פלט וכו '. הקלד את הפקודה הבאה במסוף כדי להפעיל את סימולציית CG:
   cafemol XXX.inp
2. ציין את הבלוקים הבאים בקובץ הקלט, כאשר כל בלוק מתחיל בתווית < and ending with >>>>.
   1. הגדר בלוק שמות קבצים (נדרש) כדי לציין את ספריות העבודה ואת נתיב אחסון קבצי הקלט/פלט. הקלד את הדברים הבאים עבור בלוק שמות הקבצים עבור סימולציות אלה:
      <<<< שמות קבצים
      נתיב = XXXXX (נתיב עבודה)
      filename = wrky (שמות קבצי הפלט)
      פלט psf pdb סרט dcd rst
      path_pdb = XXXXX (נתיב מבנה מקורי של קלט)
      path_ini = XXXXX (נתיב מבנה ראשוני של קלט)
      path_natinfo = XXXXX (נתיב קובץ מידע מקורי)
      path_para = XXXXX (נתיב קבצי פרמטרים)
      >>>>
      הערה: מכיוון שמודל^{Go-model 53} משמש במידול CG, כלומר, החלבון יהיה מוטה לקונפורמציה המקורית, ולכן יש להגדיר את המבנה הממודל כקומפונמציה המקורית. כאן, המבנה הגבישי של הקלט הוגדר כקונפורמינציה המקומית.
   2. הגדר את בלוק בקרת המשימה (הנדרש) להגדרת מצב הריצה של הסימולציות. הקלד את הפקודה הבאה:
      <<<< job_cntl
      i_run_mode = 2 (= 2 סימולציית הטמפרטורה הקבועה)
      i_simulate_type = 1 (=1 דינמיקת לנגווין)
      i_initial_state = 2 (=2 פירושו שהתצורה הראשונית היא תצורה מקורית)
      >>>>
      בחר את סימולציות הדינמיקה של לנגווין בטמפרטורה קבועה.
   3. הגדר את בלוק היחידה והמצב (נדרש) להגדרת המידע עבור מבני קלט. הקלד את הפקודה הבאה:
      <<<< unit_and_state
      i_seq_read_style = 1 (=1 פירושו לקרוא רצפים מקובץ PDB)
      i_go_native_read_style = 1 (=1 פירושו שהמבנה המקורי הוא מקובץ PDB)
      1 חלבון חלבון.pdb (molecular_type native_structure יחידה ומצב)
      2-3 DNA DNA.pdb (molecular_type native_structure יחידה ומדינה)
      >>>>
      הערה: יש צורך בקבצי מבנה הקלט הראשוניים (חלבון.pdb ודנ"א.pdb כאן). המבנים כתובים בפורמט pdb. יש צורך כאן בשני קבצי PDB: האחד הוא קובץ מבנה החלבון המכיל את קואורדינטות האטום הכבדות של WRKY (יחידה 1), והשני הוא הקואורדינטות של דנ"א דו-גדילי (ds) של 200 bp (יחידה 2-3). החלבון ממוקם בתחילה במרחק של 15 Å מהדנ"א.
   4. הגדר את בלוק פונקציית האנרגיה (הנדרש) המוגדר בבלוק energy_function. הקלד את הפקודה הבאה:
      <<<< energy_function
      מקומי(1) L_GO
      מקומי(2-3) L_DNA2
      NLOCAL(1/1) GO EXV ELE
      NLOCAL(2-3/2-3) ELE DNA
      NLOCAL(1/2-3) EXV ELE
      i_use_atom_protein = 0
      i_use_atom_dna = 0
      i_para_from_ninfo = 1
      i_triple_angle_term = 2
      >>>>
      הערה: בהדמיות CG, החלבון מגורען גס על ידי מודל Go⁵³ כאשר כל חומצת אמינו מיוצגת על ידי חלקיק CG הממוקם במיקום Cα שלו. הקונפורמציה של החלבון תהיה מוטה אז לכיוון המבנה הטבעי, או המבנה הגבישי כאן, תחת פוטנציאל Go (איור 4A משמאל). הדנ"א מתואר על ידי מודל 3SPN.2⁵⁴, שבו כל נוקלאוטיד מיוצג על ידי 3 חלקיקי CG S, P, N, המתאימים לסוכר, פוספט ובסיס חנקני, בהתאמה (איור 4A מימין). האינטראקציות האלקטרוסטטיות וה-vdW נחשבות בין שרשראות שונות. האינטראקציות האלקטרוסטטיות בין חלבון לדנ"א בסימולציית CG משוערות על ידי פוטנציאל דביי-הוקל⁵⁵. האנרגיה הדוחה של vdW לובשת את אותה צורה כמו במודל Go.
   5. הגדר את בלוק md_information (נדרש) להגדרת מידע הסימולציה. הקלד את הפקודה הבאה:
      <<<< md_information
      n_step_sim = 1
      n_tstep(1) = 5000000000
      tstep_size = 0.1
      n_step_save = 1000
      n_step_neighbor = 100
      i_com_zeroing = 0
      i_no_trans_rot = 0
      tempk = 300.0
      n_seed = -1
      >>>>
      n_tstep הוא שלב הסימולציה. הגדר את tstep_size כאורך הזמן של כל שלב MD, כל שלב זמן של CG Cafemol הוא בערך 200 fs³⁰, כך שכל צעד MD כאן הוא 200 × 0.1 fs באופן עקרוני. עדכן את רשימת השכנים כל 100 שלבי MD (n_step_neighbor = 100). הגדר את טמפרטורת הסימולציה ל- 300 K. שלוט בטמפרטורה על ידי שימוש באלגוריתם Verlet מסוג מהירות לעדכון מבנה החלבון עם התרמוסטט של ברנדסן⁵⁶.
      הערה: n_step_sim הוא מספר האגן של הפוטנציאל המבוסס על מודל Go, או המספר המינימלי המקומי של עקומת האנרגיה. פוטנציאל של ריבוי אגנים מאפשר לקונפורמציה של חלבונים להיות מוטה לקונפורמציות שונות, כך שקומפונמציית חלבונים יכולה להשתנות ממינימום מקומי אחד למשנהו. כאן נעשה שימוש רק במודל Go של אגן יחיד, שמשמעותו רק קונפורמציה מוטה אחת (מבנה גבישי) לחלבון בסימולציות. בינתיים, מכיוון שאין אינטראקציית קשרי מימן בין חלבון לדנ"א וכו' במודלים בהקשר של CG, ניתן לדגום את התנועות המולקולריות אפילו מהר יותר, כלומר > פי 10 מאשר בסימולציות האטומיות.
   6. הגדר בלוק אלקטרוסטטי (נדרש רק כאשר נעשה שימוש באינטראקציה אלקטרוסטטית) מכיוון שהאינטראקציה האלקטרוסטטית נחשבת בין שרשראות שונות, לכן השתמש בבלוק זה כדי להגדיר את הפרמטרים לאינטראקציה אלקטרוסטטית על ידי הקלדה:
      <<<< אלקטרוסטטי
      cutoff_ele = 10.0
      ionic_strength = 0.15
      >>>>
      הגדר את אורך דביי באינטראקציה האלקטרוסטטית ל- 10 Å, המתאים לתנאי הפתרון. הגדר את העוצמה היונית ל-0.15 מ', כמו במצב הפיזיולוגי.

