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요약

본 프로토콜은 시뮬레이션된 불사용 환경에 노출된 후 쥐의 보행 동작 변화를 묘사하기 위한 3차원 동작 추적/평가를 설명합니다.

초록

사용하지 않으면 신경계에 영향을 미치고 관절 운동이 변경된다는 것은 잘 알려져 있습니다. 그러나 어떤 결과가 이러한 특성을 적절하게 나타내는지는 여전히 불분명합니다. 본 연구는 비디오 캡처로부터 3차원(3D) 재구성을 활용하는 모션 분석 접근법을 설명한다. 이 기술을 사용하여 꼬리로 뒷다리를 내림으로써 시뮬레이션 된 미세 중력 환경에 노출 된 설치류에서 보행 성능의 불사용으로 유발 된 변화가 관찰되었습니다. 2 주간의 하역 후, 쥐는 러닝 머신을 걸었고, 그들의 보행 동작은 4 개의 전하 결합 장치 (CCD) 카메라로 포착되었습니다. 3D 모션 프로파일을 재구성하고 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 제어 대상의 프로파일과 비교했습니다. 재구성 된 결과 측정은 왜곡 된 보행 동작의 뚜렷한 측면을 성공적으로 묘사했습니다 : 무릎과 발목 관절의 과신 확장 및 자세 단계에서 고관절의 높은 위치. 모션 해석은 여러 가지 이유로 유용합니다. 첫째, 주관적인 관찰 대신 정량적 행동 평가를 가능하게합니다 (예 : 특정 작업의 합격 / 불합격). 둘째, 기본 데이터 세트를 얻은 후 특정 요구에 맞게 여러 매개 변수를 추출 할 수 있습니다. 더 넓은 적용을위한 장애물에도 불구하고, 노동 강도 및 비용을 포함한이 방법의 단점은 포괄적 인 측정 및 실험 절차를 결정함으로써 완화 될 수 있습니다.

서문

신체 활동의 부족 또는 사용하지 않으면 근육 위축 및 뼈 손실1 및 전신 컨디셔닝해제2와 같은 운동 이펙터의 악화로 이어집니다. 또한, 최근 비활성은 근골격계 구성 요소의 구조적 측면뿐만 아니라 운동의 질적 측면에도 영향을 미친다는 것이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 시뮬레이션 된 미세 중력 환경에 노출 된 쥐의 사지 위치는 개입이 끝난 후 1 개월 후에도 손상되지 않은 동물의 사지 위치와 달랐습니다 3,4. 그럼에도 불구하고 비활동으로 인한 운동 장애에 대해서는 거의 보고되지 않았습니다. 또한, 열화의 포괄적 인 운동 특성은 완전히 결정되지 않았다.

현재 프로토콜은 뒷다리 언로딩을 받은 쥐의 미사용으로 인해 유발된 보행 운동 결함을 참조하여 동작 변화를 시각화하기 위한 운동학적 평가의 적용을 시연하고 논의합니다.

시뮬레이션 된 미세 중력 환경 이후 보행시 팔다리의 과신 전은 인간 5 및 동물 4,6,7,8 모두에서 관찰되는 것으로 나타났습니다. 따라서 보편성을 위해이 연구에서는 무릎과 발목 관절의 각도와 자세 단계 (중간)의 중간 지점에서 중족 지간 관절과 엉덩이 사이의 수직 거리 (대략 엉덩이 높이와 동일)와 같은 일반적인 매개 변수에 중점을 두었습니다. 또한 비디오 운동학 평가의 잠재적 응용 프로그램이 토론에서 제안됩니다.

일련의 운동학적 분석은 신경 제어의 기능적 측면을 평가하는 효과적인 척도가 될 수 있습니다. 그러나, 모션 분석이 풋프린트 관찰 또는 캡처된 비디오(9,10)에 대한 간단한 측정으로부터 다수의 카메라 시스템(11, 12)으로 개발되었지만, 보편적인 방법 및 파라미터는 아직 확립되지 않았다. 이 연구의 방법은이 관절 운동 분석에 포괄적 인 매개 변수를 제공하기위한 것입니다.

이전 작업13에서 우리는 포괄적 인 비디오 분석을 사용하여 신경 병변 모델 쥐의 보행 변화를 설명하려고했습니다. 그러나 일반적으로 모션 해석의 잠재적 결과는 종종 해석 프레임워크에 제공된 미리 결정된 변수로 제한됩니다. 이러한 이유로 본 연구에서는 광범위하게 적용 가능한 사용자 정의 매개 변수를 통합하는 방법을 자세히 설명했습니다. 비디오 분석을 사용한 운동학적 평가는 적절한 매개변수가 구현되면 추가로 사용될 수 있습니다.

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프로토콜

본 연구는 교토 대학 동물 실험위원회 (Med Kyo 14033)의 승인을 받았으며 국립 보건원 지침 (실험실 동물의 관리 및 사용 가이드, 제 8 판)에 따라 수행되었습니다. 7주령의 수컷 Wistar 래트를 본 연구에 사용하였다. 절차 순서를 나타내는 회로도는 보충 파일 1에 제공됩니다.

1. 러닝머신 걷기에 쥐 익히기

참고: 절차에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 보고서13 을 참조하십시오.

  1. 설치류를 위해 설계된 러닝 머신에 쥐를 놓습니다 ( 재료 표 참조). 첫 번째 세션에서는 동물이 러닝 머신을 탐험하여 환경에 익숙해 지도록하십시오.
    참고: 이 프로세스는 약 5분 정도 소요됩니다.
  2. 벨트의 속도를 원하는 수준(20cm/s)으로 점차적으로 높이고 쥐를 걷습니다. 필요한 경우 런닝 머신 끝에 전기 충격을 사용하십시오14.
    알림: 한 번의 걷기 세션은 약 10-20 분 동안 지속됩니다.
  3. 이 과정을 1 주일 동안 격일로 반복하거나 필요한 경우 더 자주반복하십시오 15,16,17.
    참고: 2단계 1주일 전에 친숙화 기간을 시작합니다.
  4. 쥐를 케이지 (각 케이지에 2-3 마리의 쥐)에 그룹으로 12 시간의 명암주기로 유지하십시오. 음식과 물을 자유롭게 제공하십시오.

2. 쥐에 뒷다리 하역 적용 및 관절 마커 설치

알림: 이전 보고서18,19,20에 설명된 대로 꼬리에 부착된 실과 접착 테이프를 사용하여 쥐의 뒷다리를 들어 올립니다. 꼬리 피부의 미끄러짐을 방지하기 위해 실과 테이프가 꼬리 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오. 동물을 철저히 모니터링하고 필요한 경우 테이프의 하역 높이 또는 조임을 조정하십시오.

  1. 마취 마스크로 2-5 % 이소 플루 란 흡입하에 쥐 꼬리의 근위 부분 주위에 30cm 길이의 접착 테이프 스트립의 전반부를 감습니다.
  2. 1m 길이의 면사(면 주방 꼬기, 직경 약 1mm)를 반으로 접습니다. 접힌 50cm 중간 지점에서 매듭을 묶어 고리를 만듭니다. 매듭은 10cm 둘레 고리를 남기기 위해 끝에서 약 5cm 떨어져 있어야합니다.
  3. 접착 테이프의 나머지 15cm가 스레드 루프를 한 번 통과하여 테이프를 고정합니다. 꼬리의 말단 부분에 나머지 테이프를 감습니다.
  4. 나사산의 다른 쪽 끝을 케이지의 오버 헤드 플랫폼에 고정하십시오. 꼬리로 뒷다리를 들어 올릴 수있을만큼 높은 새장에 동물을 보관하십시오. 하역 이외에 Ctrl 그룹과 동일한 환경(예: 음식, 물, 바닥 침구)을 제공합니다.
  5. 아래 단계에 따라 조인트 마커와 소프트웨어( 재료 표 참조)를 설정합니다.
    참고: 이 단계에 대한 자세한 내용은 Wang et al.13을 참조하십시오.
    1. 2-5 % 이소 플루 란 흡입 상태에서 뼈 랜드 마크에 해당하는 면도 한 피부에 컬러 반구형 마커 (직경 3mm)를 부착하십시오. 매우 깊은 마취를 방지하기 위해 이소 플루 란 수준을 가능한 한 낮게 유지하십시오.
    2. 랜드마크가 전방 상장골 척추(ASIS), 대관절(고관절), 무릎 관절(무릎), 외측 망치(발목) 및 제5 중족지절관절(MTP)21인지 확인합니다.
      알림: 발가락의 각도가 필요한 경우 발가락 끝을 칠하십시오. 유성 페인트 마커를 사용하십시오( 재료 표 참조). 액체 접착제는 액체 형태가 더 빨리 건조되기 때문에 접착제에 바람직합니다.

3. 캡처 된 비디오를 사용한 마커 추적

  1. MotionRecorder 앱(재료 표 참조)을 열고 런닝머신을 켭니다. 트레드밀 벨트에 쥐를 놓습니다.
    알림: 비디오 캡처용 카메라 4대( 재료 표 참조)는 트레드밀의 긴 가장자리를 따라 배치됩니다: 각 가장자리에 약 50cm x 50cm 간격으로 트레드밀 벨트 영역의 중앙을 향하는 두 대의 카메라.
  2. 벨트 속도를 최대 20cm/s까지 높입니다. 쥐가 원하는 속도로 정상적으로 걷기 시작하면 녹화 아이콘을 클릭하여 비디오 캡처를 시작합니다. 충분한 단계(연속 5단계, 바람직하게는 10단계)가 확보되면 기록 아이콘을 다시 클릭하여 캡처를 중지합니다.
    참고: 한 번의 실험으로 여러 동물에 대한 데이터를 캡처합니다. 각 쥐에 대해 최대 5 번 시도하십시오. 쥐가 걷지 않으면 다른 쥐를 잡아서 나중에 첫 번째 쥐를 시도하십시오. 카메라의 캡처 속도는 120 프레임 / s였습니다.
  3. 3DCalculator 앱(재료 표 참조)과 분석할 비디오 파일을 엽니다.
  4. 충분한 수의 연속 단계를 포함하도록 상단의 가로 슬라이더 막대를 조정하여 비디오를 자릅니다. 노란색 슬라이드 바의 끝 끝 아이콘을 드래그하여 캡처한 이미지가 변경됩니다.
  5. 마커를 캡처하려면 스틱 그림 모델에서 마커 범례를 클릭하고 캡처된 비디오의 해당 마커로 드래그한 다음 버튼을 놓아 마커 범례 를 선택합니다. 이 프로세스는 스틱 그림의 마커 범례에 마커의 색상을 할당합니다. 추적할 모든 마커에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
  6. 자동 추적 아이콘을 클릭합니다. 시스템이 마커를 정확하게 추적하지 못하거나 마커 손실로 인해 추적 프로세스가 중단되면 수동 모드로 전환하십시오.
    참고: 이 자동 프로세스는 마커가 누락되지 않는 한 중지되지 않습니다. 몇 프레임마다 정지가 더 자주 발생하면 손실된 마커의 위치를 변경하는 것이 좋습니다.
  7. 수동 모드가 필요한 경우 수동 아이콘을 클릭하여 전환합니다. 스틱 사진에서 누락된 마커 범례 와 비디오에서 해당 마커를 클릭합니다. 비디오는 수동 모드에서 클릭할 때마다 한 프레임씩 진행됩니다.
    참고: 마커를 추적(디지털화)하는 사람들의 피로를 방지하기 위해 자동 클릭을 가능하게 하는 무료로 제공되는 앱을 활용하십시오( 재료 표 참조).

4. 원하는 파라미터 계산

  1. KineAnalyzer 앱(재료 표 참조)을 열고 파일을 로드합니다.
  2. 마커 마스터 보기 > 편집 메뉴로 이동합니다. "마커 마스터 편집" 창이 열립니다.
    참고: 캡처된 마커는 레이블이 지정될 때까지 간단한 숫자를 갖습니다.
  3. 마커 탭에서 원하는 레이블 (랜드 마크)을 클릭 한 다음 원하는 색상을 클릭하십시오. 이 프로세스는 각 마커를 특정 랜드마크로 지정합니다.
  4. 링크 탭으로 이동합니다. 두 개의 마커를 연속적으로 클릭하여 선을 만듭니다. 이 프로세스는 레이블이 지정된 마커를 사용하여 각 팔다리에 해당하는 선을 만듭니다.
  5. Color 열에서 원하는 색상을 선택하여 생성된 선에 색상을 할당합니다.
  6. 각도의 참조/이동선과 방향을 지정하여 각도를 정의합니다. 각도 탭으로 이동합니다. 각도의 이름을 지정한 후 각 랜드마크에 해당하는 마커를 클릭하여 벡터 A(기준선)와 벡터 B(이동선)를 할당합니다. 그런 다음 동일한 탭의 작업 섹션에서 값으로 각도의 방향을 정의합니다.
    참고 : 본 연구에서 주로 초점을 맞춘 매개 변수는 자세 단계 (중간 자세)의 중간에있었습니다 : KSt (무릎 각도), ASt (발목 각도), MHD (중족골 엉덩이 거리 : 엉덩이 높이와 동일, 다음 섹션 참조). 무릎 각도와 발목 각도는 각각 대퇴골과 경골, 경골과 다섯 번째 중족골의 각도로 정의되었습니다. 0° 각도는 조인트가 완전히 구부러졌음을 의미합니다.
  7. 거리 탭에서 거리 매개변수(MHD)를 정의합니다. 거리 설정 섹션에서 두 개의 해당 마커를 선택합니다. 정규화된 스텝 사이클의 함수로서의 조인트 궤적도 사용할 수 있습니다.
    참고: 각도/매개변수 정의는 한 번만 수행하면 됩니다. 매개변수 설정은 이 정의 프로세스가 완료되면 나중에 평가할 수 있습니다.

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결과

12마리의 동물을 두 그룹 중 하나에 무작위로 배정하였다: 언로딩 그룹 (UL, n=6) 또는 대조군 (Ctrl, n=6). UL 그룹의 경우, 동물의 뒷다리는 2 주 (UL 기간) 동안 꼬리에 의해 하역 된 반면, Ctrl 그룹 동물은 자유롭게 남겨 두었습니다. 하역 2주 후, UL 군은 Ctrl 군과 비교하여 뚜렷한 보행 패턴을 보였다. 그림 1은 대표 피험자의 정규화 된 관절 궤적을 보여줍니다. 자세 단계에서 UL 그?...

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토론

환경의 변화는 운동 시스템26,27의 기능적 측면과 근골격계 구성 요소의 변동을 초래합니다. 수축 구조 또는 환경의 수차는 기능적 능력에 영향을 미칠 수 있으며 기계적/환경적 왜곡을 해결한 후에도 지속됩니다19. 객관적인 동작 분석은 이러한 기능적 능력을 정량적으로 측정하는 데 도움이 됩니다. 위에서 볼 수 있듯이 비디오 분석?...

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공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 일본 과학 진흥회 (JSPS) KAKENHI (No. 18H03129, 21K19709, 21H03302, 15K10441)와 일본 의학 연구 개발기구 (AMED) (No. 15bk0104037h0002)의 일부 지원을 받았다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive TapeNICHIBAN CO.,LTD.SEHA25FAdhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading
Anesthetic Apparatus for Small AnimalsSHINANO MFG CO.,LTD.SN-487-0T
Auto clickerN.A.N.A.free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker)
CCD CameraTeledyne FLIR LLCGRAS-03K2C-CCCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture
Cotton ThreadN.A.N.A.Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage
ISOFLURANE Inhalation SolutionPfizer Japan Inc.(01)14987114133400
Joint markerTOKYO MARUI Co., Ltd0.12g BB6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification
Kine AnalyzerKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Software for analysis
Konishi Aron AlphaTOAGOSEI CO.,LTD.#31204Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats
Motion RecorderKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Software for video recording
Paint MarkerMITSUBISHI PENCIL CO., LTDPX-21.13Oil based paint marker to mark toes of animals
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals)KISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/)
Three-dimensional(3D) CalculatorKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.Software fo marker tracking
TreadmillMUROMACHI KIKAI CO.,LTDMK-685Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit
Wistar Rats (male, 7-week old)N.A.N.A.Commercially available at experimental animal sources

참고문헌

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