JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает трехмерное отслеживание/оценку движения для изображения изменения движения походки крыс после воздействия моделируемой среды неиспользования.

Аннотация

Хорошо известно, что неиспользование влияет на нервные системы и что суставные движения изменяются; однако до сих пор неясно, какие результаты должным образом демонстрируют эти характеристики. В настоящем исследовании описывается подход к анализу движения, который использует трехмерную (3D) реконструкцию из видеозахватов. Используя эту технологию, вызванные неиспользованием изменения ходовых характеристик наблюдались у грызунов, подвергающихся воздействию моделируемой среды микрогравитации, разгружая заднюю конечность хвостом. После 2 недель разгрузки крысы ходили по беговой дорожке, и их движения походки были зафиксированы четырьмя камерами с зарядовой связью (ПЗС). Профили 3D-движения были реконструированы и сопоставлены с профилями контрольных субъектов с использованием программного обеспечения для обработки изображений. Реконструированные показатели результатов успешно изобразили различные аспекты искаженного движения походки: гиперэкстензию коленного и голеностопного суставов и более высокое положение тазобедренных суставов во время фазы стойки. Анализ движения полезен по нескольким причинам. Во-первых, он позволяет проводить количественные поведенческие оценки вместо субъективных наблюдений (например, прохождение / неудача в определенных задачах). Во-вторых, после получения фундаментальных наборов данных можно извлечь несколько параметров в соответствии с конкретными потребностями. Несмотря на препятствия для более широкого применения, недостатки этого метода, включая трудоемкость и стоимость, могут быть смягчены путем определения комплексных измерений и экспериментальных процедур.

Введение

Отсутствие физической активности или неиспользование приводит к ухудшению опорно-двигательного аппарата, такого как атрофия мышц и потеря костноймассы 1 и декондиционирование всего тела2. Более того, в последнее время замечено, что бездействие влияет не только на структурные аспекты опорно-двигательного аппарата, но и на качественные аспекты движения. Например, положение конечностей крыс, подвергшихся воздействию смоделированной среды микрогравитации, отличалось от положения неповрежденных животных даже через 1 месяц после окончания вмешательства 3,4. Тем не менее, мало что было сообщено о дефиците движения, вызванном бездействием. Кроме того, не были полностью определены комплексные характеристики движения износов.

Текущий протокол демонстрирует и обсуждает применение кинематической оценки для визуализации изменений движения, ссылаясь на дефицит движения походки, вызванный неиспользованием у крыс, подвергшихся разгрузке задних конечностей.

Показано, что гиперэкстензии конечностей при ходьбе после смоделированной среды микрогравитации наблюдаются как у человека5, так и у животных 4,6,7,8. Поэтому для универсальности мы сосредоточились на общих параметрах в этом исследовании: углах коленного и голеностопного суставов и вертикальном расстоянии между плюснефаланговым суставом и тазобедренным суставом (примерно эквивалентно высоте бедра) в средней точке фазы стойки (посередине). Кроме того, в ходе обсуждения предлагаются потенциальные области применения кинематической оценки видео.

Серия кинематических анализов может быть эффективной мерой для оценки функциональных аспектов нейронного контроля. Однако, хотя анализ движения был разработан от наблюдения следа или простого измерения на захваченном видео 9,10 до нескольких систем камер 11,12, универсальные методы и параметры еще не установлены. Метод в этом исследовании предназначен для обеспечения этого совместного анализа движения с комплексными параметрами.

В предыдущей работе13 мы попытались проиллюстрировать изменения походки у крыс модели поражения нервов с помощью комплексного видеоанализа. Однако в целом потенциальные результаты анализа движения часто ограничиваются заранее определенными переменными, представленными в рамках анализа. По этой причине в настоящем исследовании более подробно описывается, как включить определяемые пользователем параметры, которые являются широко применимыми. Кинематические оценки с использованием видеоанализа могут иметь дальнейшее применение, если реализованы надлежащие параметры.

протокол

Настоящее исследование было одобрено Экспериментальным комитетом по животным Киотского университета (Med Kyo 14033) и выполнено в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, 8-е издание). Для настоящего исследования использовались 7-недельные самцы крыс Wistar. Схема, представляющая последовательность процедур, приведена в дополнительном файле 1.

1. Ознакомление крыс с беговой дорожкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованным отчетом13 для получения подробной информации о процедуре.

  1. Поместите крысу на беговую дорожку, предназначенную для грызунов (см. Таблицу материалов). В первом сеансе позвольте животному исследовать беговую дорожку, чтобы привыкнуть к окружающей среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает около 5 минут.
  2. Постепенно увеличивайте скорость пояса до нужного уровня (20 см/с) и выгуливайте крысу. Используйте электрический шок в конце беговой дорожки, если необходимо14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один сеанс ходьбы длится примерно 10-20 минут.
  3. Повторяйте этот процесс через день в течение 1 недели или чаще, если это необходимо 15,16,17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните ознакомительный период за 1 неделю до шага 2.
  4. Держите крыс группами в клетках (по 2-3 крысы в каждой клетке) с 12-часовым светло-темным циклом. Обеспечьте еду и воду ad libitum.

2. Применение разгрузки задних конечностей к крысам и установка совместных маркеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Поднимите задние конечности крысы с помощью нити и клейкой ленты, прикрепленной к хвосту, как описано в предыдущих докладах 18,19,20. Убедитесь, что нить и лента прикреплены к основанию хвоста, чтобы предотвратить скольжение кожи хвоста. Внимательно следите за животными и при необходимости регулируйте высоту разгрузки или герметичность ленты.

  1. Под 2-5% ингаляции изофлурана с анестезирующей маской оберните первую половину полоски клейкой ленты длиной 30 см вокруг проксимальной части хвоста крысы.
  2. Сложите хлопчатобумажную нить длиной 1 м (хлопковый кухонный шпагат, диаметром около 1 мм) пополам. Сделайте петлю, завязав узел в сложенной средней точке 50 см. Узел должен находиться примерно в 5 см от кончика, чтобы оставить петлю окружности 10 см.
  3. Пусть оставшиеся 15 см клейкой ленты пройдут один раз через петлю резьбы, чтобы закрепить ленту. Оберните оставшуюся ленту вокруг дистальной части хвоста.
  4. Закрепите другой наконечник резьбы на верхней платформе клетки. Держите животных в клетке, которая достаточно высока, чтобы поднять их задние конечности за хвосты. Помимо разгрузки, обеспечьте те же условия, что и для группы Ctrl, такие как еда, вода и напольные принадлежности.
  5. Настройте совместные маркеры и программное обеспечение (см. Таблицу материалов), выполнив следующие действия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этом шаге, пожалуйста, см. Wang et al.13.
    1. Под 2-5% ингаляции изофлурана прикрепляют цветные полусферические маркеры (диаметром 3 мм) к бритой коже, соответствующие костным ориентирам. Держите уровень изофлурана как можно ниже, чтобы предотвратить очень глубокую анестезию.
    2. Убедитесь, что ориентирами являются передний верхний подвздошный отдел позвоночника (ASIS), основной трохантер (тазобедренный сустав), коленный сустав (колено), латеральный маллеол (лодыжка) и пятый плюснефаланговый сустав (MTP)21.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нарисуйте кончик пальца ноги, если необходим угол наклона пальца ноги. Используйте маркер краски на масляной основе (см. Таблицу материалов). Жидкий клей предпочтительнее для клея, так как жидкая форма сохнет быстрее.

3. Отслеживание маркеров с помощью захваченных видео

  1. Откройте приложение MotionRecorder (см. раздел Таблица материалов) и включите беговую дорожку. Поместите крысу на ремень беговой дорожки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре камеры для видеозахвата (см. Таблицу материалов) расположены вдоль длинных краев беговой дорожки: две камеры на каждом краю, примерно 50 см х 50 см друг от друга, обращенные к центру области пояса беговой дорожки.
  2. Увеличьте скорость ленты до 20 см/с. Когда крыса начнет нормально ходить с нужной скоростью, нажмите на значок «Запись », чтобы начать захват видео. Как только будет получено достаточное количество шагов (5 последовательных шагов, предпочтительно 10 шагов), остановите захват, снова нажав на значок «Запись ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных о нескольких животных в одном эксперименте. Попробуйте до пяти раз для каждой крысы. Если крыса не ходит, захватите другую и попробуйте первую позже. Скорость захвата камеры составляла 120 кадров/с.
  3. Откройте приложение 3DCalculator (см. Таблицу материалов) и видеофайл для анализа.
  4. Обрежьте видео, отрегулировав горизонтальный ползунок сверху, чтобы он содержал достаточное количество последовательных шагов. Захваченное изображение изменяется путем перетаскивания значков концевых кончиков желтого слайда.
  5. Чтобы захватить маркеры, выберите условные обозначения маркеров, нажав на легенды маркера на модели изображения флика, перетащив их на соответствующий маркер на захваченном видео и отпустив кнопку. Этот процесс выделяет цвет маркера легенде маркера на картинке стика. Повторите этот процесс для каждого отслеживаемого маркера.
  6. Щелкните значок Автоматическая трассировка . Если система не отслеживает точно маркеры или процесс отслеживания останавливается из-за потери маркера, переключитесь в ручной режим.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот автоматический процесс не останавливается, если маркеры не пропущены. Если остановки происходят чаще, чем каждые несколько кадров, рассмотрите возможность изменения положения потерянных маркеров.
  7. Если требуется ручной режим, щелкните значок Вручную , чтобы переключиться. Нажмите на отсутствующую легенду маркера на картинке стика и соответствующий маркер на видео. Видео продолжается с одним кадром за каждый клик в ручном режиме.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свободно доступные приложения, которые включают автоматический щелчок, чтобы предотвратить усталость тех, кто отслеживает (оцифровывает) маркеры (см. Таблицу материалов).

4. Вычисление желаемых параметров

  1. Откройте приложение KineAnalyzer (см. раздел Таблица материалов) и загрузите файл.
  2. Перейдите в меню Вид > Редактировать маркер. Откроется окно "Редактирование мастера маркера".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Захваченные маркеры имеют простые цифры, пока они не будут помечены.
  3. Нажмите на нужную метку (ориентир) на вкладке маркера , затем нажмите на нужный цвет. Этот процесс обозначает каждый маркер определенному ориентиру.
  4. Перейдите на вкладку ссылки . Создавайте линии, нажимая на два маркера последовательно. Этот процесс создает линии, которые соответствуют каждой конечности, используя помеченные маркеры.
  5. Присвойте цвета созданным линиям, выбрав нужный цвет в столбце «Цвет ».
  6. Определите углы, назначив опорные/движущиеся линии и направления углов. Перейдите на вкладку угол . Назвав угол, назначьте вектор A (опорная линия) и вектор B (движущаяся линия), щелкнув по маркерам , соответствующим каждому ориентиру. Затем определите направление угла со значением в операционной секции на той же вкладке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования параметры, на которых в основном фокусировались, находились в середине фазы положения (середина): KSt (угол колена), ASt (угол лодыжки), MHD (плюсневое расстояние бедра: эквивалентно высоте бедра, см. следующий раздел). Угол колена и угол лодыжки были определены как угол между бедренной и большеберцовой костями и большеберцовой и пятой плюсневой костью соответственно. Угол 0° означает, что соединение было полностью согнуто.
  7. На вкладке расстояние определите параметр расстояния (MHD). Выберите два соответствующих маркера в разделе Настройка расстояния . Также будут доступны совместные траектории в зависимости от нормализованного ступенчатого цикла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определение углов/параметров должно быть выполнено только один раз. Настройки параметров будут доступны для последующей оценки после завершения этого процесса определения.

Результаты

12 животных были случайным образом распределены в одну из двух групп: разгрузочную группу (UL, n = 6) или контрольную группу (Ctrl, n = 6). Для группы UL задние конечности животных были выгружены хвостом в течение 2 недель (период UL), тогда как животные группы Ctrl были оставлены свободными. Через 2 нед?...

Обсуждение

Изменение сред приводит к колебаниям функциональных аспектов и опорно-двигательного аппарата опорно-двигательного аппарата26,27. Аберрации в сократительных структурах или средах могут влиять на функциональные способности, сохраняясь даже после устране...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано Японским обществом содействия науке (JSPS) KAKENHI (No 18H03129, 21K19709, 21H03302, 15K10441) и Японским агентством медицинских исследований и разработок (AMED) (No 15bk0104037h0002).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive TapeNICHIBAN CO.,LTD.SEHA25FAdhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading
Anesthetic Apparatus for Small AnimalsSHINANO MFG CO.,LTD.SN-487-0T
Auto clickerN.A.N.A.free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker)
CCD CameraTeledyne FLIR LLCGRAS-03K2C-CCCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture
Cotton ThreadN.A.N.A.Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage
ISOFLURANE Inhalation SolutionPfizer Japan Inc.(01)14987114133400
Joint markerTOKYO MARUI Co., Ltd0.12g BB6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification
Kine AnalyzerKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Software for analysis
Konishi Aron AlphaTOAGOSEI CO.,LTD.#31204Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats
Motion RecorderKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Software for video recording
Paint MarkerMITSUBISHI PENCIL CO., LTDPX-21.13Oil based paint marker to mark toes of animals
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals)KISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/)
Three-dimensional(3D) CalculatorKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Software fo marker tracking
TreadmillMUROMACHI KIKAI CO.,LTDMK-685Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit
Wistar Rats (male, 7-week old)N.A.N.A.Commercially available at experimental animal sources

Ссылки

  1. Bloomfield, S. A. Changes in musculoskeletal structure and function with prolonged bed rest. Medicine and Science in Sports and Exercise. 29 (2), 197-206 (1997).
  2. Booth, F. W., Roberts, C. K., Laye, M. J. Lack of exercise is a major cause of chronic diseases. Comprehensive Physiology. 2 (2), 1143-1211 (2012).
  3. Walton, K. Postnatal development under conditions of simulated weightlessness and space flight. Brain Research Reviews. 28 (1-2), 25-34 (1998).
  4. Canu, M. H., Falempin, M. Effect of hindlimb unloading on locomotor strategy during treadmill locomotion in the rat. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 74 (4), 297-304 (1996).
  5. Shpakov, A. V., Voronov, A. V. Studies of the effects of simulated weightlessness and lunar gravitation on the biomechanical parameters of gait in humans. Neuroscience and Behavioral Physiology. 48 (2), 199-206 (2018).
  6. Kawano, F., et al. Tension- and afferent input-associated responses of neuromuscular system of rats to hindlimb unloading and/or tenotomy. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 287 (1), 76-86 (2004).
  7. Canu, M. H., Falempin, M. Effect of hindlimb unloading on interlimb coordination during treadmill locomotion in the rat. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 78 (6), 509-515 (1998).
  8. Canu, M. H., Falempin, M. Effect of hindlimb unloading on two hindlimb muscles during treadmill locomotion in rats. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 75 (4), 283-288 (1997).
  9. Walker, J. L., Evans, J. M., Meade, P., Resig, P., Sisken, B. F. Gait-stance duration as a measure of injury and recovery in the rat sciatic nerve model. Journal of Neuroscience Methods. 52 (1), 47-52 (1994).
  10. Rui, J., et al. Gait cycle analysis parameters sensitive for functional evaluation of peripheral nerve recovery in rat hind limbs. Annals of Plastic Surgery. 73 (4), 405-411 (2014).
  11. Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Experimental Neurology. 230 (2), 280-290 (2011).
  12. Zörner, B., et al. Profiling locomotor recovery: Comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nature Methods. 7 (9), 701-711 (2010).
  13. Wang, T., Ito, A., Tajino, J., Kuroki, H., Aoyama, T. 3D kinematic analysis for the functional evaluation in the rat model of sciatic nerve crush injury. Journal of Visualized Experiments. (156), e60267 (2020).
  14. Canu, M. H., Garnier, C., Lepoutre, F. X., Falempin, M. A 3D analysis of hindlimb motion during treadmill locomotion in rats after a 14-day episode of simulated microgravity. Behavioural Brain Research. 157 (2), 309-321 (2005).
  15. Gruner, J. A., Altman, J., Spivack, N. Effects of arrested cerebellar development on locomotion in the rat: Cinematographic and electromyographic analysis. Experimental Brain Research. 40 (4), 361-373 (1980).
  16. Bouët, V., Borel, L., Harlay, F., Gahéry, Y., Lacour, M. Kinematics of treadmill locomotion in rats conceived, born, and reared in a hypergravity field (2 g): Adaptation to 1 g. Behavioural Brain Research. 150 (1-2), 207-216 (2004).
  17. Bojados, M., Herbin, M., Jamon, M. Kinematics of treadmill locomotion in mice raised in hypergravity. Behavioural Brain Research. 244, 48-57 (2013).
  18. Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: Technical aspects. Journal of Applied Physiology. 92 (4), 1367-1377 (2002).
  19. Tajino, J., et al. Discordance in recovery between altered locomotion and muscle atrophy induced by simulated microgravity in rats. Journal of Motor Behavior. 47 (5), 397-406 (2015).
  20. Liu, x., Gao, X., Tong, J., Yu, L., Xu, M., Zhang, J. Improvement of Osteoporosis in Rats With Hind-Limb Unloading Treated With Pulsed Electromagnetic Field and Whole-Body Vibration. Physical Therapy & Rehabilitation Journal. , (2022).
  21. Thota, A. K., Watson, S. C., Knapp, E., Thompson, B., Jung, R. Neuromechanical control of locomotion in the rat. Journal of Neurotrauma. 22 (4), 442-465 (2005).
  22. Canu, M. H., Langlet, C., Dupont, E., Falempin, M. Effects of hypodynamia-hypokinesia on somatosensory evoked potentials in the rat. Brain Research. 978 (1-2), 162-168 (2003).
  23. Dupont, E., Canu, M. H., Falempin, M. A 14-day period of hindpaw sensory deprivation enhances the responsiveness of rat cortical neurons. Neuroscience. 121 (2), 433-439 (2003).
  24. Langlet, C., Bastide, B., Canu, M. H. Hindlimb unloading affects cortical motor maps and decreases corticospinal excitability. Experimental Neurology. 237 (1), 211-217 (2012).
  25. Trinel, D., Picquet, F., Bastide, B., Canu, M. H. Dendritic spine remodeling induced by hindlimb unloading in adult rat sensorimotor cortex. Behavioural Brain Research. 249, 1-7 (2013).
  26. Alkner, B. A., Norrbrand, L., Tesch, P. A. Neuromuscular adaptations following 90 days bed rest with or without resistance exercise. Aerospace Medicine and Human Performance. 87 (7), 610-617 (2016).
  27. English, K. L., Bloomberg, J. J., Mulavara, A. P., Ploutz-Snyder, L. L. Exercise countermeasures to neuromuscular deconditioning in spaceflight. Comprehensive Physiology. 10 (1), 171-196 (2020).
  28. Parks, M. T., Wang, Z., Siu, K. C. Current low-cost video-based motion analysis options for clinical rehabilitation: A systematic review. Physical Therapy. 99 (10), 1405-1425 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены