Compreensão abrangente da alteração da marcha induzida pela inatividade em roedores

Resumo

O presente protocolo descreve o rastreamento/avaliação de movimento tridimensional para descrever a alteração do movimento da marcha de ratos após a exposição a um ambiente simulado de desuso.

Resumo

É sabido que o desuso afeta sistemas neurais e que os movimentos articulares se alteram; no entanto, quais resultados exibem adequadamente essas características ainda não está claro. O presente estudo descreve uma abordagem de análise de movimento que utiliza a reconstrução tridimensional (3D) a partir de capturas de vídeo. Utilizando essa tecnologia, alterações desuso evocadas de performances ambulantes foram observadas em roedores expostos a um ambiente simulado de microgravidade, descarregando sua barra traseira pela cauda. Após 2 semanas de descarga, os ratos caminharam em uma esteira, e seus movimentos de marcha foram capturados com quatro câmeras de dispositivo acoplado por carga (CCD). Os perfis de movimento 3D foram reconstruídos e comparados aos dos sujeitos de controle que utilizam o software de processamento de imagens. As medidas de desfecho reconstruídas retrataram com sucesso aspectos distintos do movimento de marcha distorcida: hiperextensão das articulações do joelho e tornozelo e maior posição das articulações do quadril durante a fase de postura. A análise de movimento é útil por várias razões. Primeiro, permite avaliações comportamentais quantitativas em vez de observações subjetivas (por exemplo, passar/falhar em determinadas tarefas). Em segundo lugar, vários parâmetros podem ser extraídos para atender a necessidades específicas uma vez que os conjuntos de dados fundamentais são obtidos. Apesar dos obstáculos para uma aplicação mais ampla, as desvantagens desse método, incluindo intensidade e custo do trabalho, podem ser aliviadas pela determinação de medições abrangentes e procedimentos experimentais.

Introdução

A falta de atividade física ou desuso leva à deterioração dos efeitos locomotores, como atrofia muscular e perda óssea¹ e descondicionamento do corpo^{inteiro 2}. Além disso, recentemente foi notado que a inatividade afeta não apenas aspectos estruturais dos componentes musculoesqueléticos, mas também aspectos qualitativos do movimento. Por exemplo, as posições dos membros dos ratos expostos a um ambiente simulado de microgravidade eram diferentes das de animais intactos mesmo 1 mês após o término da intervenção^{de 3,4}. No entanto, pouco foi relatado sobre os déficits de movimento causados pela inatividade. Além disso, as características de movimento abrangentes das deteriorações não foram totalmente determinadas.

O protocolo atual demonstra e discute a aplicação da avaliação cinemática para visualizar alterações de movimento, referindo-se a déficits de movimento de marcha evocados por meio de desuso em ratos submetidos ao descarregamento de calamidade posterior.

Foi demonstrado que hiperextensões de membros em caminhadas após um ambiente simulado de microgravidade são observadas tanto em humanos⁵ quanto em animais 4,6,7,8. Portanto, para a universalidade, focamos em parâmetros gerais neste estudo: ângulos das articulações do joelho e tornozelo e distância vertical entre a articulação metatarsofalangeal e o quadril (aproximadamente equivalente à altura do quadril) no ponto médio da fase de postura (midance). Além disso, potenciais aplicações de avaliação cinemática em vídeo são sugeridas na discussão.

Uma série de análises cinemáticas pode ser uma medida eficaz para avaliar aspectos funcionais do controle neural. No entanto, embora as análises de movimento tenham sido desenvolvidas a partir da observação da pegada ou da medição simples em vídeo capturado ^9,10 a múltiplos sistemas de câmera^11,12, métodos e parâmetros universais ainda estão para ser estabelecidos. O método deste estudo destina-se a fornecer esta análise de movimento conjunto com parâmetros abrangentes.

No trabalho anterior¹³, tentamos ilustrar alterações de marcha em ratos modelo de lesão nervosa usando análise de vídeo abrangente. No entanto, em geral, os resultados potenciais das análises de movimento são muitas vezes restritos a variáveis predeterminadas fornecidas nos quadros de análise. Por essa razão, o presente estudo detalhou ainda mais como incorporar parâmetros definidos pelo usuário que são amplamente aplicáveis. Avaliações cinemáticas utilizando análises de vídeo podem ser de uso posterior se os parâmetros adequados forem implementados.

Protocolo

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê Experimental Animal da Universidade de Kyoto (Med Kyo 14033) e realizado em conformidade com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8ª Edição). Ratos Wistar machos de 7 semanas foram usados para o presente estudo. Um esquema representando a sequência de procedimentos está previsto no Arquivo Complementar 1.

1. Familiarizando ratos com caminhada na esteira

NOTA: Consulte o relatório publicado anteriormente¹³ para obter detalhes sobre o procedimento.

1. Coloque o rato em uma esteira projetada para roedores (ver Tabela de Materiais). Na primeira sessão, permita que o animal explore a esteira para se acostumar com o meio ambiente.
   NOTA: Este processo leva aproximadamente 5 minutos.
2. Aumente gradualmente a velocidade da correia para o nível desejado (20 cm/s) e caminhe o rato. Use um choque elétrico no final da esteira, se necessário¹⁴.
   NOTA: Uma sessão de caminhada dura aproximadamente 10-20 min.
3. Repita este processo a cada dois dias durante uma semana ou mais frequentemente se necessário 15,16,17.
   NOTA: Inicie o período de familiarização 1 semana antes da etapa 2.
4. Mantenha os ratos em grupos em gaiolas (2-3 ratos em cada gaiola) com um ciclo claro-escuro de 12 horas. Fornecer comida e água ad libitum.

2. Aplicação de descarga de subida traseira aos ratos e instalação de marcadores conjuntos

NOTA: Eleve as plataformas traseiras do rato usando rosca e fita adesiva anexadas à cauda, conforme descrito nos relatórios anteriores 18,19,20. Certifique-se de que o fio e a fita estão presos na base da cauda para evitar o deslizamento da pele da cauda. Monitore bem os animais e ajuste a altura de descarga ou o aperto da fita, se necessário.

1. Sob 2-5% de inalação de isoflurane com uma máscara anestésica, enrole a primeira metade de uma tira de 30 cm de comprimento de fita adesiva ao redor da porção proximal da cauda do rato.
2. Dobre uma linha de algodão de 1 m de comprimento (fio de cozinha de algodão, aproximadamente 1 mm de diâmetro) ao meio. Faça um loop amarrando um nó no ponto médio dobrado de 50 cm. O nó deve estar a aproximadamente 5 cm da ponta para deixar um laço de circunferência de 10 cm.
3. Deixe que os 15 cm restantes da fita adesiva passem uma vez pelo laço da rosca para fixar a fita. Enrole a fita restante ao redor da porção distal da cauda.
4. Fixar a outra ponta do fio na plataforma aérea da gaiola. Mantenha os animais em uma gaiola alta o suficiente para elevar seus traseiros por suas caudas. Além do descarregamento, forneça o mesmo ambiente que os do grupo Ctrl, como comida, água e cama.
5. Configure os marcadores e softwares conjuntos (ver Tabela de Materiais) seguindo as etapas abaixo.
   NOTA: Para obter detalhes sobre esta etapa, consulte Wang et ^al.13.
   1. Sob 2-5% de inalação de isoflurane, conecte marcadores semiesféricos coloridos (3 mm de diâmetro) à pele raspada correspondente a marcos ósseos. Mantenha o nível isoflurane o mais baixo possível para evitar anestesia muito profunda.
   2. Certifique-se de que os marcos são a coluna ilícía anterior superior (ASIS), trochanter maior (articulação do quadril), articulação do joelho (joelho), maleeolus lateral (tornozelo) e quinta articulação metatarsofalangeal (MTP)²¹.
      NOTA: Pinte a ponta do dedo do dedo se for necessário o ângulo do dedo do dedo do sul. Use um marcador de tinta à base de óleo (ver Tabela de Materiais). A cola líquida é preferível para adesivo, uma vez que a forma líquida seca mais rápido.

3. Rastreamento de marcadores usando vídeos capturados

1. Abra o aplicativo MotionRecorder (ver Tabela de Materiais) e ligue a esteira. Coloque o rato na correia da esteira.
   NOTA: As quatro câmeras para captura de vídeo (ver Tabela de Materiais) são dispostas ao longo das longas bordas da esteira: duas câmeras em cada borda, aproximadamente 50 cm x 50 cm de distância, voltadas para o centro da área do cinto da esteira.
2. Aumente a velocidade da correia até 20 cm/s. À medida que o rato começa a andar normalmente na velocidade desejada, clique no ícone Gravar para iniciar a captura de vídeo. Uma vez que sejam obtidos passos suficientes (5 passos consecutivos, de preferência 10 passos), pare a captura clicando novamente no ícone Gravar .
   NOTA: Capture dados sobre vários animais em um experimento. Tente até cinco vezes para cada rato. Se um rato não anda, capture um diferente e tente o primeiro depois. A taxa de captura da câmera foi de 120 quadros/s.
3. Abra o aplicativo 3DCalculator (ver Tabela de Materiais) e o arquivo de vídeo a ser analisado.
4. Corte o vídeo ajustando a barra de controle deslizante horizontal na parte superior para conter números suficientes de passos consecutivos. A imagem capturada muda arrastando os ícones de ponta final da barra de slides amarelas.
5. Para capturar os marcadores, selecione as lendas do marcador clicando nas lendas do marcador no modelo de imagem de vara, arrastando-os para o marcador correspondente no vídeo capturado e liberando o botão. Este processo aloca a cor do marcador para a legenda do marcador na imagem do bastão. Repita este processo para que cada marcador seja rastreado.
6. Clique no ícone de rastreamento automático . Se o sistema não rastrear com precisão marcadores ou o processo de rastreamento parar devido à perda do marcador, mude para o modo manual.
   NOTA: Este processo automático não para a menos que os marcadores sejam perdidos. Se as paradas acontecerem com mais frequência do que todos os poucos quadros, considere reposicionar os marcadores perdidos.
7. Se for necessário o modo manual, clique no ícone Manual para alternar. Clique na legenda do marcador ausente na imagem da vara e no marcador correspondente no vídeo. O vídeo prossegue com um quadro para cada clique no modo manual.
   NOTA: Utilize aplicativos disponíveis gratuitamente que permitem clicar automaticamente para evitar a fadiga daqueles que rastreiam (digitalizar) os marcadores (ver Tabela de Materiais).

4. Computação dos parâmetros desejados

1. Abra o aplicativo KineAnalyzer (ver Tabela de Materiais) e carregue o arquivo.
2. Vá para o menu Ver > Editar marcador master . Ele abre a janela "Marcador mestre editar".
   NOTA: Os marcadores capturados têm números simples até serem rotulados.
3. Clique no rótulo desejado (marco) na guia marcador e clique na cor desejada. Este processo designa cada marcador para um marco específico.
4. Vá para a guia de link . Crie linhas clicando em dois marcadores consecutivamente. Este processo cria linhas que correspondem a cada membro usando marcadores rotulados.
5. Atribua cores às linhas criadas selecionando a cor desejada na coluna Cor .
6. Defina ângulos atribuindo linhas de referência/movimento e direções dos ângulos. Vá para a guia de ângulo . Após nomear o ângulo, atribua Vector A (linha de referência) e Vetor B (linha móvel) clicando nos marcadores correspondentes a cada marco. Em seguida, defina a direção do ângulo com um valor na seção de operação na mesma guia.
   NOTA: Para o presente estudo, os parâmetros focados principalmente estavam no meio da fase de postura (midance): KSt (ângulo do joelho), ASt (ângulo do tornozelo), MHD (distância do quadril metatarso: equivalente à altura do quadril, ver a próxima seção). O ângulo do joelho e o ângulo do tornozelo foram definidos como o ângulo entre o fêmur e a tíbia e a tíbia e o quinto osso metatarso, respectivamente. Um ângulo de 0° significa que a articulação estava totalmente flexionada.
7. Na guia de distância , defina o parâmetro de distância (MHD). Selecione dois marcadores correspondentes na seção Configuração de distância . Trajetórias conjuntas em função do ciclo de passo normalizado também estarão disponíveis.
   NOTA: A definição de ângulos/parâmetros precisa ser realizada apenas uma vez. As configurações dos parâmetros estarão disponíveis para avaliações posteriores assim que este processo de definição for concluído.

Resultados

12 animais foram aleatoriamente atribuídos a um dos dois grupos: o grupo de descarga (UL, n = 6) ou o grupo controle (Ctrl, n = 6). Para o grupo UL, as barras traseiras dos animais foram descarregadas pela cauda por 2 semanas (período UL), enquanto os animais do grupo Ctrl foram deixados livres. 2 semanas após o descarregamento, o grupo UL mostrou um padrão de marcha distinto em comparação com o grupo Ctrl. A Figura 1 mostra trajetórias conjuntas normalizadas de sujeitos representativ...

Discussão

A alteração dos ambientes leva a aspectos funcionais flutuantes e componentes musculoesqueléticos dos sistemas locomotor^26,27. Aberrações em estruturas ou ambientes contractíuos podem afetar as habilidades funcionais, persistindo mesmo após a resolução de distorções mecânicas/ambientais¹⁹. A análise objetiva do movimento ajuda a medir essas habilidades funcionais quantitativamente. Como mostrado acima, a análise de vídeo é ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive Tape	NICHIBAN CO.,LTD.	SEHA25F	Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Auto clicker	N.A.	N.A.	free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker)
CCD Camera	Teledyne FLIR LLC	GRAS-03K2C-C	CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture
Cotton Thread	N.A.	N.A.	Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
Joint marker	TOKYO MARUI Co., Ltd	0.12g BB	6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification
Kine Analyzer	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software for analysis
Konishi Aron Alpha	TOAGOSEI CO.,LTD.	#31204	Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats
Motion Recorder	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software for video recording
Paint Marker	MITSUBISHI PENCIL CO., LTD	PX-21.13	Oil based paint marker to mark toes of animals
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals)	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/)
Three-dimensional(3D) Calculator	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	Software fo marker tracking
Treadmill	MUROMACHI KIKAI CO.,LTD	MK-685	Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit
Wistar Rats (male, 7-week old)	N.A.	N.A.	Commercially available at experimental animal sources