Transösophagus-Vorhofflimmer-Pacing für die Induktion von Vorhofflimmern bei Ratten

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit beschreibt ein experimentelles Protokoll des transösophagealen Vorhofburst-Pacings zur effizienten Induktion von Vorhofflimmern (AF) bei Ratten. Das Protokoll kann bei Ratten mit gesunden oder umgebauten Herzen angewendet werden, was das Studium der AF-Pathophysiologie, die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und die Bewertung neuer therapeutischer Strategien ermöglicht.

Zusammenfassung

Tierstudien haben wichtige Erkenntnisse über unser Verständnis der Pathophysiologie und des therapeutischen Managements von Vorhofflimmern (AF) gewonnen. Der Wiedereintritt, einer der Hauptmechanismen der AF-Pathogenese, erfordert eine bestimmte Masse an Myokardgewebe, um auftreten zu können. Aufgrund der geringen Größe der Vorhöfe gelten Nagetiere seit langem als "resistent" gegen Vorhofflimmern. Obwohl gezeigt wurde, dass spontanes Vorhofflimmern bei Ratten auftritt, ist eine langfristige Nachbeobachtung (bis zu 50 Wochen) erforderlich, damit die Arrhythmie in diesen Modellen auftreten kann. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein experimentelles Protokoll des transösophagealen atrialen Burst-Pacings für eine schnelle und effiziente Induktion von Vorhofflimmern bei Ratten. Das Protokoll kann erfolgreich bei Ratten mit gesunden oder umgebauten Herzen in Gegenwart einer Vielzahl von Risikofaktoren angewendet werden, was die Untersuchung der AF-Pathophysiologie, die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und die Bewertung neuartiger prophylaktischer und / oder therapeutischer Strategien ermöglicht.

Einleitung

Vorhofflimmern (AF) ist die häufigste anhaltende Herzrhythmusstörung, die in der klinischen Praxis auftritt, und ihre Inzidenz und Prävalenz nehmen weltweit dramatisch zu¹. Diese Arrhythmie betrifft bis zu 4% der Weltbevölkerung nach neueren Studien². Angesichts der Tatsache, dass paroxysmaler Vorhofflimmern asymptomatisch sein kann und daher der Erkennung entgehen kann, ist die tatsächliche Prävalenz von Vorhofflimmern wahrscheinlich viel höher als in der Literatur dargestellt.

Die Pathophysiologie von AF wurde intensiv untersucht. Dennoch bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen dieser komplexen Arrhythmie unvollständig aufgeklärt und dies spiegelt sich in den begrenzten therapeutischen Möglichkeiten wider, mit fragwürdiger Wirksamkeit. Tierversuche haben wichtige Erkenntnisse über unser Verständnis der AF-Pathophysiologie und des therapeutischen Managements gewonnen. Der Wiedereintritt, einer der Hauptmechanismen der AF-Pathogenese³, erfordert eine bestimmte Masse an Myokardgewebe, um auftreten zu können. Daher wurden große Tiere in AF-Studien im Allgemeinen bevorzugt, während Nagetiere aufgrund der geringen Größe ihrer Vorhöfe lange Zeit als "resistent" gegen Vorhofflimmern galten. Der Einsatz von Großtieren wird jedoch vor allem durch Schwierigkeiten beim Umgang behindert. Obwohl gezeigt wurde, dass spontanes Vorhofflimmern bei Ratten^{auftritt 4}, ist eine langfristige Nachbeobachtung (bis zu 50 Wochen) erforderlich, damit die Arrhythmie in diesen Modellen^{auftreten kann 5}. Es wurden auch Modelle entwickelt, die ein schnelles Auftreten von Vorhofflimmern bei kleinen Nagetieren gewährleisten. Meistens verwenden diese Modelle eine akute elektrische Stimulation, oft in Gegenwart anderer günstiger Bedingungen, wie begleitender parasympathischer Stimulation oder Asphyxie, um AF ^6,7 künstlich zu induzieren. Obwohl solche Modelle effizient sind, erlauben sie weder die Bewertung kritischer AF-bezogener Merkmale, wie z. B. des progressiven elektrischen, strukturellen, autonomen oder molekularen Umbaus der Vorhöfe, noch die Auswirkungen herkömmlicher oder nichtkonventioneller Antiarrhythmika auf das Vorhofsubstrat oder auf das Risiko einer ventrikulären Proarrhythmie ^8,9.

Die vorliegende Arbeit beschreibt ein experimentelles Protokoll des langfristigen transösophagealen atrialen Burst-Pacings für eine schnelle und effiziente Induktion von Vorhofflimmern bei Ratten. Das Protokoll eignet sich sowohl für akute als auch für Langzeitstudien und kann erfolgreich bei Ratten mit gesunden oder umgebauten Herzen in Gegenwart einer Vielzahl von Risikofaktoren angewendet werden, was die Untersuchung der AF-Pathophysiologie, die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und die Bewertung neuartiger prophylaktischer und / oder therapeutischer Strategien ermöglicht.

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Protokoll

Verfahren mit tierischen Subjekten wurden von der Ethikkommission der Universität für Medizin, Pharmazie, Wissenschaft und Technologie "George Emil Palade" von Târgu Mureș, von der rumänischen nationalen Gesundheitsbehörde für Veterinärwesen und Lebensmittelsicherheit genehmigt und entsprachen den Richtlinien des Internationalen Rates für Labortierwissenschaften (Richtlinie 2010/63/EU).

1. Transösophageales atriales Burst-Pacing-Protokoll

1. Randomisieren Sie erwachsene männliche Wistar-Ratten (200-400 g Körpergewicht) in zwei Gruppen: STIM und SHAM.
2. Betäuben Sie die Tiere.
   1. Für die Induktion verwenden Sie 2,5% Isofluran, 4 l/min, 99,5%_O2.
   2. Verwenden Sie zur Erhaltung eine Mischung aus Ketamin / Medetomidin (75,0 / 0,5 mg / kg), die intraperitoneal verabreicht wird.
   3. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Hornhautreflex (5% ige Glukoselösung) und den nozizeptiven Entzugsreflex (Zehenpinch) testen. Überwachen Sie die Atemfrequenz (ein Rückgang von 50% ist während der Anästhesie akzeptabel; die normale Rate liegt zwischen 70-120 Atemzügen / Minute) und die Körpertemperatur mit einem Rektalthermometer (normale Temperatur liegt zwischen 96,5 - 99,5 ° F oder 35,9 - 37,5 ° C).
      HINWEIS: Setzen Sie das Verfahren erst fort, nachdem die Wirksamkeit der Anästhesie bestätigt wurde. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie regelmäßig während des gesamten Protokolls. Wiederholen Sie bei Bedarf die intraperitoneale Ketamin-/Medetomidin-Injektion.
   4. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden.
3. Legen Sie das Tier in Rückenlage und legen Sie es auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur bei ~ 37 ° C zu halten.
4. Befestigen Sie die drei Oberflächen-EKG-Elektroden in einer Blei-II-Konfiguration an den Gliedmaßen der Ratte (Abbildung 1A).
   1. Platzieren Sie die negative Elektrode auf dem rechten Vorderbein.
   2. Platzieren Sie die positive Elektrode auf dem linken Hinterbein.
   3. Platzieren Sie die Erdungselektrode auf dem linken Vorderbein.
   4. Befestigen Sie die Elektroden mit dünnen elastischen Armbandschnüren.
5. Schalten Sie die Oberflächen-EKG-Aufzeichnung ein und führen Sie während des gesamten Vorgangs eine kontinuierliche EKG-Aufzeichnung durch (Abbildung 1B) mit einem kommerziellen oder lokal entwickelten Erfassungsprogramm¹⁰.
6. Verwenden Sie für die elektrische Stimulation einen quadripolaren 5-6 F-Katheter, der mit einem Mikrocontroller-basierten Herzschrittmacher¹⁰ verbunden ist.
7. Sobald das Tier betäubt ist, führen Sie den Katheter durch die Mundhöhle in die Speiseröhre ein. Messen Sie den Abstand zwischen den oberen Schneidezähnen und dem Herzen (beurteilt durch Palpation), um sich der Tiefe anzunähern, in der der Katheter in die Speiseröhre eingeführt werden sollte.
   VORSICHT: Achten Sie darauf, den Katheter nicht zu zwingen, da die Gefahr einer Perforation der Speiseröhre besteht.
8. Bestätigen Sie die korrekte Position des Stimulationskatheters auf Höhe der Vorhöfe wie folgt.
   1. Wenden Sie die elektrische Stimulation mit einer Frequenz von 400 Reizen / Minute an (Reizdauer 6 ms).
   2. Überprüfen Sie, ob die EKG-Ablaufverfolgung eine konstante Erfassung der Vorhöfe zeigt (d.h. auf jeden elektrischen Reiz folgt ein schmaler QRS-Komplex) (Abbildung 2).
9. Bestimmen Sie den diastolischen Schwellenwert, d. h. die niedrigste Spannung, die erforderlich ist, um eine Vorhoferfassung zu erhalten (im Allgemeinen zwischen 10 V und 20 V).
   HINWEIS: Führen Sie für die Tiere in der STIM-Gruppe die folgenden Schritte aus.
10. Sobald die korrekte Position des Katheters bestimmt ist, stellen Sie den Stimulator auf eine Frequenz von 4.000 Reizen/Minute (Reizdauer 6 ms) bei einer Spannung 3 V über der diastolischen Schwelle ein (Abbildung 3).
11. Wenden Sie auf jedes Tier 15 aufeinanderfolgende Stimulationszyklen an, jeweils 20 s, mit einem freien Intervall von 5 Minuten zwischen den Zyklen¹¹. Abhängig von den Studienzielen wiederholen Sie das Protokoll für jede Ratte für 10 Tage mit einer Rate von 5 Tagen / Woche zur gleichen Zeit an jedem Tag.
12. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Stimulation wie folgt.
    1. Identifizieren Sie die Sinusknoten-Wiederherstellungszeit (SNRT), die am Ende des schnellen Tempos als Zeitintervall angezeigt wird, das länger ist als die während des Sinusrhythmus aufgezeichnete Zykluslänge (Abbildung 4A) und das Zeitintervall darstellt, das für die Wiederaufnahme des Sinusrhythmus nach Beendigung der Overdrive-Unterdrückung erforderlich ist.
       HINWEIS: Die Overdrive-Unterdrückung stellt die Hemmung der Sinusknotenaktivität dar, indem das Herz mit einer höheren Rate als der intrinsische Rhythmus elektrisch stimuliert wird.
    2. Identifizieren Sie das Auftreten der AF-Episode, die hier als das Vorhandensein von drei oder mehr aufeinanderfolgenden unregelmäßigen, supraventrikulären Schlägen (d. h. unregelmäßige ventrikuläre Reaktion mit engen QRS-Komplexen) definiert ist, wobei P-Wellen fehlen oder durch kleine, verzerrte "f" -Wellen ersetzt werden (Abbildung 4B).
13. Wenn die AF-Episode nicht spontan endet, wenn der nächste Stimulationszyklus durchgeführt werden soll (d. h. bis zum Ende der fünf freien Minuten zwischen den Zyklen), wenden Sie die nächste Stimulation nicht an.
    1. Warten Sie weitere 5 Minuten. Wenn die AF-Episode nach diesen 10 Minuten immer noch fortgesetzt wird, beenden Sie das Protokoll für diesen Tag.
       HINWEIS: Wenn eine Bewertung des Schweregrads des elektrisch induzierten AF gewünscht wird, kann eine längere EKG-Überwachung durchgeführt werden.
14. Wenn am Ende der Stimulation eine schwere Bradykardie oder Asystole auftritt (d. H. Aufgrund einer elektrischen Stimulation des Vagusnervs), beenden Sie das Protokoll. Wenn sich die elektrische Aktivität nicht schnell wieder normalisiert, führen Sie eine externe Herzmassage durch und verabreichen Sie Atropinsulfat (0,05 mg / kg) intraperitoneal.
15. Am Ende des Eingriffs kehren Sie die Anästhesie mit Atipamezol (1 mg / kg) um, das intraperitoneal verabreicht wird. Unterbringen Sie die Ratten einzeln in saubere Käfige mit zusätzlicher Wärme und beobachten Sie regelmäßig, bis sie vollständig geborgen sind. Am Ende des Protokolls ist keine weitere spezifische Tierpflege erforderlich.
16. Analysieren Sie die Oberflächen-EKG-Nachzeichnungen und bestimmen Sie Folgendes.
    1. Die Induktibilität des Vorhofflimmerns, ausgedrückt in Prozent (d. h. [Anzahl der Stimulationszyklen, gefolgt von AF-Episoden / Gesamtzahl der angewendeten Stimulationszyklen] x 100).
    2. Die Dauer jeder AF-Episode.
    3. Das Vorhandensein von "persistenten" (d.h. >10 min) AF-Episoden.
       HINWEIS: Führen Sie für die Tiere in der HAM-Gruppe die folgenden Schritte aus.
17. Führen Sie für die Ratten in der HAM-Gruppe die Schritte 1.1 bis 1.7 wie oben beschrieben aus, ohne elektrische Stimulation anzuwenden.
18. Halten Sie den Katheter 80 Minuten lang in Position (d. h. die Zeit, die für die Fertigstellung des Protokolls bei STIM-Ratten erforderlich ist), ohne elektrische Stimulation anzuwenden, während Sie das Oberflächen-EKG kontinuierlich aufzeichnen.
19. Am Ende des Eingriffs kehren Sie die Anästhesie mit Atipamezol (1 mg / kg) um. Am Ende des Protokolls ist keine weitere spezifische Tierpflege erforderlich.
20. Analysieren Sie die Oberflächen-EKG-Nachzeichnungen und bestimmen Sie die in Schritt 1.16 beschriebenen Parameter.

