הבנה מקיפה של שינוי הליכה הנגרם על ידי חוסר פעילות במכרסמים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מעקב/הערכה תלת-ממדיים של תנועה כדי לתאר שינוי בתנועת ההליכה של חולדות לאחר חשיפה לסביבה מדומה.

Abstract

זה ידוע היטב כי disuse משפיע על מערכות עצביות וכי תנועות המפרקים משתנים; עם זאת, עדיין לא ברור אילו תוצאות מציגות כראוי מאפיינים אלה. המחקר הנוכחי מתאר גישה של ניתוח תנועה המשתמשת בשחזור תלת-ממדי (3D) מצילומי וידאו. באמצעות טכנולוגיה זו, שינויים שאינם מעוררי שימוש בביצועי הליכה נצפו במכרסמים שנחשפו לסביבת מיקרו-כבידה מדומה על ידי פריקת החלק האחורי שלהם בזנבו. לאחר שבועיים של פריקה, החולדות הלכו על הליכון, ותנועות ההליכה שלהן תועדו באמצעות ארבע מצלמות של מכשירים מצומדים מטען (CCD). פרופילי תנועה תלת-ממדיים שוחזרו והושוו לאלה של נבדקי בקרה באמצעות תוכנת עיבוד התמונה. מדדי התוצאה המשוחזרים הציגו בהצלחה היבטים מובחנים של תנועת הליכה מעוותת: מתיחת יתר של מפרקי הברך והקרסול ומיקום גבוה יותר של מפרקי הירך במהלך שלב העמידה. ניתוח תנועה שימושי מכמה סיבות. ראשית, היא מאפשרת הערכות התנהגותיות כמותיות במקום תצפיות סובייקטיביות (למשל, לעבור/להיכשל במשימות מסוימות). שנית, ניתן לחלץ פרמטרים מרובים כדי שיתאימו לצרכים ספציפיים לאחר קבלת מערכי הנתונים הבסיסיים. למרות מכשולים ליישום רחב יותר, ניתן להקל על החסרונות של שיטה זו, כולל עוצמת העבודה והעלות, על ידי קביעת מדידות מקיפות והליכי ניסוי.

Introduction

חוסר פעילות גופנית או disuse מוביל להידרדרות של אפקטים לוקומוטוריים, כגון ניוון שרירים ואובדן עצם¹ ו deconditioning כל הגוף². יתר על כן, לאחרונה הבחין כי חוסר פעילות משפיע לא רק על היבטים מבניים של מרכיבים שלד-שריר, אלא גם על היבטים איכותיים של התנועה. לדוגמה, מיקומי הגפיים של חולדות שנחשפו לסביבה מדומה של מיקרו-כבידה היו שונים מאלה של בעלי חיים שלמים אפילו חודש לאחר שההתערבות הסתיימה^ב-3,4. עם זאת, מעט מאוד דווח על ליקויים בתנועה הנגרמים כתוצאה מחוסר פעילות. כמו כן, מאפייני תנועה מקיפים של ההידרדרות לא נקבעו במלואם.

הפרוטוקול הנוכחי מדגים ודן ביישום של הערכה קינמטית כדי להמחיש שינויים בתנועה על ידי התייחסות לליקויים בתנועה בהליכה המתעוררים באמצעות חוסר שימוש בחולדות הנתונות לפריקה אחורית.

הוכח כי הרחבות יתר של גפיים בהליכה לאחר סביבת מיקרו-כבידה מדומה נצפות הן בבני אדם⁵ והן בבעלי חיים 4,6,7,8. לכן, למען האוניברסליות, התמקדנו בפרמטרים כלליים במחקר זה: זוויות מפרקי הברך והקרסול והמרחק האנכי בין המפרק המטטרסופלנגאלי לירך (שווה בערך לגובה הירך) בנקודה האמצעית של שלב העמידה (אמצע העמידה). יתר על כן, יישומים פוטנציאליים של הערכה קינמטית וידאו מוצעים בדיון.

סדרה של ניתוחים קינמטיים עשויה להיות אמצעי יעיל להערכת היבטים תפקודיים של שליטה עצבית. עם זאת, למרות שניתוחי תנועה פותחו מתצפית טביעת רגל או מדידה פשוטה בווידאו^{שצולם 9,10} למערכות מצלמה^{מרובות 11,12,} שיטות ופרמטרים אוניברסליים טרם נקבעו. השיטה במחקר זה נועדה לספק לניתוח תנועה משותף זה פרמטרים מקיפים.

