קצב פרץ פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי עבור אינדוקציה של פרפור פרוזדורים בחולדות

Summary

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני של קצב פרץ פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי לאינדוקציה יעילה של פרפור פרוזדורים (AF) בחולדות. ניתן להשתמש בפרוטוקול בחולדות עם לבבות בריאים או משופצים, מה שמאפשר מחקר של פתופיזיולוגיה של AF, זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות והערכה של אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

Abstract

מחקרים בבעלי חיים הביאו תובנות חשובות להבנתנו לגבי פתופיזיולוגיה של פרפור פרוזדורים (AF) וניהול טיפולי. כניסה חוזרת, אחד המנגנונים העיקריים המעורבים בפתוגנזה של AF, דורשת מסה מסוימת של רקמת שריר הלב על מנת להתרחש. בשל גודלו הקטן של האטריה, מכרסמים נחשבים זה מכבר 'עמידים' בפני AF. למרות שהוכח כי מיקוד אוטומטי ספונטני מתרחש בחולדות, נדרש מעקב ארוך טווח (עד 50 שבועות) כדי שהפרעת הקצב תתרחש במודלים אלה. העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני של קצב פרץ פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי לאינדוקציה מהירה ויעילה של AF בחולדות. ניתן להשתמש בפרוטוקול בהצלחה בחולדות עם לב בריא או משופץ, בנוכחות מגוון רחב של גורמי סיכון, המאפשרים מחקר של פתופיזיולוגיה של AF, זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות והערכה של אסטרטגיות מניעתיות ו /או טיפוליות חדשניות.

Introduction

פרפור פרוזדורים (AF) הוא הפרעת קצב הלב המתמשכת הנפוצה ביותר שנתקלים בה בפרקטיקה הקלינית ושכיחותה ממשיכים לעלות באופן דרמטי ברחבי העולם¹. הפרעת קצב זו משפיעה על עד 4% מאוכלוסיית העולם על פי מחקרים אחרונים². עם זאת, בהתחשב בכך ש-AF פרוקסימלי יכול להיות א-סימפטומטי ולכן עשוי לחמוק מזיהוי, השכיחות האמיתית של AF עשויה להיות גבוהה בהרבה מזו המוצגת בספרות.

הפתופיזיולוגיה של AF נחקרה באינטנסיביות. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של הפרעת קצב מורכבת זו נותרים לא ברורים לחלוטין וזה משתקף באפשרויות הטיפוליות המוגבלות, עם יעילות מפוקפקת. מחקרים בבעלי חיים הביאו תובנות חשובות להבנתנו לגבי פתופיזיולוגיה וניהול טיפולי של AF. כניסה חוזרת, אחד המנגנונים העיקריים המעורבים בפתוגנזה של AF³, דורשת מסה מסוימת של רקמת שריר הלב על מנת להתרחש. לפיכך, בעלי חיים גדולים הועדפו בדרך כלל במחקרי AF, בעוד שבשל גודלה הקטן של האטריה שלהם, מכרסמים נחשבים זה מכבר 'עמידים' ל-AF. עם זאת, השימוש בבעלי חיים גדולים נפגע בעיקר על ידי טיפול בקשיים. בינתיים, למרות שהוכח כי מיקוד אוטומטי ספונטני מתרחש בחולדות⁴, נדרש מעקב ארוך טווח (עד 50 שבועות) כדי שהפרעת הקצב תתרחש במודלים אלה⁵. כמו כן פותחו דגמים המבטיחים התרחשות מהירה של AF במכרסמים קטנים. לרוב, מודלים אלה משתמשים בגירוי חשמלי חריף, לעתים קרובות בנוכחות תנאים מועדפים אחרים, כגון גירוי פאראסימפתטי מקביל או חנק, כדי לגרום באופן מלאכותי AF ^6,7. אף על פי שהם יעילים, מודלים כאלה אינם מאפשרים הערכה של תכונות קריטיות הקשורות ל-AF, כגון השיפוץ החשמלי, המבני, האוטונומי או המולקולרי המתקדם של האטריה, וגם לא את ההשפעות של תרופות אנטי-אריתמיות קונבנציונליות או לא קונבנציונליות על מצע הפרוזדורים או על הסיכון לפריעת קצב חדרית ^8,9.

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני של קצב פרץ פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי ארוך טווח לאינדוקציה מהירה ויעילה של AF בחולדות. הפרוטוקול מתאים למחקרים אקוטיים וארוכי טווח וניתן להשתמש בו בהצלחה בחולדות עם לב בריא או משופץ, בנוכחות מגוון רחב של גורמי סיכון, המאפשרים מחקר של פתופיזיולוגיה של AF, זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות והערכה של אסטרטגיות מניעתיות ו /או טיפוליות חדשניות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

נהלים הנוגעים לנבדקים מן החי אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה לרפואה, רוקחות, מדע וטכנולוגיה "ג'ורג' אמיל פאלאדה" מ-Târgu Mureș, על ידי הרשות הלאומית הרומנית לווטרינריה סניטרית ובטיחות מזון, וצייתו להנחיות המועצה הבינלאומית למדעי חיות המעבדה (הנחיה 2010/63/EU).

