İntraoperatif Paratiroid Bezi Görüntülemede Basit ve Etkili Bir Sıçan Modelinin Oluşturulması

Özet

Bugüne kadar, paratiroid bezi (PG) tanımlama yöntemlerinin gelişimi, klinik öncesi araştırmalarda hayvan modellerinin eksikliği ile sınırlıdır. Burada, intraoperatif PG görüntüleme için basit ve etkili bir sıçan modeli oluşturuyoruz ve yeni bir PG kontrast maddesi olarak demir oksit nanopartikülleri kullanarak etkinliğini değerlendiriyoruz.

Özet

Paratiroid bezi (PG) tanımlaması tiroidektomide karşılanmamış kritik bir ihtiyaçtır. PG'nin tanımlanması, tiroid bezine renk olarak benzediği için tiroid cerrahisinde zordur. Preklinik araştırmalarda etkili hayvan modellerinin eksikliği, PG tanımlama tekniklerinin geliştirilmesi için ciddi bir sınırlamadır. Bu protokol, PG tanımlaması için basit ve etkili bir sıçan modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu modelde, siyah demir oksit nanopartikülleri (IONP'ler) tiroid bezine lokal olarak enjekte edilir ve PG'ye değil, tiroid bezi içinde hızla yayılır. Negatif lekeli PG ve pozitif boyanmış tiroid bezi, harici mikroskoplara ihtiyaç duymadan çıplak gözle kolayca tanımlanabilir. PG'nin pozisyonu, siyah IONP'lerin rengine bağlı olarak tiroid bezi ile PG arasındaki renk kontrastının arttırılmasıyla tanımlanabilir. Bu sıçan modeli düşük maliyetlidir ve PG tanımlaması için uygundur ve IONP'ler yeni bir PG kontrast maddesidir.

Giriş

Paratiroid bezi (PG), insanların ve diğer omurgalıların boynunda bulunan, kandaki ve kemiklerdeki kalsiyum ve fosfor seviyelerini düzenlemek ve dengelemek için paratiroid hormonları üreten ve salgılayan küçük, oval şekilli endokrin bezlerdir¹. İnsanlar genellikle tiroid bezi loblarının arkasında değişken konumlarda bulunan iki çift PG'ye sahiptir; insan PG'sinin boyutu tipik olarak yaklaşık 35-40 mg 2 ağırlığında 6 mm x 4 mm x^{2 mm boyutlarındadır}. PG'nin çıkarılması veya hasar görmesi, hipokalsemi ve düşük veya saptanamayan paratiroid hormonu seviyeleri ile karakterize bir endokrin bozukluk olan hipoparatiroidizme (HP) neden olur ve bu da kramp benzeri spazmlardan hatalı biçimlendirilmiş dişlere ve kronik böbrek hastalıklarına kadar çok çeşitli semptomlara neden olur. Bu komplikasyonlardan bazıları ölümcüldür (örneğin, kalp yetmezliği ve nöbet)^3,4,5; Bu nedenle, PG vücudun metabolizmasını düzenlemek ve yaşamı sürdürmek için gereklidir.

HP, dünya çapında en sık görülen endokrin kanser olan tiroid kanseri için iyi bilinen küratif bir tedavi olan tiroidektomi başta olmak üzere anterior boyun cerrahisinden sonra en sık görülen komplikasyonlardan biridir ^6,7. Tiroidektomi sonrası HP, ağırlıklı olarak, PG'yi tiroid bezi loblarından ve diğer çevre dokulardan (örneğin, lenf düğümleri ve periferik yağ parçacıkları) ameliyathanede gerçek zamanlı olarak güvenilir bir şekilde ayırt etme yeteneğinin ciddi eksikliği nedeniyle ameliyatta doğrudan travma, iskemi veya PG'nin çıkarılmasından kaynaklanır. 2021 yılında Barrios ve ark., 1.114 tiroidektomi vakasında ortalama PG yanlış kesit oranını% 22.4 olarak bildirmiş ve hatta minimum hata oranı% 7.7 olan deneyimli cerrahlar ⁸. Bu kadar yüksek PG yanlış kesit oranları, diğer benzer raporlarla tutarlıdır 9,10,11. Bu nedenle yanlış paratiroidektomi postoperatif geçici ve kalıcı HP'de bağımsız bir risk faktörüdür.

Etkili intraoperatif PG tanımlama yöntemlerinin geliştirilmesi, bu kritik karşılanmamış tıbbi ihtiyacın ele alınmasında anahtar tutar; Bununla birlikte, klinik öncesi araştırmalarda hayvan modellerinin eksikliği nedeniyle ciddi şekilde sınırlandırılmıştır. Bugüne kadar, intraoperatif PG tanımlama araştırmalarının çoğu, pahalı ve etik onay almak, denek sayılarını genişletmek ve testleri tekrarlamak zor olan insan hastalar ve büyük hayvanlar (örneğin köpekler)¹² üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu arada, biyolojik araştırmalarda en yaygın kullanılan omurgalı modeli olan fare, 1 mm^13'ten daha küçük bir boyuta sahip son derece küçük PG'ye sahiptir. Bu sınırlama nedeniyle, fare PG modelleri intraoperatif PG tanımlama araştırmalarında nadiren kullanılmıştır.

Bu yazıda intraoperatif PG tanımlama çalışmaları için basit, anlaşılır ve etkili bir sıçan modelinin oluşturulması bildirilmektedir. Tiroidektomi ameliyatında PG görüntüleme kontrast maddesi IONP'leri test etmek için güvenilir bir hayvan modeli olarak herhangi bir cerrahi modifikasyon veya genetik mühendisliği olmadan yerli Sprague-Dawley (SD) sıçanlarının kullanımını araştırdık. Bu sıçan modeli, PG'nin ve çevresindeki mikro çevrenin insanlarınkine oldukça benzer bir fizyolojik yapısını göstermektedir ve sıçan PG'nin boyutu, farelerinkine kıyasla görsel olarak tespit edilebilecek kadar büyüktür. Çoğu sıçan, tiroid bezinin her iki tarafında bir PG'ye sahiptir. Bu sıçan modelinin basitliği ve etkinliği, tiroidektomi cerrahisinde intraoperatif IONP ile güçlendirilmiş PG görüntülemenin yapılması ile gösterilmiştir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Çin Bilimler Akademisi, Temel Tıp ve Kanser Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu hayatta kalmayan bir ameliyattır.

1. Hayvan

1. İntraoperatif PG görüntüleme için 250 g ağırlığında 6-8 haftalık dişi SD sıçan kullanın.

2. Anestezi

1. Anestezi makinesini açın.
2. Başlamadan önce, anestezi buharlaştırıcısında izofluran seviyesinin dolu olduğundan emin olun. Ardından, oksijeni açın ve akış hızını 0,4-0,8 L / dak olarak ayarlayın. %3-5 izofluran ile anestezi indükleyin ve %2 izofluranda tutun (akış hızı: 0.4-0.8 L/dak).
3. SD sıçanı anestezi makinesinin kutusuna koyun ve hayvan anestezisine başlamak için Kanal modelini seçin.
4. Kutudaki sıçan aktivitesini gözlemleyin. Sıçan komaya girdiğinde, anesteziyi korumak için burun konisine taşıyın (ağrı refleksi ve kornea refleksi olmadan bilinçsiz sırtüstü pozisyon).
5. Sıçanın burnunu örtmek için anestezi maskesini kullanın ve ameliyat sırasında hayvanı anestezi altında tutmak için anestezi makinesini Maske moduna geçirin.

3. Duruş ve fiksasyon

1. Anestezi uygulanan sıçanı ameliyat masasındaki cerrahi bir örtüye aktarın. Ameliyat sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için hayvanın altına önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığı yerleştirin.
2. Sıçanın uzuvlarını ameliyat masasına sabitlemek için lastik bantlar kullanın. Başını geriye yaslamak için sıçanın omzunun altına örtüden yapılmış silindirik bir yastık yerleştirin ve boyun bölgesini tamamen açığa çıkarın.
3. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için sıçanın her iki gözüne yapay gözyaşı merhemi uygulayın.

4. Epilasyon

1. Boyun bölgesine tüy dökücü krem uygulayın: submandibuler boşluğa kadar, ksifoid sürece kadar ve her iki tarafta sternokleidomastoid kasının dışına.
2. 3 dakika sonra, saçları ve tüy dökücü kremi bir mendille nazikçe silin.

5. Sterilizasyon

1. Boynun ortasından çevreye kadar olan operasyon alanını 3 kez dezenfekte etmek için bir Iodophor pamuk topu kullanın. Sadece saçın çıkarıldığı alanı dezenfekte edin.

6. Cerrahi örtü döşeme

1. Sıçanın boynunun ameliyat alanını örtmek için cerrahi bir örtü kullanın. Cerrahi örtünün deliğini hayvanın dezenfeksiyon alanıyla aynı hizada tutun.

