Создание простой и эффективной модели крыс для интраоперационной визуализации паращитовидных желез

Резюме

На сегодняшний день развитие методов идентификации паращитовидных желез (ПГ) ограничено отсутствием животных моделей в доклинических исследованиях. Здесь мы устанавливаем простую и эффективную модель крыс для интраоперационной визуализации ПГ и оцениваем ее эффективность, используя наночастицы оксида железа в качестве нового контрастного агента ПГ.

Аннотация

Идентификация паращитовидной железы (ПГ) является критической неудовлетворенной потребностью в тиреоидэктомии. Идентификация ПГ является сложной задачей в хирургии щитовидной железы, поскольку она похожа по цвету на щитовидную железу. Отсутствие эффективных моделей на животных в доклинических исследованиях является серьезным ограничением для развития методов идентификации ПГ. Этот протокол позволяет создать простую и эффективную модель крыс для идентификации ПГ. В этой модели наночастицы черного оксида железа (ИОНП) вводятся локально в щитовидную железу и быстро диффундируют внутри щитовидной железы, но не ПГ. Отрицательно окрашенная ПГ и положительно окрашенная щитовидная железа могут быть легко идентифицированы невооруженным глазом, не требуя внешних микроскопов. Положение ПГ может быть идентифицировано путем увеличения цветового контраста между щитовидной железой и ПГ, основываясь на цвете черных ИОНП. Эта модель крыс является недорогой и удобной для идентификации PG, а IONP являются новым контрастным веществом PG.

Введение

Паращитовидная железа (ПГ) представляет собой небольшие эндокринные железы овальной формы, расположенные на шее человека и других позвоночных, которые производят и секретируют паратиреоидные гормоны для регулирования и балансировки уровня кальция и фосфора в крови и в костях¹. У людей обычно есть две пары ПГ, расположенные за долями щитовидной железы в переменных местах; размер человеческой ПГ обычно составляет 6 мм х 4 мм х 2 мм, при весе примерно 35-40 мг². Удаление или повреждение ПГ вызывает гипопаратиреоз (НР), эндокринное расстройство, характеризующееся гипокальциемией и низкими или неопределяемыми уровнями паратиреоидных гормонов, которые вызывают широкий спектр симптомов от спазмоподобных спазмов до деформированных зубов и хронических заболеваний почек. Некоторые из этих осложнений являются фатальными (например, сердечная недостаточность и судороги)^3,4,5; таким образом, ПГ имеет важное значение для регулирования метаболизма организма и поддержания жизни.

HP является одним из наиболее распространенных осложнений после операции на передней части шеи, особенно при тиреоидэктомии, хорошо зарекомендовавшем себя лечебном лечении рака щитовидной железы, который является наиболее распространенным эндокринным раком во всем мире ^6,7. Посттиреоидэктомия HP преимущественно вызвана прямой травмой, ишемией или удалением PG в хирургии из-за серьезной неспособности надежно различать PG от долей щитовидной железы и других окружающих тканей (например, лимфатических узлов и периферических жировых частиц) в режиме реального времени в операционной. В 2021 году Barrios et al. сообщили о среднем уровне неправильного сечения ПГ в 22,4% в 1 114 случаях тиреоидэктомии и даже о опытных хирургах, у которых минимальная частота ошибок составляла 7,7%⁸. Такие высокие показатели расхождений в ПГ согласуются с другими аналогичными отчетами ^9,10,11. Таким образом, неправильная паратиреоидэктомия является самостоятельным фактором риска транзиторной и постоянной послеоперационной НР.

Разработка эффективных интраоперационных методов идентификации ПГ является ключом к удовлетворению этой критической неудовлетворенной медицинской потребности; однако он был серьезно ограничен отсутствием моделей на животных в доклинических исследованиях. На сегодняшний день большинство интраоперационных исследований идентификации ПГ были проведены на людях и крупных животных (например, собаках)¹², которые являются дорогостоящими и трудными для получения этического одобрения, расширения числа субъектов и повторных тестов. Между тем, мышь, наиболее часто используемая модель позвоночных в биологических исследованиях, имеет чрезвычайно маленький ПГ, размером менее 1 мм¹³. Из-за этого ограничения мышиные модели PG редко использовались в интраоперационных исследованиях идентификации PG.

