Чреспищеводная фаза разрыва предсердий для индукции фибрилляции предсердий у крыс

Резюме

В настоящей работе описан экспериментальный протокол чреспищеводного разрыва предсердий для эффективной индукции фибрилляции предсердий (ФП) у крыс. Протокол может быть использован у крыс со здоровым или реконструированным сердцем, что позволяет изучать патофизиологию ФП, идентифицировать новые терапевтические мишени и оценивать новые терапевтические стратегии.

Аннотация

Исследования на животных внесли важные идеи в наше понимание патофизиологии фибрилляции предсердий (ФП) и терапевтического управления. Повторный вход, один из основных механизмов, участвующих в патогенезе ФП, требует определенной массы ткани миокарда для того, чтобы произойти. Из-за небольшого размера предсердий грызуны долгое время считались «устойчивыми» к ФП. Хотя было показано, что спонтанная ФП возникает у крыс, для возникновения аритмии в этих моделях требуется долгосрочное наблюдение (до 50 недель). В настоящей работе описан экспериментальный протокол чреспищеводного разрыва предсердий для быстрой и эффективной индукции ФП у крыс. Протокол может быть успешно использован у крыс со здоровым или реконструированным сердцем при наличии широкого спектра факторов риска, что позволяет изучать патофизиологию ФП, идентифицировать новые терапевтические мишени и оценивать новые профилактические и / или терапевтические стратегии.

Введение

Фибрилляция предсердий (ФП) является наиболее распространенной устойчивой сердечной аритмией, встречающейся в клинической практике, и ее частота и распространенность продолжают резко расти во всем^мире1. Этой аритмией страдает до 4% населения планеты согласно последним исследованиям². Однако, учитывая, что пароксизмальная ФП может протекать бессимптомно и, следовательно, может избежать обнаружения, истинная распространенность ФП, вероятно, будет намного выше, чем представленная в литературе.

Патофизиология ФП интенсивно изучается. Тем не менее, основные механизмы этой сложной аритмии остаются не полностью выясненными, и это отражается в ограниченных терапевтических возможностях с сомнительной эффективностью. Исследования на животных внесли важные идеи в наше понимание патофизиологии ФП и терапевтического управления. Повторный вход, один из основных механизмов, участвующих в патогенезе^{ФП 3}, требует определенной массы ткани миокарда для того, чтобы произойти. Таким образом, крупные животные, как правило, были предпочтительными в исследованиях ФП, тогда как из-за небольшого размера их предсердий грызуны долгое время считались «устойчивыми» к ФП. Однако использование крупных животных затруднено в основном трудностями с обработкой. Между тем, хотя было показано, что спонтанная ФП возникает у крыс⁴, для возникновения аритмии в этих моделях 5 требуется долгосрочное наблюдение (до⁵⁰ недель). Также были разработаны модели, обеспечивающие быстрое возникновение АС у мелких грызунов. Чаще всего эти модели используют острую электрическую стимуляцию, часто при наличии других благоприятных условий, таких как сопутствующая парасимпатическая стимуляция или асфиксия, для искусственного индуцирования ФП ^6,7. Несмотря на свою эффективность, такие модели не позволяют оценить критические признаки, связанные с ФП, такие как прогрессирующее электрическое, структурное, вегетативное или молекулярное ремоделирование предсердий, а также влияние обычных или нетрадиционных антиаритмических препаратов на субстрат предсердий или на риск желудочковой проаритмии ^8,9.

В настоящей работе описан экспериментальный протокол длительного чреспищеводного разрыва предсердий для быстрой и эффективной индукции ФП у крыс. Протокол подходит как для острых, так и для долгосрочных исследований и может быть успешно использован на крысах со здоровым или реконструированным сердцем при наличии широкого спектра факторов риска, что позволяет изучать патофизиологию ФП, идентифицировать новые терапевтические цели и оценивать новые профилактические и / или терапевтические стратегии.