1. פרוטוקול קצב פרץ פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי

1. מחלקים באופן אקראי חולדות Wistar זכרים בוגרים (200-400 גרם של משקל גוף) לשתי קבוצות: STIM ו-SHAM.
2. להרדים את החיות.
   1. עבור אינדוקציה, השתמש ב-2.5% איזופלורן, 4 ליטר לדקה, 99.5% O₂.
   2. לצורך תחזוקה, יש להשתמש בתערובת של קטמין/מדטומידין (75.0/0.5 מ"ג/ק"ג) הניתן באופן תוך-צפקי.
   3. בדקו את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הקרנית (תמיסת גלוקוז 5%) ורפלקס הגמילה הנוציצפטיבי (צביטה בבוהן). עקוב אחר קצב הנשימה (ירידה של 50% מקובלת במהלך הרדמה; שיעור נורמלי הוא בין 70-120 נשימות לדקה) וטמפרטורת הגוף באמצעות מדחום פי הטבעת (הטמפרטורה הרגילה היא בין 96.5 - 99.5 מעלות פרנהייט או 35.9 - 37.5 מעלות צלזיוס).
      הערה: המשך בהליך רק לאחר אישור יעילות ההרדמה. עקוב אחר עומק ההרדמה מעת לעת לאורך הפרוטוקול. חזור על זריקת הקטמין/מדטומידין התוך-צפקית בעת הצורך.
   4. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים כדי למנוע נזק לקרנית.
3. הניחו את החיה במצב שכיבה והניחו אותה על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בטמפרטורה של כ-37 מעלות צלזיוס.
4. חברו את שלוש אלקטרודות האק"ג המשטחיות לגפי החולדה בתצורת עופרת II (איור 1A).
   1. מניחים את האלקטרודה השלילית על המצח הימני.
   2. מקם את האלקטרודה החיובית על האחורי השמאלי.
   3. מניחים את אלקטרודת ההארקה בצד שמאל.
   4. אבטחו את האלקטרודות למקומם באמצעות כבלי צמיד אלסטיים דקים.
5. הפעל את הקלטת האק"ג על פני השטח ובצע הקלטת א.ק.ג רציפה לאורך כל ההליך (איור 1B) באמצעות תוכנית רכישה מסחרית או תוכנית רכישה שפותחה באופן מקומי¹⁰.
6. לגירוי חשמלי, השתמש בצנתר מרובע 5-6 F המחובר לקוצב לב מבוסס מיקרו-בקר¹⁰.
7. לאחר שהחיה מורדמת, הכנס את הצנתר דרך חלל הפה, לתוך הוושט. מדוד את המרחק בין החותכות העליונות ללב (מוערך על ידי מישוש) כדי להעריך את העומק שבו יש להחדיר את הצנתר לוושט.
   אזהרה: היזהרו שלא לכפות את הצנתר מכיוון שקיים סיכון לניקוב הוושט.
8. אשר את המיקום הנכון של קטטר הגירוי ברמת האטריה כדלקמן.
   1. יש למרוח גירוי חשמלי בתדירות של 400 גירויים לדקה (משך הגירוי 6 אלפיות השנייה).
   2. בדקו אם מעקב האק"ג מראה לכידה מתמדת של האטריה (כלומר, כל גירוי חשמלי מלווה בקומפלקס QRS צר) (איור 2).
9. קבעו את הסף הדיאסטולי – כלומר, המתח הנמוך ביותר הנדרש להשגת לכידת פרוזדורים (בדרך כלל, בין 10 וולט ל-20 וולט).
   הערה: בצע את הפעולות הבאות עבור בעלי החיים בקבוצת STIM.
10. לאחר שנקבע המיקום הנכון של הצנתר, הגדר את הממריץ לתדירות של 4,000 גירויים לדקה (משך גירוי 6 אלפיות השנייה), במתח 3 V מעל הסף הדיאסטולי (איור 3).
11. החל על כל בעל חיים 15 מחזורים רצופים של גירוי, 20 שניות כל אחד, עם מרווח חופשי של 5 דקות בין מחזורים¹¹. בהתאם למטרות המחקר, חזור על הפרוטוקול עבור כל חולדה במשך 10 ימים, בקצב של 5 ימים בשבוע, באותה שעה בכל יום.
12. בדוק את האפקטיביות של הגירוי כדלקמן.
    1. זהה את זמן ההתאוששות של צומת הסינוסים (SNRT), המופיע בסוף הקצב המהיר כמרווח זמן ארוך יותר מאורך המחזור שנרשם במהלך מקצב הסינוסים (איור 4A) ומייצג את מרווח הזמן הנדרש לחידוש מקצב הסינוסים לאחר סיום דיכוי ההילוך יתר.
       הערה: דיכוי הילוך יתר מייצג את העיכוב של פעילות צומת הסינוסים על ידי גירוי חשמלי של הלב בקצב גבוה יותר מהקצב הפנימי.