В этой статье сообщается о создании простой, понятной и эффективной модели крыс для интраоперационных исследований идентификации ПГ. Мы исследовали использование местных крыс Sprague-Dawley (SD) без каких-либо хирургических модификаций или генной инженерии в качестве надежной модели на животных для тестирования контрастного вещества для визуализации PG, IONPs, в хирургии тиреоидэктомии. Эта модель крыс демонстрирует очень похожую физиологическую структуру ПГ и окружающей микросреды на человеческую, а размер ПГ крыс достаточно велик, чтобы его можно было визуально обнаружить по сравнению с размерами мышей. Большинство крыс имеют по одной ПГ с каждой стороны щитовидной железы. Простота и эффективность этой модели крыс были продемонстрированы путем выполнения интраоперационной визуализации ПГ с усилением IONP в хирургии тиреоидэктомии.

протокол

Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Института фундаментальной медицины и рака Китайской академии наук. Это операция, не связанная с выживанием.

1. Животное

1. Используйте 6-8-недельную самку SD-крысы весом 250 г для интраоперационной визуализации ПГ.

2. Анестезия

1. Включите аппарат для анестезии.
2. Перед началом убедитесь, что уровень изофлурана в испарителе анестезии заполнен. Затем включите кислород и установите расход на 0,4-0,8 л/мин. Индуцируют анестезию 3-5% изофлураном и поддерживают при 2% изофлуране (расход: 0,4-0,8 л/мин).
3. Поместите крысу SD в коробку анестезиологического аппарата и выберите модель Channel , чтобы начать анестезию животных.
4. Понаблюдайте за активностью крыс в коробке. Когда крыса впадет в кому, переместите ее к носовому конусу для поддержания анестезии (бессознательное положение лежа на спине без болевого рефлекса и рефлекса роговицы).
5. Используйте анестезиологическую маску, чтобы покрыть нос крысы и переключить анестезиологический аппарат в режим маски, чтобы держать животное под наркозом во время операции.

3. Осанка и фиксация

1. Перенесите обезболенную крысу на хирургическую драпировку на операционном столе. Поместите предварительно расплавленную грелку под животное, чтобы поддерживать температуру тела животного во время операции.
2. Используйте резинки, чтобы закрепить конечности крысы на операционном столе. Поместите цилиндрическую подушку из драпировки под плечо крысы, чтобы откинуть ее голову назад, полностью обнажив область шеи.
3. Нанесите искусственную слезную мазь на оба глаза крысы, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.

4. Эпиляция

1. Нанесите крем для депиляции на область шеи: до подчелюстного пространства, вплоть до мечевидного отростка и с обеих сторон наружу грудино-ключично-сосцевидной мышцы.
2. Через 3 мин аккуратно протрите волосы и крем для депиляции салфеткой.

5. Стерилизация

1. Используйте йодофорный ватный тампон для дезинфекции области операции 3 раза от середины шеи до окружающей области. Дезинфицируйте только область, с которой были удалены волосы.

6. Хирургическая укладка драпировки

1. Используйте хирургическую драпировку, чтобы покрыть операционную область шеи крысы. Держите отверстие хирургической драпировки выровненным с областью дезинфекции животного.

7. Разрез

1. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии через отсутствие рефлекса защемления пальца ноги перед тем, как сделать разрез. Затем поместите лезвие в скальпель и используйте скальпель, чтобы сделать продольный разрез в передней средней линии шеи крысы. Убедитесь, что длина разреза составляет примерно 5 см и только в дерме.

8. Рассечение подкожной клетчатки из передней шейной мышцы

1. Поднимите кожу по обеим сторонам разреза.
2. Используйте ножницы, чтобы продольно разрезать вдоль линии alba cervicalis.
3. Используйте щипцы, чтобы разделить грудиногиоидную мышцу и грудино-щитовидную мышцу.

9. Зафиксируйте передние мышцы шеи с обеих сторон

1. Используйте сосудистые щипцы, чтобы зажать отделенную грудиногиоидную мышцу и грудино-щитовидную мышцу перед шеей и вытянуть зажатую ткань наружу.
2. Используйте втягивающее устройство или иглу, чтобы пропустить шов (3-0#) через зажатую ткань, сделать узел и закрепить шов к хирургической драпировке операционного стола.

10. Локализация щитовидной железы

1. Найдите щитовидный хрящ и крикоидный хрящ в качестве верхней границы в области операции. Определите щитовидный хрящ на основе его формы щита и крикоидный хрящ на основе его кольцевой формы.
2. Найдите трахею как нижнюю границу в области операции. Ищите трахею в передней и средней части шеи, основываясь на ее трубчатой форме хрящевого кольца.
3. Расположите щитовидную железу между верхней и нижней границами — красную железу в форме бабочки на противоположной стороне трахеи.

