הקמת מודל חולדות פשוט ויעיל להדמיית בלוטת יותרת התריס תוך ניתוחית

Summary

נכון להיום, הפיתוח של שיטות זיהוי בלוטת יותרת התריס (PG) מוגבל על ידי היעדר מודלים של בעלי חיים במחקר פרה-קליני. כאן, אנו מקימים מודל חולדות פשוט ויעיל להדמיית PG תוך ניתוחית ומעריכים את יעילותו על ידי שימוש בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל כחומר ניגוד PG חדשני.

Abstract

זיהוי בלוטת יותרת התריס (PG) הוא צורך קריטי שלא נענה בכריתת בלוטת התריס. זיהוי PG מאתגר בניתוח בלוטת התריס מכיוון שהוא דומה בצבעו לבלוטת התריס. היעדר מודלים יעילים של בעלי חיים במחקר פרה-קליני מהווה מגבלה חמורה לפיתוח טכניקות זיהוי PG. פרוטוקול זה מאפשר הקמת מודל חולדות פשוט ויעיל לזיהוי PG. במודל זה, ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל שחורה (IONPs) מוזרקים באופן מקומי לבלוטת התריס ומתפזרים במהירות בתוך בלוטת התריס אך לא PG. PG מוכתם באופן שלילי ובלוטת תריס מוכתמת באופן חיובי ניתנים לזיהוי בקלות בעין בלתי ללא צורך במיקרוסקופ חיצוני. ניתן לזהות את המיקום של PG על ידי הגדלת ניגודיות הצבעים בין בלוטת התריס לבין PG, בהתבסס על הצבע של IONPs שחור. דגם חולדה זה הוא זול ונוח לזיהוי PG, וה-IONPs הם חומר ניגוד PG חדשני.

Introduction

בלוטת יותרת התריס (PG) היא בלוטות אנדוקריניות קטנות בצורת אליפסה הממוקמות בצווארם של בני אדם ובעלי חוליות אחרים, המייצרות ומפרישות הורמוני יותרת התריס כדי לווסת ולאזן את רמות הסידן והזרחן בדם ובעצמות¹. לבני אדם יש בדרך כלל שני זוגות של PG הממוקמים מאחורי אונות בלוטת התריס במיקומים משתנים; גודל PG אנושי בדרך כלל מודד 6 מ"מ x 4 מ"מ x 2 מ"מ, עם משקל של כ 35-40 מ"ג². הסרה או נזק של PG גורם hypoparathyroidism (HP), הפרעה אנדוקרינית המאופיינת hypocalcemia ורמות נמוכות או בלתי ניתנות לגילוי של הורמוני יותרת התריס, אשר גורמים למגוון רחב של תסמינים, החל התכווצויות כמו התכווצויות, שיניים מעוותות למחלות כליות כרוניות. חלק מהסיבוכים הללו הם קטלניים (למשל, אי ספיקת לב ופרכוסים)^3,4,5; לפיכך, PG חיוני בוויסות חילוף החומרים של הגוף ובקיום החיים.

HP הוא אחד הסיבוכים השכיחים ביותר לאחר ניתוח צוואר קדמי, במיוחד בכריתת בלוטת התריס, טיפול מרפא מבוסס היטב לסרטן בלוטת התריס, שהוא הסרטן האנדוקריני הנפוץ ביותר בעולם ^6,7. לאחר כריתת בלוטת התריס HP נגרמת בעיקר על ידי טראומה ישירה, איסכמיה, או הסרת PG בניתוח בגלל חוסר יכולת חמור להבחין באופן אמין PG מאונות בלוטת התריס ורקמות אחרות שמסביב (למשל, בלוטות לימפה וחלקיקי שומן היקפי) בזמן אמת בחדר הניתוח. בשנת 2021, Barrios et al. דיווחו על שיעור ממוצע של חתך שגוי PG של 22.4% בתוך 1,114 מקרים של כריתת בלוטת התריס, ואפילו מנתחים מנוסים עם שיעור שגיאות מינימלי של 7.7%⁸. שיעורי PG שגויים כה גבוהים עולים בקנה אחד עם דוחות דומים אחרים 9,10,11. לפיכך, כריתת בלוטת התריס השגויה היא גורם סיכון עצמאי ל- HP, חולף וקבוע לאחר הניתוח.

פיתוח שיטות יעילות לזיהוי PG תוך ניתוחי טומן בחובו את המפתח לטיפול בצורך רפואי קריטי זה שלא נענה; עם זאת, היא הוגבלה מאוד על ידי היעדר מודלים של בעלי חיים במחקר פרה-קליני. עד כה, רוב חקירות זיהוי PG תוך ניתוחיות בוצעו על חולים אנושיים ובעלי חיים גדולים (למשל, כלבים)¹², שהם יקרים וקשים לקבלת אישור אתי, הרחבת מספרי הנבדקים ובדיקות חוזרות. בינתיים, לעכבר, מודל החוליות הנפוץ ביותר במחקר ביולוגי, יש PG קטן מאוד, עם גודל של פחות מ-1 מ"מ¹³. בשל מגבלה זו, דגמי PG של עכברים שימשו לעתים רחוקות במחקר זיהוי PG תוך ניתוחי.

מאמר זה מדווח על הקמת מודל חולדות פשוט, פשוט ויעיל למחקרי זיהוי PG תוך ניתוחיים. חקרנו את השימוש בחולדות מקומיות של Sprague-Dawley (SD) ללא כל שינויים כירורגיים או הנדסה גנטית כמודל אמין של בעלי חיים לבדיקת חומר ניגוד להדמיית PG, IONPs, בניתוח לכריתת בלוטת התריס. מודל החולדות הזה מדגים מבנה פיזיולוגי דומה מאוד של PG והמיקרו-סביבה הסובבת אותו לזה של בני אדם, והגודל של PG של חולדה גדול מספיק כדי שניתן יהיה להבחין בו חזותית בהשוואה לאלה של עכברים. לרוב החולדות יש PG אחד בכל צד של בלוטת התריס. הפשטות והיעילות של מודל חולדות זה הודגמו על ידי ביצוע הדמיית PG משופרת IONP תוך ניתוחית בניתוח לכריתת בלוטת התריס.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המכון לרפואה בסיסית וסרטן, האקדמיה הסינית למדעים. זהו ניתוח שאינו הישרדותי.

1. חיה

1. השתמש בנקבת חולדת SD בת 6-8 שבועות, במשקל 250 גרם, להדמיית PG תוך ניתוחית.

2. הרדמה

1. הפעל את מכונת ההרדמה.
2. לפני שמתחילים, יש לוודא שרמת האיזופלורן מלאה במכשיר אידוי ההרדמה. לאחר מכן, הפעל את החמצן והגדר את קצב הזרימה ל 0.4-0.8 ליטר / דקה. יש להשרות הרדמה עם 3-5% איזופלורן ולשמור על איזופלורן 2% (קצב זרימה: 0.4-0.8 ליטר/דקה).
3. הכניסו את חולדת ה-SD לקופסה של מכונת ההרדמה ובחרו את דגם התעלה כדי להתחיל בהרדמה של בעלי חיים.
4. שימו לב לפעילות החולדות בתיבה. כאשר החולדה נופלת לתרדמת, העבירו אותה לקונוס האף כדי לשמור על הרדמה (תנוחת שכיבה ללא הכרה ללא רפלקס כאב ורפלקס הקרנית).
5. השתמשו במסכת ההרדמה כדי לכסות את אפה של החולדה והעבירו את מכונת ההרדמה למצב מסכה כדי לשמור על בעל החיים תחת הרדמה במהלך הניתוח.

3. יציבה וקיבוע

1. העבירו את החולדה המורדמת על וילון כירורגי על שולחן ניתוחים. הניחו כרית חימום שחוממה מראש מתחת לבעל החיים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים במהלך הניתוח.
2. השתמשו בגומיות כדי לקבע את איברי החולדה לשולחן הניתוחים. הניחו כרית גלילית עשויה וילונות מתחת לכתפו של החולדה כדי להשעין את ראשה לאחור, ולחשוף לחלוטין את אזור הצוואר.
3. יש למרוח משחת דמעות מלאכותית על שתי עיני החולדה כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה.

4. הסרת שיער

1. יש למרוח קרם דפילטורי על אזור הצוואר: עד לחלל התת-לסתי, עד לתהליך הקסיפואיד, ומשני הצדדים לחלק החיצוני של שריר הסטרנוקלידומסטואיד.
2. לאחר 3 דקות, לנגב בעדינות את השיער ואת קרם depilatory עם טישו.

5. עיקור

1. השתמש כדור צמר גפן יודופור כדי לחטא את אזור הניתוח 3 פעמים מאמצע הצוואר לאזור שמסביב. יש לחטא רק את האזור שממנו הוסר השיער.

6. הנחת וילונות כירורגית

1. השתמש בוילון כירורגי כדי לכסות את אזור הניתוח של צוואר החולדה. שמור את החור של הווילון הכירורגי מיושר עם אזור החיטוי של החיה.

7. חתך

1. אשר את מישור הניתוח של ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס צביטת בוהן לפני ביצוע החתך. לאחר מכן, הכנס את הלהב לאזמל והשתמש באזמל כדי לבצע חתך אורכי בקו האמצע הקדמי של צוואר החולדה. יש לוודא שאורך החתך הוא כ-5 ס"מ ורק בדרמיס.

8. דיסקציה של רקמה תת עורית משריר צוואר הרחם הקדמי

1. הרימו את העור לאורך שני צידי החתך.
2. השתמש מספריים לחתוך לאורך לאורך linea alba cervicalis.
3. השתמש במלקחיים כדי להפריד את שריר הסטרומיואיד ואת שריר הסטרנותיוריד.

9. קבע את שרירי הצוואר הקדמיים לשני הצדדים

1. השתמש במלקחיים וסקולריים כדי להדק את שריר הסטרנוהיואיד המופרד ואת שריר הסטרנותיוס לפני הצוואר ולמשוך את הרקמה המהודקת החוצה.
2. השתמש במשחזר או במחט כדי להעביר את התפר (3-0#) דרך הרקמה המהודקת, צור קשר וקיבע את התפר לווילון הכירורגי של שולחן הניתוחים.

10. לוקליזציה של בלוטת התריס

1. אתר את סחוס בלוטת התריס ואת הסחוס הקריקואיד כגבול העליון באזור הניתוח. זהה את הסחוס של בלוטת התריס בהתבסס על צורת המגן שלו ואת הסחוס הקריקואיד בהתבסס על צורת הטבעת שלו.
2. אתר את קנה הנשימה כגבול התחתון באזור הניתוח. חפשו את קנה הנשימה בחלק הקדמי והאמצעי של הצוואר, בהתבסס על צורת טבעת הסחוס הצינורית שלו.
3. אתר את בלוטת התריס בין הגבול העליון לגבול התחתון - בלוטה אדומה בצורת פרפר בצד הנגדי של קנה הנשימה.

11. זיהוי חזותי של PG

1. אתר את PG בצד העליון והחיצוני של בלוטת התריס. חפשו שני PG בצורת פיוזיפורם באורך של כ-1.2-2 מ"מ וברוחב של 1.0-1.5 מ"מ שהם אדמדמים אך בהירים יותר מבלוטת התריס שמסביב עם גבול מסוים.
2. צלם תמונה קדמית של PG עם קנה הנשימה, בלוטת התריס והגרון כדי להשוות כמותית את ההשפעות של IONP לפני ואחרי ההזרקה.
3. נתחו את החלק האחורי של הוושט, ולאחר מכן השתמשו במשענת כדי לחשוף את הצד הימני של ה-PG. צלם תמונה בצד ימין של PG עם בלוטת התריס וקנה הנשימה.
4. החליפו את המשענת כדי לחשוף את הצד הנגדי של ה-PG וצלמו אותם בצד שמאל עם בלוטת התריס וקנה הנשימה.

12. הזרקת בלוטת התריס של IONPs

1. השתמש מזרק אינסולין כדי להזריק באופן מקומי 10 μL של תרחיף IONPs (20 מ"ג / מ"ל במי מלח חוצצים פוספט) למרכז בלוטת התריס. לחץ בעדינות על אתר ההזרקה עם גזה במשך 5 שניות.

13. זיהוי PG לאחר הזרקת IONPs

1. לאחר ההזרקה, שימו לב לדיפוזיה המהירה של ה-IONPs בתוך בלוטות התריס אך לא ל-PG, מכיוון שהיא מכתימה לרעה את ה-PG ומבדילה אותם מבלוטת התריס שמסביב.
2. צלם תמונה קדמית של PG המוכתם באופן שלילי יחד עם קנה הנשימה, בלוטת התריס והגרון.
3. צלם תמונות בצד שמאל ובצד ימין של PG המוכתם באופן שלילי באמצעות אותם הליכים שהוזכרו לעיל.

14. כריתה של הגרון וקנה הנשימה עם בלוטת התריס ו- PG

1. לאחר שהחולדות שאפו עודף איזופלורן (5% איזופלורן במשך יותר מ-5 דקות) ונמצאות תחת הרדמה עמוקה, הרדימו אותן על ידי הזרקה תוך לבבית של 0.5 מ"ל של תמיסת אשלגן כלורי רווי.
2. לאחר המוות, להסיר את הגרון, קנה הנשימה, בלוטת התריס, PG.
3. מתחת למכסה אדים, הניחו את דגימות הגרון, קנה הנשימה, בלוטת התריס ו-PG שהוסרו בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות.

15. לימודי היסטופתולוגיה

1. לייבש את הרקמות ולהטביע אותם פרפין. פורסים לחלקים בעובי 5 מיקרומטר. אופים את הנתחים ב-37°C בתנור למשך לילה וב-65°C למשך שעה.
2. הכתימו את המקטעים עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) לאחר שטיפה 3X5 דקות עם 75%, 95%, 100% אלכוהול הדרגתי ושטיפה במים בטמפרטורת החדר.
3. בקש מפתולוגים לבחון את החלקים המוכתמים ב- H&E תחת מיקרוסקופ אור.

תוצאות

במודל זה של בעלי חיים, חתכנו בניתוח את צווארה של חולדת SD כדי לחשוף את קנה הנשימה, הגרון והרקמות שמסביב. לאחר מכן, בלוטת התריס הייתה ממוקמת חזותית משני צידי קנה הנשימה; הוא בצורת פרפר וגודלו כ-3 מ"מ x 5 מ"מ. זוג PG ממוקמים בדרך כלל בחלק העליון של בלוטת התריס, וצבעם דומה מאוד לזה של אונות בלוטת התריס...

Discussion

אנו מדגימים טכניקת הדמיה שלילית מונחית IONPs של PG חולדה באמצעות IONPs שחורים, אשר הוזרקו מקומית במרכז בלוטת התריס ופוזרו בתוך בלוטת התריס אך לא PG. הוא מאפשר זיהוי ברור של PG בעיניים בלתי ללא סיוע של מיקרוסקופ כלשהו. למרות שעכברים טרנסגניים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק מבוטא באופן סלקטיבי ב-PG דווחו

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
alcohol	Li feng	9400820067
anesthesia machine	RWD Company	R520IE	Machine number
blade	Daopian	TB-JZ-10#
cylindrical pillow			made by ourselves
depilatory cream	Nair	TMG-001
electronic scale	Hong xingda	CN-HXD2
eosin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-2
erythromycin	Shuang ji (Beijing, China)	200409
gauze	Fulanns	YY0331-2006
heating pad	Johon (ShenZhen,China)	JH-36-2006
hematoxylin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-1
insulin injection needle	Jiangyin NanquanMacromolecule	20170702
iodophor cotton ball	HOYON	19-6007
iron oxide nanoparticle solution	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag9110-05
isoflurane	Sigma Aldrich (St Louis USA).	21112801
needle holder	Meijun	MH0587
operation table	BioJane	BJ-P-M
paraformaldehyde solution	Biosharp	21269333
rubber	G-CLONE	XT41050
scanning machine	Olympus	Slideview VS200
surgical forceps	Suping	SPHC-0676
surgical knife handle	Aladdin	S3052-06-1EA
surgical retractor	TOCYTO	18-4010
surgical scissors	Suping	SPHC-0795
surgical towel	Along technology	YCKJ-RJ-036205
suture	Ethicon	SA84G
suture with needle	Jinhuan (Shanghai,China)	F301
vascular forceps	Along technology	YCKJ-RJ-016218
Water Bath-Slide Drier	Hua su (Jinhua, China)	HS-1145