תוצאות

הזזה מצומדת לסיבוב או דריכה אחת של bp של WRKY מבניית MSM
כל קונפורמציות החלבון בדנ"א ממופות לתנועת האורך X ולזווית הסיבוב של החלבון COM לאורך הדנ"א (ראו איור 3A). הצימוד הליניארי של שתי מעלות אלה מצביע על דריכה מצומדת סיבוב של חלבון התחום WRKY על הדנ"א. ניתן לחלק את הקונפורמצ...

Discussion

עבודה זו עוסקת באופן שבו ניתן לבצע סימולציה חישובית מבוססת מבנה ודגימות כדי לחשוף גורם שעתוק או חלבון TF הנע לאורך הדנ"א, לא רק בפירוט האטומי של דריכה, אלא גם בדיפוזיה התהליכית, החיונית לדיפוזיה הקלה של TF בחיפוש מטרות הדנ"א. כדי לעשות זאת, נבנה לראשונה מודל מצב מרקוב או MSM של חלבון קטן בתחום TF W...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CafeMol	Kyoto University		coarse-grained (CG) simulations
GROMACS	University of Groningen Royal Institute of Technology Uppsala University		molecular dynamics simulations software
Matlab	MathWorks		Numerical calculation software
MSMbuilder	Stanford University		build MSM
VMD	UNIVERSITY OF ILLINOIS AT URBANA-CHAMPAIGN		molecular visualization program