בעבודה הקודמת¹³, ניסינו להמחיש שינויים בהליכה בחולדות מודל נגעים עצביים באמצעות ניתוח וידאו מקיף. עם זאת, באופן כללי, התוצאות הפוטנציאליות של ניתוחי תנועה מוגבלות לעתים קרובות למשתנים קבועים מראש המסופקים במסגרות הניתוח. מסיבה זו, המחקר הנוכחי פירט עוד יותר כיצד לשלב פרמטרים המוגדרים על ידי המשתמש החלים באופן כללי. הערכות קינמטיות באמצעות ניתוחי וידאו עשויות להיות שימושיות יותר אם ייושמו פרמטרים מתאימים.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קיוטו (Med Kyo 14033) ובוצע בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה 8). חולדות Wistar זכרים בני 7 שבועות שימשו למחקר הנוכחי. סכימה המייצגת את רצף ההליכים מובאת בתיק משלים 1.

1. היכרות חולדות עם הליכון הליכה

הערה: עיין בדוח¹³ שפורסם בעבר לקבלת פרטים לגבי ההליך.

1. הניחו את החולדה על הליכון המיועד למכרסמים (ראו טבלת חומרים). במפגש הראשון, אפשרו לבעל החיים לחקור את ההליכון כדי להתרגל לסביבה.
   הערה: תהליך זה אורך כ-5 דקות.
2. הגדילו בהדרגה את מהירות החגורה לרמה הרצויה (20 ס"מ לשנייה) והוליכו את החולדה. יש להשתמש בהתחשמלות בקצה ההליכון במידת הצורך¹⁴.
   הערה: מפגש הליכה אחד נמשך כ-10-20 דקות.
3. חזור על תהליך זה כל יומיים במשך שבוע אחד או יותר בתדירות אם יש צורך^15,16,17.
   הערה: התחל את תקופת ההיכרות שבוע לפני שלב 2.
4. השאירו את החולדות בקבוצות בכלובים (2-3 חולדות בכל כלוב) עם מחזור אור-חושך של 12 שעות. לספק מזון ומים ad libitum.

2. יישום של פריקה אחורית לחולדות והקמת סמני מפרקים

הערה: הרם את האחוריים של החולדה באמצעות חוט וסרט דבק המחוברים לזנב כפי שתואר בדוחות קודמים^18,19,20. יש לוודא שהחוט והסרט מחוברים בבסיס הזנב כדי למנוע החלקה של עור הזנב. עקוב אחר בעלי החיים ביסודיות וכוונן את גובה הפריקה או ההידוק של הקלטת במידת הצורך.

1. תחת 2-5% שאיפת איזופלורן עם מסכת הרדמה, לעטוף את המחצית הראשונה של רצועת נייר דבק באורך 30 ס"מ סביב החלק הפרוקסימלי של זנב החולדה.
2. מקפלים חוט כותנה באורך 1 מ' (חוט מטבח כותנה, בקוטר של כ-1 מ"מ) לשניים. צור לולאה על ידי קשירת קשר בנקודת האמצע המקופלת של 50 ס"מ. הקשר חייב להיות כ 5 ס"מ מן הקצה כדי להשאיר לולאה היקף 10 ס"מ.
3. אפשר ל-15 הס"מ הנותרים של סרט ההדבקה לעבור פעם אחת דרך לולאת החוט כדי לאבטח את הקלטת. עוטפים את הסרט הנותר סביב החלק הדיסטלי של הזנב.
4. אבטחו את הקצה השני של החוט על הפלטפורמה העליונה של הכלוב. החזיקו את בעלי החיים בכלוב גבוה מספיק כדי לרומם את אחוריהם על ידי זנבותיהם. מלבד הפריקה, ספק את אותה סביבה כמו אלה של קבוצת Ctrl, כגון מזון, מים ומצעי רצפה.
5. הגדר את הסמנים והתוכנה המשותפים (ראה טבלת חומרים) לפי השלבים הבאים.
   הערה: לפרטים בנוגע לשלב זה, ראה Wang et ^al.13.
   1. תחת שאיפת איזופלורן 2-5%, הצמידו סמנים חצי-כדוריים צבעוניים (קוטר 3 מ"מ) לעור המגולח המתאים לציוני דרך גרמיים. שמור על רמת איזופלורן נמוכה ככל האפשר כדי למנוע הרדמה עמוקה מאוד.
   2. ודא כי ציוני הדרך הם עמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי (ASIS), הטרוכנטר מז'ור (מפרק הירך), מפרק הברך (ברך), המאלולוס הלטרלי (קרסול) והמפרק המטטרסופלנגאלי החמישי (MTP)²¹.
      הערה: צבעו את קצה הבוהן אם יש צורך בזווית הבוהן. השתמשו בטוש צבע על בסיס שמן (ראו טבלת חומרים). דבק נוזלי עדיף לדבק מכיוון שצורת הנוזל מתייבשת מהר יותר.

3. מעקב אחר סמנים באמצעות סרטונים שצולמו

1. פתחו את האפליקציה MotionRecorder (ראו טבלת חומרים) והפעילו את ההליכון. מניחים את החולדה על חגורת ההליכון.
   הערה: ארבע המצלמות לצילום וידאו (ראו טבלת חומרים) מונחות לאורך הקצוות הארוכים של ההליכון: שתי מצלמות בכל קצה, במרחק של כ-50 ס"מ על 50 ס"מ זו מזו, הפונות למרכז אזור חגורת ההליכון.
2. הגדל את מהירות החגורה עד 20 ס"מ לשנייה. כאשר החולדה מתחילה ללכת כרגיל במהירות הרצויה, לחץ על תקליט סמל כדי להתחיל את לכידת הווידאו. לאחר שיתקבלו מספיק צעדים (5 צעדים רצופים, רצוי 10 צעדים), עצור את הלכידה על ידי לחיצה על תקליט סמל שוב.
   הערה: לכוד נתונים על מספר בעלי חיים בניסוי אחד. נסו עד חמש פעמים עבור כל חולדה. אם חולדה לא הולכת, ללכוד אחד אחר ולנסות את הראשון מאוחר יותר. קצב הלכידה של המצלמה היה 120 פריימים לשנייה.
3. פתח את אפליקציית 3DCalculator (ראה טבלת חומרים) ואת קובץ הווידאו לניתוח.
4. חתוך את הסרטון על ידי התאמת פס המחוון האופקי בחלק העליון כך שיכיל מספר מספיק של צעדים עוקבים. התמונה שנלכדה משתנה על-ידי גרירת סמלי קצה הקצה של סרגל השקופיות הצהוב.
5. כדי ללכוד את הסמנים, בחר את מקראות הסמן על ידי לחיצה על מקראות הסמן בדגם תמונת המקל, גרירתן לסמן המתאים בסרטון שצולם ושחרור הלחצן. תהליך זה מקצה את צבע הסמן למקרא הסמן בתמונת המקל. חזור על תהליך זה כדי לעקוב אחר כל סמן.
6. לחץ על סמל המעקב האוטומטי . אם המערכת אינה עוקבת במדויק אחר סמנים או שתהליך המעקב נעצר עקב אובדן סמן, עבור למצב ידני.
   הערה: תהליך אוטומטי זה אינו נעצר אלא אם כן הסמנים מתפספסים. אם עצירות מתרחשות לעתים קרובות יותר מאשר כל כמה מסגרות, שקול למקם מחדש את הסמנים האבודים.
7. אם יש צורך במצב ידני, לחץ על הסמל ידני כדי לעבור. לחץ על מקרא הסמן החסר בתמונת המקל ועל הסמן המתאים בסרטון. הסרטון ממשיך עם פריים אחד לכל לחיצה במצב ידני.
   הערה: השתמש באפליקציות הזמינות באופן חופשי המאפשרות לחיצה אוטומטית כדי למנוע עייפות של אלה שעוקבים אחר הסמנים (הופכים אותם לדיגיטליים) (ראו טבלת חומרים).

4. חישוב הפרמטרים הרצויים

1. פתחו את אפליקציית KineAnalyzer (ראו טבלת חומרים) וטענו את הקובץ.
2. עבור לתפריט ' תצוגה' > 'עריכת סמן ראשי' . זה פותח את החלון "סמן הראשי לערוך".
   הערה: סמנים שנתפסו כוללים מספרים פשוטים עד שהם מסומנים בתווית.
3. לחץ על התווית הרצויה (ציון דרך) בכרטיסיית הסמן , ולאחר מכן לחץ על הצבע הרצוי. תהליך זה מייעד כל סמן לציון דרך מסוים.
4. עבור אל כרטיסיית הקישורים . צור קווים על ידי לחיצה על שני סמנים ברצף. תהליך זה יוצר קווים המתאימים לכל איבר באמצעות סמנים מסומנים.
5. הקצו צבעים לקווים שנוצרו על-ידי בחירת הצבע הרצוי מהעמודה 'צבע '.
6. הגדר זוויות על-ידי הקצאת קווי ייחוס/הזזה וכיוונים של הזוויות. עבור אל לשונית הזווית . לאחר מתן שמות לזווית, הקצה וקטור A (קו ייחוס) וקטור B (קו נע) על ידי לחיצה על הסמנים המתאימים לכל ציון דרך. לאחר מכן, הגדר את כיוון הזווית עם ערך במקטע ההפעלה באותה כרטיסייה.
   הערה: במחקר הנוכחי, הפרמטרים שהתמקדו בעיקר היו באמצע שלב העמידה (אמצע העמידה): KSt (זווית הברך), ASt (זווית הקרסול), MHD (מרחק מיטרסו ירך: שווה ערך לגובה הירך, ראה סעיף הבא). זווית הברך וזווית הקרסול הוגדרו כזווית בין עצם הירך והטיביה לבין השוקה ועצם המטטרסל החמישית, בהתאמה. זווית של 0° פירושה שהמפרק היה מכופף לחלוטין.
7. בכרטיסיה מרחק , הגדר את פרמטר המרחק (MHD). בחרו שני סמנים מתאימים במקטע 'קביעת מרחק '. מסלולים משותפים כפונקציה של מחזור צעד מנורמל יהיה זמין גם.
   הערה: הגדרת זוויות/פרמטרים צריכה להתבצע פעם אחת בלבד. ההגדרות של הפרמטרים יהיו זמינות להערכות מאוחרות יותר לאחר השלמת תהליך הגדרה זה.

תוצאות

12 בעלי חיים חולקו באופן אקראי לאחת משתי קבוצות: קבוצת הפריקה (UL, n = 6) או קבוצת הביקורת (Ctrl, n = 6). עבור קבוצת UL, הגפיים האחוריות של בעלי החיים נפרקו על ידי הזנב במשך שבועיים (תקופת UL), בעוד שהחיות של קבוצת Ctrl נותרו חופשיות. שבועיים לאחר הפריקה, קבוצת UL הראתה תבנית הליכה מובחנת בהשוואה לקבוצת Ctrl.

Discussion

שינוי סביבות מוביל לתנודות בהיבטים פונקציונליים וברכיבים שריר-שלד של מערכות לוקומוטוריות^26,27. סטיות במבנים או בסביבות כיווץ עלולות להשפיע על יכולות תפקודיות, ולהימשך גם לאחר פתרון עיוותים מכניים/סביבתיים¹⁹. ניתוח תנועה אובייקטיבי מסייע למדוד ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive Tape	NICHIBAN CO.,LTD.	SEHA25F	Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Auto clicker	N.A.	N.A.	free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker)
CCD Camera	Teledyne FLIR LLC	GRAS-03K2C-C	CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture
Cotton Thread	N.A.	N.A.	Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
Joint marker	TOKYO MARUI Co., Ltd	0.12g BB	6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification
Kine Analyzer	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software for analysis
Konishi Aron Alpha	TOAGOSEI CO.,LTD.	#31204	Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats
Motion Recorder	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software for video recording
Paint Marker	MITSUBISHI PENCIL CO., LTD	PX-21.13	Oil based paint marker to mark toes of animals
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals)	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/)
Three-dimensional(3D) Calculator	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software fo marker tracking
Treadmill	MUROMACHI KIKAI CO.,LTD	MK-685	Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit
Wistar Rats (male, 7-week old)	N.A.	N.A.	Commercially available at experimental animal sources