протокол

Процедуры, касающиеся животных, были одобрены Комитетом по этике Университета медицины, фармации, науки и технологии «Джордж Эмиль Паладе» Из Тыргу-Муреша, Румынским национальным органом по санитарной ветеринарии и безопасности пищевых продуктов и соответствовали руководящим принципам Международного совета по лабораторным наукам о животных (Директива 2010/63 /EU).

1. Протокол чреспищеводного разрыва предсердий

1. Рандомизируйте взрослых самцов крыс Wistar (200-400 г массы тела) на две группы: STIM и SHAM.
2. Обезболивание животных.
   1. Для индукции используют 2,5% изофлурана, 4 л/мин, 99,5% O₂.
   2. Для поддержания используют смесь кетамина/медетомидина (75,0/0,5 мг/кг), вводимую внутрибрюшинно.
   3. Проверьте глубину анестезии, проверив рефлекс роговицы (5% раствор глюкозы) и ноцицептивный рефлекс отмены (защемление пальца ноги). Контролируйте частоту дыхания (падение на 50% допустимо во время анестезии; нормальная скорость составляет от 70 до 120 вдохов в минуту) и температуру тела с помощью ректального термометра (нормальная температура составляет от 96,5 до 99,5 ° F или 35,9 - 37,5 ° C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте процедуру только после того, как эффективность анестезии будет подтверждена. Периодически контролируйте глубину анестезии на протяжении всего протокола. При необходимости повторяют внутрибрюшинную инъекцию кетамина/медетомидина.
   4. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
3. Уложите животное в положение лежа на спине и положите его на грелку для поддержания температуры тела на уровне ~37 °C.
4. Прикрепите три поверхностных электрода ЭКГ к конечностям крыс в конфигурации свинца II (рисунок 1А).
   1. Поместите отрицательный электрод на правую переднюю часть.
   2. Поместите положительный электрод на левую заднюю конечность.
   3. Поместите заземляющий электрод на левую переднюю часть.
   4. Закрепите электроды в нужном положении с помощью тонких эластичных шнуров браслета.
5. Включите запись ЭКГ на поверхности и выполните непрерывную запись ЭКГ на протяжении всей процедуры (рисунок 1B) с использованием коммерческой или локально разработанной программы^{сбора 10}.
6. Для электрической стимуляции используют квадриполярный катетер 5-6 F, подключенный к кардиостимулятору¹⁰ на основе микроконтроллера.
7. После того, как животное будет обезболено, вставьте катетер через ротовую полость, в пищевод. Измерьте расстояние между верхними резцами и сердцем (оценивается путем пальпации), чтобы приблизиться к глубине, на которой катетер должен быть вставлен в пищевод.
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не форсировать катетер, так как существует риск перфорации пищевода.
8. Подтвердите правильное положение стимулирующего катетера на уровне предсердий следующим образом.
   1. Применяют электростимуляцию с частотой 400 раздражителей/мин (продолжительность стимула 6 мс).
   2. Проверьте, показывает ли трассировка ЭКГ постоянный захват предсердий (т.е. за каждым электрическим стимулом следует узкий комплекс QRS) (рисунок 2).
9. Определите диастолический порог, то есть самое низкое напряжение, необходимое для получения захвата предсердий (как правило, от 10 В до 20 В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия для животных в группе STIM.
10. После определения правильного положения катетера установите стимулятор на частоту 4000 стимулов в минуту (длительность стимула 6 мс), при напряжении на 3 В выше диастолического порога (рисунок 3).
11. Применяют к каждому животному 15 последовательных циклов стимуляции, по 20 с каждый, со свободным интервалом 5 мин между циклами¹¹. В зависимости от целей исследования повторяйте протокол для каждой крысы в течение 10 дней, со скоростью 5 дней в неделю, в одно и то же время в каждый день.
12. Проверьте эффективность стимуляции следующим образом.