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Ergebnisse

In einer Proof-of-Concept-Studie wurden 22 erwachsene männliche Wistar-Ratten (200-400 g) nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt: STIM (n = 15) und SHAM (n = 7). Alle Tiere wurden einzeln in Polycarbonatkäfigen in einem klimatisierten Raum (21-22 °C) untergebracht und hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Wasser und Trockenfutter. Das oben beschriebene transösophageale Stimulationsprotokoll wurde auf alle Tiere für 10 Tage, 5 Tage pro Woche angewendet. Alle Tiere durchliefen das gleiche Pr...

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Diskussion

Die vorliegende Arbeit beschreibt ein experimentelles Protokoll des langfristigen transösophagealen atrialen Burst-Pacings für eine schnelle und effiziente Induktion von Vorhofflimmern bei Ratten, das sowohl für akute als auch für langfristige Vorhofflimmerstudien geeignet ist. Das hierin beschriebene 10-Tage-Stimulationsprotokoll wurde erfolgreich verwendet, um ein "sekundäres spontanes AF-Modell" zu entwickeln (d. h. ein Modell, bei dem sich der AF nach einer Periode der AF-Induktion durch elektrische Stimulation ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4004	for Rats use 1 mg / kg
Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4003	for Rats use 0.5 mg / kg
E-Z Anesthesia Single Animal System	E-Z Systems Inc	EZ-SA800	Allows the manipulation of one animal at a time
Isoflurane 99.9%, 100 mL	Rompharm Company	N01AB06
Ketamine 10%, 25 mL			for Rats use 75 mg / kg
Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)
Surface ECG recording system			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)