Stimolazione atriale transesofagea per l'induzione della fibrillazione atriale nei ratti

Riepilogo

Il presente lavoro descrive un protocollo sperimentale di stimolazione dello scoppio atriale transesofageo per un'induzione efficiente della fibrillazione atriale (AF) nei ratti. Il protocollo può essere utilizzato in ratti con cuori sani o rimodellati, consentendo lo studio della fisiopatologia della fibrillazione atriale, l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e la valutazione di nuove strategie terapeutiche.

Abstract

Gli studi sugli animali hanno portato importanti intuizioni nella nostra comprensione della fisiopatologia della fibrillazione atriale (FA) e della gestione terapeutica. Il rientro, uno dei principali meccanismi coinvolti nella patogenesi della FA, richiede una certa massa di tessuto miocardico per verificarsi. A causa delle piccole dimensioni degli atri, i roditori sono stati a lungo considerati "resistenti" alla FA. Sebbene la FA spontanea abbia dimostrato di verificarsi nei ratti, è necessario un follow-up a lungo termine (fino a 50 settimane) affinché l'aritmia si verifichi in quei modelli. Il presente lavoro descrive un protocollo sperimentale di stimolazione dello scoppio atriale transesofageo per un'induzione rapida ed efficiente della FA nei ratti. Il protocollo può essere utilizzato con successo in ratti con cuore sano o rimodellato, in presenza di un'ampia varietà di fattori di rischio, consentendo lo studio della fisiopatologia della FA, l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e la valutazione di nuove strategie profilattiche e/o terapeutiche.

Introduzione

La fibrillazione atriale (FA) è l'aritmia cardiaca sostenuta più comune riscontrata nella pratica clinica e la sua incidenza e prevalenza continuano ad aumentare drammaticamente in tutto il mondo¹. Questa aritmia colpisce fino al 4% della popolazione mondiale secondo recenti studi². Tuttavia, dato che la FA parossistica può essere asintomatica e può quindi sfuggire al rilevamento, è probabile che la vera prevalenza della FA sia molto più alta di quella presentata in letteratura.

La fisiopatologia della FA è stata intensamente studiata. Tuttavia, i meccanismi alla base di questa aritmia complessa rimangono incompletamente chiariti e ciò si riflette nelle limitate opzioni terapeutiche, con efficacia discutibile. Gli studi sugli animali hanno portato importanti intuizioni nella nostra comprensione della fisiopatologia della fibrillazione atriale e della gestione terapeutica. Il rientro, uno dei principali meccanismi coinvolti nella patogenesi^{AF 3}, richiede una certa massa di tessuto miocardico per verificarsi. Pertanto, gli animali di grandi dimensioni sono stati generalmente preferiti negli studi sulla fibrillazione atriale, mentre, a causa delle piccole dimensioni dei loro atri, i roditori sono stati a lungo considerati "resistenti" alla fibrillazione atriale. Tuttavia, l'uso di animali di grandi dimensioni è ostacolato principalmente dalle difficoltà di manipolazione. Nel frattempo, sebbene la fibrillazione^atriale spontanea abbia dimostrato di verificarsi nei ratti 4, è necessario un follow-up a lungo termine (fino a 50 settimane) affinché l'aritmia si verifichi in quei modelli⁵. Sono stati sviluppati anche modelli che garantiscono una rapida presenza di AF in piccoli roditori. Molto spesso, questi modelli usano la stimolazione elettrica acuta, spesso in presenza di altre condizioni favorevoli, come la concomitante stimolazione parasimpatica o l'asfissia, per indurre artificialmente AF ^6,7. Sebbene efficienti, tali modelli non consentono la valutazione di caratteristiche critiche correlate alla FA, come il progressivo rimodellamento elettrico, strutturale, autonomo o molecolare degli atri, né gli effetti dei farmaci antiaritmici convenzionali o non convenzionali sul substrato atriale o sul rischio di pro-aritmia ventricolare ^8,9.

Il presente lavoro descrive un protocollo sperimentale di stimolazione atriale transesofagea a lungo termine per un'induzione rapida ed efficiente della FA nei ratti. Il protocollo è adatto sia per studi acuti che a lungo termine e può essere utilizzato con successo in ratti con cuore sano o rimodellato, in presenza di un'ampia varietà di fattori di rischio, consentendo lo studio della fisiopatologia della FA, l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e la valutazione di nuove strategie profilattiche e/o terapeutiche.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Università di Medicina, Farmacia, Scienza e Tecnologia "George Emil Palade" di Târgu Mureș, dall'Autorità Nazionale Sanitaria Veterinaria e per la Sicurezza Alimentare della Romania e sono conformi alle linee guida del Consiglio Internazionale per la Scienza degli Animali da Laboratorio (Direttiva 2010/63/UE).

1. Protocollo di stimolazione atriale transesofageo

1. Randomizzare ratti Wistar maschi adulti (200-400 g di peso corporeo) in due gruppi: STIM e SHAM.
2. Anestetizzare gli animali.
   1. Per l'induzione, utilizzare 2,5% isoflurano, 4 L/min, 99,5% O₂.
   2. Per il mantenimento, utilizzare una miscela di ketamina/medetomidina (75,0/0,5 mg/kg) somministrata per via intraperitoneale.
   3. Controllare la profondità dell'anestesia testando il riflesso corneale (soluzione di glucosio al 5%) e il riflesso di astinenza nocicettiva (pizzicamento delle dita dei piedi). Monitorare la frequenza respiratoria (una caduta del 50% è accettabile durante l'anestesia; la velocità normale è compresa tra 70-120 respiri / minuto) e la temperatura corporea utilizzando un termometro rettale (la temperatura normale è compresa tra 96,5 - 99,5 ° F o 35,9 - 37,5 ° C).
      NOTA: Continuare la procedura solo dopo che l'efficacia dell'anestesia è stata confermata. Monitorare periodicamente la profondità dell'anestesia durante tutto il protocollo. Ripetere l'iniezione intraperitoneale di ketamina/medetomidina quando necessario.
   4. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire danni alla cornea.
3. Posare l'animale in posizione supina e posizionarlo su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea a ~ 37 ° C.
4. Collegare i tre elettrodi ECG di superficie agli arti del ratto in una configurazione di piombo II (Figura 1A).
   1. Posizionare l'elettrodo negativo sull'arto anteriore destro.
   2. Posizionare l'elettrodo positivo sull'arto posteriore sinistro.
   3. Posizionare l'elettrodo di messa a terra sull'arto anteriore sinistro.
   4. Fissare gli elettrodi in posizione utilizzando sottili corde elastiche del bracciale.
5. Attivare la registrazione ECG di superficie ed eseguire la registrazione ECG continua durante tutta la procedura (Figura 1B) utilizzando un programma di acquisizione commerciale o sviluppato localmente¹⁰.
6. Per la stimolazione elettrica, utilizzare un catetere quadripolare da 5-6 F collegato a un pacemaker cardiaco basato su microcontrollore¹⁰.
7. Una volta che l'animale è anestetizzato, inserire il catetere attraverso la cavità orale, nell'esofago. Misurare la distanza tra gli incisivi superiori e il cuore (valutata dalla palpazione) per approssimare la profondità alla quale il catetere deve essere inserito nell'esofago.
   ATTENZIONE: Fare attenzione a non forzare il catetere in quanto vi è il rischio di perforazione esofagea.
8. Confermare la posizione corretta del catetere di stimolazione a livello degli atri come segue.
   1. Applicare la stimolazione elettrica ad una frequenza di 400 stimoli/minuto (durata dello stimolo 6 ms).
   2. Verificare se il tracciamento ECG mostra una cattura costante degli atri (cioè, ogni stimolo elettrico è seguito da uno stretto complesso QRS) (Figura 2).
9. Determinare la soglia diastolica, cioè la tensione più bassa richiesta per ottenere la cattura atriale (generalmente, tra 10 V e 20 V).
   NOTA: eseguire le seguenti operazioni per gli animali del gruppo STIM.
10. Una volta determinata la corretta posizione del catetere, impostare lo stimolatore su una frequenza di 4.000 stimoli/minuto (durata dello stimolo 6 ms), ad una tensione di 3 V al di sopra della soglia diastolica (Figura 3).
11. Applicare su ogni animale 15 cicli successivi di stimolazione, 20 s ciascuno, con un intervallo libero di 5 min tra i cicli¹¹. A seconda degli obiettivi dello studio, ripetere il protocollo per ogni ratto per 10 giorni, ad una velocità di 5 giorni / settimana, alla stessa ora in ogni giorno.
12. Controllare l'efficacia della stimolazione come segue.
    1. Identificare il tempo di recupero del nodo del seno (SNRT), che appare alla fine del ritmo rapido come un intervallo di tempo più lungo della lunghezza del ciclo registrato durante il ritmo sinusale (Figura 4A) e rappresenta l'intervallo di tempo necessario per la ripresa del ritmo sinusale dopo la fine della soppressione dell'overdrive.
       NOTA: la soppressione dell'overdrive rappresenta l'inibizione dell'attività del nodo del seno stimolando elettricamente il cuore a una velocità superiore al ritmo intrinseco.
    2. Identificare il verificarsi dell'episodio di fibrillazione atriale, che è qui definito come la presenza di tre o più battiti sopraventricolari irregolari consecutivi (cioè risposta ventricolare irregolare con complessi QRS stretti), con onde P assenti o sostituite da piccole onde "f" distorte (Figura 4B).
13. Se l'episodio di fibrillazione atriale non termina spontaneamente nel momento in cui deve essere eseguito il ciclo di stimolazione successivo (cioè entro la fine dei cinque minuti liberi tra i cicli), non applicare la stimolazione successiva.
    1. Attendere altri 5 minuti. Se l'episodio AF continua ancora dopo quei 10 minuti, termina il protocollo per quel giorno.
       NOTA: se si desidera valutare la gravità della fibrillazione atriale indotta elettricamente, è possibile eseguire un monitoraggio ECG più lungo.
14. Se la bradicardia grave o l'asistolia si verificano alla fine della stimolazione (cioè a causa della stimolazione elettrica del nervo vago), terminare il protocollo. Se l'attività elettrica non ritorna rapidamente alla normalità, eseguire un massaggio cardiaco esterno e somministrare atropina solfato (0,05 mg/kg) per via intraperitoneale.
15. Alla fine della procedura, invertire l'anestesia con atipamezolo (1 mg / kg) somministrato per via intraperitoneale. Ospitare i ratti individualmente in gabbie pulite con calore supplementare e osservare periodicamente fino a quando non sono completamente recuperati. Non è richiesta nessun'altra cura specifica degli animali alla fine del protocollo.
16. Analizzare le tracce ECG di superficie e determinare quanto segue.
    1. L'inducibilità della fibrillazione atriale espressa in percentuale (cioè [numero di cicli di stimolazione seguiti da episodi di fibrillazione atriale / numero totale di cicli di stimolazione applicati] x 100).
    2. Durata di ogni episodio AF.
    3. La presenza di episodi di AF "persistenti" (cioè >10 min).
       NOTA: eseguire le operazioni seguenti per gli animali del gruppo SHAM.
17. Per i ratti del gruppo SHAM, seguire i passaggi da 1.1 a 1.7 come descritto sopra, senza applicare alcuna stimolazione elettrica.
18. Mantenere il catetere in posizione per 80 minuti (cioè il tempo necessario per completare il protocollo nei ratti STIM) senza applicare alcuna stimolazione elettrica, registrando continuamente l'ECG di superficie.
19. Alla fine della procedura, invertire l'anestesia con atipamezolo (1 mg / kg). Non è richiesta nessun'altra cura specifica degli animali alla fine del protocollo.
20. Analizzare i tracciati ECG di superficie e determinare i parametri descritti nel passaggio 1.16.

Risultati

In uno studio proof-of-concept, 22 ratti Wistar maschi adulti (200-400 g) sono stati assegnati in modo casuale in due gruppi: STIM (n = 15) e SHAM (n = 7). Tutti gli animali sono stati alloggiati individualmente in gabbie di policarbonato, in una stanza climatizzata (21-22 ° C), con libero accesso all'acqua e al cibo secco per tutto lo studio. Il protocollo di stimolazione transesofagea sopra descritto è stato applicato a tutti gli animali per 10 giorni, 5 giorni alla settimana. Tutti gli animali sono stati sottoposti ...

Discussione

Il presente articolo descrive un protocollo sperimentale di stimolazione dello scoppio atriale transesofageo a lungo termine per un'induzione rapida ed efficiente della FA nei ratti, adatto sia per studi di fibrillazione atriale acuta che a lungo termine. Il protocollo di stimolazione a 10 giorni qui descritto è stato utilizzato con successo per sviluppare un "modello di fibrillazione atriale spontanea secondaria" (cioè un modello in cui, dopo un periodo di induzione della fibrillazione atriale mediante stimolazione el...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4004	for Rats use 1 mg / kg
Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4003	for Rats use 0.5 mg / kg
E-Z Anesthesia Single Animal System	E-Z Systems Inc	EZ-SA800	Allows the manipulation of one animal at a time
Isoflurane 99.9%, 100 mL	Rompharm Company	N01AB06
Ketamine 10%, 25 mL			for Rats use 75 mg / kg
Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)
Surface ECG recording system			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)