    1. Определите время восстановления синусового узла (SNRT), которое появляется в конце быстрого темпа как интервал времени, который длиннее длины цикла, зарегистрированной во время синусового ритма (рисунок 4A), и представляет собой интервал времени, необходимый для возобновления синусового ритма после окончания подавления перегрузки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Подавление овердрайва представляет собой ингибирование активности синусового узла путем электрической стимуляции сердца со скоростью, превышающей внутренний ритм.
    2. Определите возникновение эпизода ФП, который определяется здесь как наличие трех или более последовательных нерегулярных, наджелудочковых ударов (т.е. нерегулярного желудочкового ответа с узкими комплексами QRS), при этом P-волны отсутствуют или заменяются небольшими, искаженными «f» волнами (рисунок 4B).
13. Если эпизод ФП не заканчивается спонтанно к моменту выполнения следующего цикла стимуляции (т.е. к концу пяти свободных минут между циклами), не применяйте следующую стимуляцию.
    1. Подождите еще 5 минут. Если эпизод ФП все еще продолжается после этих 10 минут, завершите протокол на этот день.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется оценка тяжести электроиндуцированной ФП, может быть выполнен более длительный мониторинг ЭКГ.
14. Если тяжелая брадикардия или асистолия возникает в конце стимуляции (т.е. из-за электрической стимуляции блуждающего нерва), прекратите протокол. Если электрическая активность не возвращается к норме быстро, выполняют наружный массаж сердца и вводят атропина сульфат (0,05 мг/кг) внутрибрюшинно.
15. В конце процедуры отмените анестезию с помощью атипамезола (1 мг/кг), вводимого внутрибрюшинно. Поместите крыс по отдельности в чистые клетки с дополнительным теплом и периодически наблюдайте, пока они полностью не восстановятся. Никакой другой конкретный уход за животными не требуется в конце протокола.
16. Проанализируйте поверхностные трассировки ЭКГ и определите следующее.
    1. Индуцируемость ФП, которая выражается в процентах (т.е. [количество циклов стимуляции, за которыми следуют эпизоды ФП / общее количество примененных циклов стимуляции] х 100).
    2. Продолжительность каждого эпизода AF.
    3. Наличие «постоянных» (т.е. >10 мин) эпизодов ФП.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия для животных в группе SHAM.
17. Для крыс в группе SHAM выполните шаги с 1,1 по 1,7, как описано выше, без применения какой-либо электрической стимуляции.
18. Поддерживайте катетер в нужном положении в течение 80 мин (т.е. времени, необходимого для завершения протокола у крыс STIM) без применения какой-либо электрической стимуляции, при этом непрерывно регистрируя поверхностную ЭКГ.
19. В конце процедуры отмените анестезию атипамезолом (1 мг/кг). Никакой другой конкретный уход за животными не требуется в конце протокола.
20. Проанализируйте поверхностные трассировки ЭКГ и определите параметры, описанные в шаге 1.16.

Результаты

В экспериментальном исследовании 22 взрослых самца крыс Wistar (200-400 г) были случайным образом распределены на две группы: STIM (n = 15) и SHAM (n = 7). Все животные содержались индивидуально в клетках из поликарбоната, в помещении с климат-контролем (21-22 °C), имея свободный доступ к воде и сухому корму н?...

Обсуждение

В настоящей работе описывается экспериментальный протокол долгосрочного чреспищеводного разрыва предсердий для быстрой и эффективной индукции ФП у крыс, подходящий как для острых, так и для долгосрочных исследований ФП. 10-дневный протокол стимуляции, описанный в настоящем описании, ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4004	for Rats use 1 mg / kg
Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection	Orion Corporation	06043/4003	for Rats use 0.5 mg / kg
E-Z Anesthesia Single Animal System	E-Z Systems Inc	EZ-SA800	Allows the manipulation of one animal at a time
Isoflurane 99.9%, 100 mL	Rompharm Company	N01AB06
Ketamine 10%, 25 mL			for Rats use 75 mg / kg
Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)
Surface ECG recording system			Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript)