Comprensione completa dell'alterazione dell'andatura indotta dall'inattività nei roditori

Riepilogo

Il presente protocollo descrive il tracciamento / valutazione del movimento tridimensionale per rappresentare l'alterazione del movimento dell'andatura dei ratti dopo l'esposizione a un ambiente di disuso simulato.

Abstract

È noto che il disuso colpisce i sistemi neurali e che i movimenti articolari vengono alterati; Tuttavia, quali risultati mostrino correttamente queste caratteristiche non è ancora chiaro. Il presente studio descrive un approccio di analisi del movimento che utilizza la ricostruzione tridimensionale (3D) da acquisizioni video. Utilizzando questa tecnologia, sono state osservate alterazioni evocate dal disuso delle prestazioni di deambulazione nei roditori esposti a un ambiente di microgravità simulato scaricando l'arto posteriore dalla coda. Dopo 2 settimane di scarico, i ratti camminavano su un tapis roulant e i loro movimenti di andatura venivano catturati con quattro telecamere CCD (charge-coupled device). I profili di movimento 3D sono stati ricostruiti e confrontati con quelli dei soggetti di controllo utilizzando il software di elaborazione delle immagini. Le misure di esito ricostruite hanno rappresentato con successo aspetti distinti del movimento distorto dell'andatura: iperestensione delle articolazioni del ginocchio e della caviglia e posizione più elevata delle articolazioni dell'anca durante la fase di posizione. L'analisi del movimento è utile per diversi motivi. In primo luogo, consente valutazioni comportamentali quantitative anziché osservazioni soggettive (ad esempio, superato / fallito in determinati compiti). In secondo luogo, è possibile estrarre più parametri per soddisfare esigenze specifiche una volta ottenuti i set di dati fondamentali. Nonostante gli ostacoli per un'applicazione più ampia, gli svantaggi di questo metodo, tra cui l'intensità e il costo del lavoro, possono essere alleviati determinando misurazioni complete e procedure sperimentali.

Introduzione

La mancanza di attività fisica o il disuso porta al deterioramento degli effettori locomotori, come l'atrofia muscolare e la perdita ossea¹ e il decondizionamento di tutto il corpo². Inoltre, è stato recentemente notato che l'inattività influisce non solo sugli aspetti strutturali delle componenti muscolo-scheletriche, ma anche sugli aspetti qualitativi del movimento. Ad esempio, le posizioni degli arti dei ratti esposti a un ambiente di microgravità simulato erano diverse da quelle degli animali intatti anche 1 mese dopo la fine dell'intervento ^3,4. Tuttavia, poco è stato riportato sui deficit di movimento causati dall'inattività. Inoltre, le caratteristiche di movimento complete dei deterioramenti non sono state completamente determinate.

L'attuale protocollo dimostra e discute l'applicazione della valutazione cinematica per visualizzare le alterazioni del movimento facendo riferimento ai deficit di movimento dell'andatura evocati attraverso il disuso nei ratti sottoposti a scarico degli arti posteriori.

È stato dimostrato che iperestensioni degli arti nel camminare dopo un ambiente di microgravità simulato sono osservate sia nell'uomo⁵ che negli animali 4,6,7,8. Pertanto, per l'universalità, ci siamo concentrati sui parametri generali in questo studio: angoli delle articolazioni del ginocchio e della caviglia e distanza verticale tra l'articolazione metatarso-falangea e l'anca (approssimativamente equivalente all'altezza dell'anca) nel punto medio della fase di posizione (midstance). Inoltre, nella discussione vengono suggerite potenziali applicazioni della valutazione cinematica video.

Una serie di analisi cinematiche può essere una misura efficace per valutare gli aspetti funzionali del controllo neurale. Tuttavia, sebbene le analisi del movimento siano state sviluppate dall'osservazione dell'impronta o dalla semplice misurazione su video acquisiti^9,10 a sistemi di telecamere multiple^11,12, i metodi e i parametri universali devono ancora essere stabiliti. Il metodo in questo studio ha lo scopo di fornire questa analisi congiunta del movimento con parametri completi.

Nel lavoro precedente¹³, abbiamo cercato di illustrare le alterazioni dell'andatura nei ratti modello di lesione nervosa utilizzando un'analisi video completa. Tuttavia, in generale, i potenziali risultati delle analisi del movimento sono spesso limitati a variabili predeterminate fornite nei quadri di analisi. Per questo motivo, il presente studio ha ulteriormente dettagliato come incorporare parametri definiti dall'utente che sono ampiamente applicabili. Le valutazioni cinematiche mediante analisi video possono essere di ulteriore utilità se vengono implementati parametri adeguati.

Protocollo

Il presente studio è stato approvato dal Comitato sperimentale sugli animali dell'Università di Kyoto (Med Kyo 14033) ed eseguito in conformità con le linee guida del National Institute of Health (Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a edizione). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi di 7 settimane. Uno schema che rappresenta la sequenza delle procedure è fornito nel fascicolo supplementare 1.

1. Familiarizzare i ratti con il tapis roulant che cammina

NOTA: Si prega di consultare la relazione¹³ precedentemente pubblicata per i dettagli relativi alla procedura.

1. Posiziona il ratto su un tapis roulant progettato per i roditori (vedi Tabella dei materiali). Nella prima sessione, consentire all'animale di esplorare il tapis roulant per abituarsi all'ambiente.
   NOTA: questo processo richiede circa 5 minuti.
2. Aumentare gradualmente la velocità della cintura al livello desiderato (20 cm/s) e camminare con il topo. Utilizzare una scossa elettrica alla fine del tapis roulant se necessario¹⁴.
   NOTA: Una sessione di camminata dura circa 10-20 minuti.
3. Ripetere questo processo a giorni alterni per 1 settimana o più frequentemente se necessario^15,16,17.
   NOTA: iniziare il periodo di familiarizzazione 1 settimana prima del passaggio 2.
4. Tenere i ratti in gruppi in gabbie (2-3 ratti in ogni gabbia) con un ciclo luce-buio di 12 ore. Fornire cibo e acqua ad libitum.

2. Applicazione dello scarico degli arti posteriori ai ratti e creazione di marcatori articolari

NOTA: Sollevare gli arti posteriori del ratto usando filo e nastro adesivo attaccato alla coda come descritto nelle precedenti relazioni^18,19,20. Assicurarsi che il filo e il nastro siano attaccati alla base della coda per evitare lo slittamento della pelle della coda. Monitorare accuratamente gli animali e regolare l'altezza di scarico o la tenuta del nastro, se necessario.

1. Sotto inalazione di isoflurano al 2-5% con una maschera anestetica, avvolgere la prima metà di una striscia di nastro adesivo lunga 30 cm attorno alla porzione prossimale della coda del ratto.
2. Piegare un filo di cotone lungo 1 m (spago da cucina in cotone, diametro circa 1 mm) a metà. Fai un cappio legando un nodo al punto medio piegato di 50 cm. Il nodo deve essere a circa 5 cm dalla punta per lasciare un anello di circonferenza di 10 cm.
3. Lasciare passare i restanti 15 cm del nastro adesivo una volta attraverso l'anello di filettatura per fissare il nastro. Avvolgere il nastro rimanente attorno alla porzione distale della coda.
4. Fissare l'altra punta del filo sulla piattaforma aerea della gabbia. Tieni gli animali in una gabbia abbastanza alta da sollevare gli arti posteriori per la coda. Oltre allo scarico, fornire lo stesso ambiente di quelli per il gruppo Ctrl, ad esempio cibo, acqua e lettiera sul pavimento.
5. Impostare i marcatori di giunzione e il software (vedere Tabella dei materiali) seguendo i passaggi seguenti.
   NOTA: Per i dettagli relativi a questo passaggio, vedere Wang et ^al.13.
   1. Sotto l'inalazione di isoflurano al 2-5%, attaccare marcatori semisferici colorati (diametro 3 mm) alla pelle rasata corrispondente ai punti di riferimento ossei. Mantenere il livello di isoflurano il più basso possibile per prevenire l'anestesia molto profonda.
   2. Assicurarsi che i punti di riferimento siano la colonna iliaca anteriore superiore (ASIS), il grande trocantere (articolazione dell'anca), l'articolazione del ginocchio (ginocchio), il malleolo laterale (caviglia) e la quinta articolazione metatarso-falangea (MTP)²¹.
      NOTA: dipingere la punta della punta se è necessario l'angolo della punta. Utilizzare un pennarello a base di olio (vedere Tabella dei materiali). La colla liquida è preferibile per l'adesivo poiché la forma liquida si asciuga più velocemente.

3. Tracciamento dei marcatori utilizzando i video acquisiti

1. Apri l'app MotionRecorder (vedi Tabella dei materiali) e accendi il tapis roulant. Posizionare il topo sulla cintura del tapis roulant.
   NOTA: Le quattro telecamere per l'acquisizione video (vedi Tabella dei materiali) sono disposte lungo i bordi lunghi del tapis roulant: due telecamere su ciascun bordo, distanti circa 50 cm x 50 cm, rivolte verso il centro dell'area della cintura del tapis roulant.
2. Aumentare la velocità del nastro fino a 20 cm/s. Mentre il topo inizia a camminare normalmente alla velocità desiderata, fai clic sull'icona Registra per avviare l'acquisizione video. Una volta ottenuti un numero sufficiente di passaggi (5 passaggi consecutivi, preferibilmente 10 passaggi), interrompere l'acquisizione facendo nuovamente clic sull'icona Registra .
   NOTA: acquisire dati su più animali in un unico esperimento. Prova fino a cinque volte per ogni ratto. Se un topo non cammina, catturane uno diverso e prova il primo più tardi. La velocità di acquisizione della fotocamera era di 120 fotogrammi/s.
3. Aprire l'app 3DCalculator (vedere Tabella dei materiali) e il file video da analizzare.
4. Ritaglia il video regolando la barra di scorrimento orizzontale in alto in modo da contenere un numero sufficiente di passaggi consecutivi. L'immagine acquisita cambia trascinando le icone delle punte finali della barra di scorrimento gialla.
5. Per acquisire i marcatori, selezionare le legende dei marcatori facendo clic sulle legende dei marcatori sul modello dell'immagine stilista, trascinandole sul marcatore corrispondente sul video acquisito e rilasciando il pulsante. Questo processo assegna il colore del marcatore alla legenda del marcatore nell'immagine stilista. Ripeti questa procedura per tenere traccia di ogni marcatore.
6. Fare clic sull'icona Traccia automatica . Se il sistema non traccia accuratamente i marcatori o il processo di tracciamento si interrompe a causa della perdita dei marcatori, passare alla modalità manuale.
   NOTA: questo processo automatico non si interrompe a meno che i marcatori non vengano persi. Se le interruzioni si verificano più spesso di ogni pochi fotogrammi, prendi in considerazione il riposizionamento degli indicatori persi.
7. Se è necessaria la modalità manuale, fare clic sull'icona Manuale per cambiare. Fai clic sulla legenda del marcatore mancante sull'immagine stilizzata e sul marcatore corrispondente sul video. Il video procede con un fotogramma per ogni clic in modalità manuale.
   NOTA: Utilizzare app disponibili gratuitamente che consentono il clic automatico per evitare l'affaticamento di coloro che tracciano (digitalizzano) i marcatori (vedere Tabella dei materiali).

4. Calcolo dei parametri desiderati

1. Apri l'app KineAnalyzer (vedi Tabella dei materiali) e carica il file.
2. Vai al menu Visualizza > Modifica schema marcatore . Si apre la finestra "Modifica master marcatore".
   NOTA: i marcatori acquisiti hanno numeri semplici finché non vengono etichettati.
3. Fare clic sull'etichetta desiderata (punto di riferimento) nella scheda marcatore , quindi fare clic sul colore desiderato. Questo processo designa ogni marcatore a un punto di riferimento specifico.
4. Vai alla scheda dei collegamenti . Crea linee facendo clic su due marcatori consecutivamente. Questo processo crea linee che corrispondono a ciascun arto utilizzando marcatori etichettati.
5. Assegnare colori alle linee create selezionando il colore desiderato dalla colonna Colore .
6. Definite gli angoli assegnando linee di riferimento/spostamento e direzioni degli angoli. Vai alla scheda angolo. Dopo aver nominato l'angolo, assegna il vettore A (linea di riferimento) e il vettore B (linea in movimento) facendo clic sugli indicatori corrispondenti a ciascun punto di riferimento. Quindi, definite la direzione dell'angolo con un valore nella sezione Operate nella stessa scheda.
   NOTA: Per il presente studio, i parametri principalmente focalizzati su erano al centro della fase di posizione (midstance): KSt (angolo del ginocchio), ASt (angolo della caviglia), MHD (distanza dell'anca metatarso: equivalente all'altezza dell'anca, vedere la prossima sezione). L'angolo del ginocchio e l'angolo della caviglia sono stati definiti come l'angolo tra il femore e la tibia e la tibia e il quinto osso metatarsale, rispettivamente. Un angolo di 0° significa che il giunto era completamente flesso.
7. Nella scheda distanza definire il parametro distanza (MHD). Selezionare due indicatori corrispondenti nella sezione Impostazione distanza . Saranno disponibili anche traiettorie articolari in funzione del ciclo di passi normalizzato.
   NOTA: la definizione di angoli/parametri deve essere eseguita una sola volta. Le impostazioni dei parametri saranno disponibili per valutazioni successive una volta completato questo processo di definizione.

Risultati

12 animali sono stati assegnati in modo casuale a uno dei due gruppi: il gruppo di scarico (UL, n = 6) o il gruppo di controllo (Ctrl, n = 6). Per il gruppo UL, gli arti posteriori degli animali sono stati scaricati dalla coda per 2 settimane (periodo UL), mentre gli animali del gruppo Ctrl sono stati lasciati liberi. 2 settimane dopo lo scarico, il gruppo UL ha mostrato un modello di andatura distinto rispetto al gruppo Ctrl. La Figura 1 mostra traiettorie articolari normalizzate di soggett...

Discussione

L'alterazione degli ambienti porta a fluttuazioni degli aspetti funzionali e delle componenti muscolo-scheletriche dei sistemi locomotori^26,27. Le aberrazioni nelle strutture o negli ambienti contrattili possono influire sulle capacità funzionali, persistendo anche dopo aver risolto le distorsioni meccaniche/ambientali¹⁹. L'analisi oggettiva del movimento aiuta a misurare quantitativamente queste abilità funzionali. Come mostrato sopra, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive Tape	NICHIBAN CO.,LTD.	SEHA25F	Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Auto clicker	N.A.	N.A.	free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker)
CCD Camera	Teledyne FLIR LLC	GRAS-03K2C-C	CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture
Cotton Thread	N.A.	N.A.	Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
Joint marker	TOKYO MARUI Co., Ltd	0.12g BB	6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification
Kine Analyzer	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software for analysis
Konishi Aron Alpha	TOAGOSEI CO.,LTD.	#31204	Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats
Motion Recorder	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software for video recording
Paint Marker	MITSUBISHI PENCIL CO., LTD	PX-21.13	Oil based paint marker to mark toes of animals
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals)	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/)
Three-dimensional(3D) Calculator	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software fo marker tracking
Treadmill	MUROMACHI KIKAI CO.,LTD	MK-685	Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit
Wistar Rats (male, 7-week old)	N.A.	N.A.	Commercially available at experimental animal sources