11. Визуальная идентификация ПГ

1. Расположите ПГ на верхней и внешней сторонах щитовидной железы. Ищите две ПГ в веретенообразной форме около 1,2-2 мм в длину и 1,0-1,5 мм в ширину, которые красноваты, но легче, чем окружающая щитовидная железа с определенной границей.
2. Сделайте фронтальную фотографию ПГ с трахеей, щитовидной железой и гортанью, чтобы количественно сравнить эффекты IONP до и после инъекции.
3. Рассекните заднюю часть пищевода, затем используйте втягивающее устройство, чтобы обнажить правую сторону ПГ. Сделайте фотографию с правой стороны ПГ со щитовидной железой и трахеей.
4. Поменяйте местами втягивающее устройство, чтобы обнажить противоположную сторону ПГ, и сделайте их левую фотографию со щитовидной железой и трахеей.

12. Инъекция щитовидной железы ИОНП

1. Используйте инсулиновый шприц для местной инъекции 10 мкл суспензии IONPs (20 мг / мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе) в центр щитовидной железы. Аккуратно надавите на место инъекции марлей в течение 5 с.

13. Идентификация ПГ после инъекции ИОНП

1. После инъекции наблюдайте быструю диффузию ИОНП в щитовидной железе, но не ПГ, так как она отрицательно окрашивает ПГ и дифференцирует их от окружающей щитовидной железы.
2. Сделайте переднюю фотографию отрицательно окрашенного ПГ вместе с трахеей, щитовидной железой и гортанью.
3. Сделайте фотографии с левой и правой стороны отрицательно окрашенного ПГ, используя те же процедуры, что и упомянутые выше.

14. Резекция горла и трахеи со щитовидной железой и ПГ

1. После того, как крысы вдохнули избыток изофлурана (5% изофлурана в течение более 5 мин) и находятся под глубоким наркозом, усыпляют их путем внутрисердечной инъекции 0,5 мл насыщенного раствора хлорида калия.
2. Вскрытие, удаление горла, трахеи, щитовидной железы и ПГ.
3. Под вытяжной капюшон поместите удаленные образцы горла, трахеи, щитовидной железы и ПГ в 4% раствор параформальдегида в течение 24 ч.

15. Гистопатологические исследования

1. Обезвоживают ткани и встраивают их в парафин. Нарежьте на участки толщиной 5 мкм. Выпекать срезы при 37 °C в духовке на ночь и при 65 °C в течение 1 ч.
2. Окрашивают срезы гематоксилином и эозином (H&E) после промывки 3 х 5 мин 75%, 95%, 100% градиентным спиртом и промывкой водой комнатной температуры.
3. Попросите патологоанатомов исследовать окрашенные H&E участки под световым микроскопом.

Результаты

В этой животной модели мы хирургически разрезали шею крысы SD, чтобы обнажить трахею, гортань и окружающие ткани. Затем щитовидная железа визуально располагалась по обеим сторонам трахеи; он имеет форму бабочки и размером примерно 3 мм х 5 мм. Пара ПГ обычно располагается в верхней части щ...

Обсуждение

Мы демонстрируем метод отрицательной визуализации ПГ крыс с использованием черных ИОНП, которые вводились локально в центр щитовидной железы и диффундировали внутри щитовидной железы, но не ПГ. Это позволяет четко идентифицировать ПГ невооруженным глазом без помощи какого-либо микро...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
alcohol	Li feng	9400820067
anesthesia machine	RWD Company	R520IE	Machine number
blade	Daopian	TB-JZ-10#
cylindrical pillow			made by ourselves
depilatory cream	Nair	TMG-001
electronic scale	Hong xingda	CN-HXD2
eosin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-2
erythromycin	Shuang ji (Beijing, China)	200409
gauze	Fulanns	YY0331-2006
heating pad	Johon (ShenZhen,China)	JH-36-2006
hematoxylin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-1
insulin injection needle	Jiangyin NanquanMacromolecule	20170702
iodophor cotton ball	HOYON	19-6007
iron oxide nanoparticle solution	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag9110-05
isoflurane	Sigma Aldrich (St Louis USA).	21112801
needle holder	Meijun	MH0587
operation table	BioJane	BJ-P-M
paraformaldehyde solution	Biosharp	21269333
rubber	G-CLONE	XT41050
scanning machine	Olympus	Slideview VS200
surgical forceps	Suping	SPHC-0676
surgical knife handle	Aladdin	S3052-06-1EA
surgical retractor	TOCYTO	18-4010
surgical scissors	Suping	SPHC-0795
surgical towel	Along technology	YCKJ-RJ-036205
suture	Ethicon	SA84G
suture with needle	Jinhuan (Shanghai,China)	F301
vascular forceps	Along technology	YCKJ-RJ-016218
Water Bath-Slide Drier	Hua su (Jinhua, China)	HS-1145