    2. זהה את ההתרחשות של פרק המיקוד האוטומטי, המוגדר כאן כנוכחות של שלוש פעימות על-חדריות לא סדירות או יותר (כלומר, תגובה חדרית לא סדירה עם קומפלקסי QRS צרים), כאשר גלי P נעדרים או מוחלפים בגלי "f" קטנים ומעוותים (איור 4B).
13. אם פרק המיקוד האוטומטי אינו מסתיים באופן ספונטני עד למועד ביצוע מחזור הגירוי הבא (כלומר, עד סוף חמש הדקות הפנויות בין המחזורים), אל תפעיל את הגירוי הבא.
    1. חכו עוד 5 דקות. אם פרק המיקוד האוטומטי עדיין ממשיך לאחר אותן 10 דקות, סיים את הפרוטוקול לאותו יום.
       הערה: אם יש צורך בהערכה של חומרת המיקוד האוטומטי המושרה חשמלית, ניתן לבצע ניטור א.ק.ג. ארוך יותר.
14. אם ברדיקרדיה חמורה או אסיסטוליה מתרחשת בסוף הגירוי (כלומר, עקב גירוי חשמלי של עצב הוואגוס), לסיים את הפרוטוקול. אם הפעילות החשמלית אינה חוזרת לקדמותה במהירות, בצעו עיסוי לב חיצוני ונתנו אטרופין סולפט (0.05 מ"ג/ק"ג) באופן תוך-צפקי.
15. בסוף ההליך, להפוך את ההרדמה עם atipamezole (1 מ"ג / ק"ג) הניתן באופן תוך צפקי. אחסנו את החולדות בנפרד בכלובים נקיים בחום משלים והתבוננו מעת לעת עד שהן מתאוששות לחלוטין. אין צורך בטיפול ספציפי אחר בבעלי חיים בסוף הפרוטוקול.
16. נתח את מעקבי האק"ג על פני השטח וקבע את הדברים הבאים.
    1. האינדוקציה של מיקוד אוטומטי המתבטאת באחוזים (כלומר, [מספר מחזורי הגירוי ואחריהם פרקי AF / המספר הכולל של מחזורי הגירוי המופעלים] x 100).
    2. משך הזמן של כל פרק AF.
    3. נוכחותם של פרקי AF 'מתמידים' (כלומר, >10 דקות).
       הערה: בצע את הפעולות הבאות עבור בעלי החיים בקבוצת SHAM.
17. עבור החולדות בקבוצת SHAM, בצע את שלבים 1.1 עד 1.7 כמתואר לעיל, מבלי ליישם גירוי חשמלי כלשהו.
18. שמרו על הצנתר במקומו במשך 80 דקות (כלומר, הזמן הדרוש להשלמת הפרוטוקול בחולדות STIM) מבלי להפעיל גירוי חשמלי כלשהו, תוך הקלטה רציפה של א.ק.ג.
19. בסוף ההליך, להפוך את ההרדמה עם atipamezole (1 מ"ג / ק"ג). אין צורך בטיפול ספציפי אחר בבעלי חיים בסוף הפרוטוקול.
20. נתח את מעקבי האק"ג על פני השטח וקבע את הפרמטרים המתוארים בשלב 1.16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במחקר הוכחת היתכנות, 22 חולדות Wistar זכרים בוגרים (200-400 גרם) חולקו באופן אקראי לשתי קבוצות: STIM (n = 15) ו- SHAM (n = 7). כל בעלי החיים שוכנו בנפרד בכלובי פוליקרבונט, בחדר מבוקר אקלים (21-22 מעלות צלזיוס), עם גישה חופשית למים ולמזון יבש לאורך כל המחקר. פרוטוקול הגירוי הטרנס-ווסגיאלי שתואר לעיל הוחל על כל בעלי ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול ניסיוני של קצב פרץ פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי ארוך טווח לאינדוקציה מהירה ויעילה של AF בחולדות, המתאים למחקרי AF חריפים וארוכי טווח כאחד. פרוטוקול הגירוי בן 10 הימים המתואר כאן שימש בהצלחה לפיתוח 'מודל משני של AF ספונטני' (כלומר, מודל שבו, לאחר תקופה של אינדוקציה של AF על י...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4004	for Rats use 1 mg / kg
Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4003	for Rats use 0.5 mg / kg
E-Z Anesthesia Single Animal System	E-Z Systems Inc	EZ-SA800	Allows the manipulation of one animal at a time
Isoflurane 99.9%, 100 mL	Rompharm Company	N01AB06
Ketamine 10%, 25 mL			for Rats use 75 mg / kg
Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)
Surface ECG recording system			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)