7. Kesi

1. Kesi yapmadan önce anestezinin cerrahi düzlemini, ayak parmağı sıkışma refleksinin eksikliği ile onaylayın. Daha sonra, bıçağı neşterin içine yerleştirin ve sıçanın boynunun ön orta hattında uzunlamasına bir kesi yapmak için neşteri kullanın. Kesi uzunluğunun yaklaşık 5 cm olduğundan ve sadece dermiste olduğundan emin olun.

8. Ön servikal kastan deri altı dokusunun diseksiyonu

1. Cildi insizyonun her iki tarafı boyunca kaldırın.
2. Linea alba servikalis boyunca uzunlamasına kesmek için bir makas kullanın.
3. Sternohyoid kası ve sternotiroid kasını ayırmak için forseps kullanın.

9. Ön boyun kaslarını her iki tarafa da sabitleyin

1. Ayrılmış sternohyoid kası ve sternotiroid kasını boynun önünde sıkıştırmak ve kelepçelenmiş dokuyu dışarıya çekmek için vasküler forseps kullanın.
2. Dikişi (3-0 #) kelepçeli dokudan geçirmek, düğüm yapmak ve sütürü ameliyat masasının cerrahi örtüsüne sabitlemek için bir retraktör veya iğne kullanın.

10. Tiroid bezi lokalizasyonu

1. Tiroid kıkırdağını ve krikoid kıkırdağı operasyon bölgesinde üst sınır olarak bulun. Tiroid kıkırdağını kalkan şekline göre ve krikoid kıkırdağı halka şekline göre tanımlayın.
2. Trakea'yı operasyon alanında alt sınır olarak bulun. Boynun ön ve ortasındaki trakeayı, boru şeklindeki kıkırdak halkası şekline göre arayın.
3. Tiroid bezini üst ve alt sınırlar arasında bulun - trakeanın karşı tarafında kelebek şeklinde kırmızı bir bez.

11. PG'nin görsel olarak tanımlanması

1. PG'yi tiroid bezinin üst ve dış taraflarına yerleştirin. Yaklaşık 1.2-2 mm uzunluğunda ve 1.0-1.5 mm genişliğinde, kırmızımsı ancak belirli bir sınıra sahip çevreleyen tiroid bezinden daha hafif olan fusiform bir şekilde iki PG arayın.
2. PG'nin trakea, tiroid ve larinks ile ön fotoğrafını çekerek enjeksiyondan önce ve sonra IONP'nin etkilerini nicel olarak karşılaştırın.
3. Yemek borusunun arkasını disseke edin, ardından PG'nin sağ tarafını ortaya çıkarmak için retraktörü kullanın. PG'nin tiroid bezi ve trakea ile sağ taraf fotoğrafını çekin.
4. PG'nin karşı tarafını ortaya çıkarmak için retraktörü değiştirin ve tiroid bezi ve trakea ile sol taraftaki fotoğrafını çekin.

12. IONP'lerin tiroid enjeksiyonu

1. Tiroid bezinin merkezine lokal olarak 10 μL IONP süspansiyonunu (fosfat tamponlu salinde 20 mg / mL) enjekte etmek için bir insülin şırıngası kullanın. Enjeksiyon bölgesine 5 s boyunca gazlı bezle hafifçe bastırın.

13. IONP enjeksiyonundan sonra PG'nin tanımlanması

1. Enjeksiyondan sonra, PG'yi negatif olarak boyadığı ve onları çevreleyen tiroidden ayırdığı için PG'nin değil, tiroid bezleri içindeki IONP'lerin hızlı difüzyonunu gözlemleyin.
2. Negatif lekeli PG'nin trakea, tiroid bezi ve gırtlak ile birlikte ön fotoğrafını çekin.
3. Yukarıda belirtilen prosedürleri kullanarak negatif lekeli PG'nin sol ve sağ taraf fotoğraflarını çekin.

14. Boğaz ve trakeanın tiroid bezi ve PG ile rezeksiyonu

1. Sıçanlar aşırı izofluran (5 dakikadan fazla bir süredir% 5 izofluran) soluduktan ve derin anestezi altına girdikten sonra, 0.5 mL doymuş potasyum klorür çözeltisinin intrakardiyak enjeksiyonu ile ötenazi yapın.
2. Postmortem, boğazı, trakeayı, tiroid bezini ve PG'yi çıkarın.
3. Bir duman başlığının altında, çıkarılan boğaz, trakea, tiroid bezi ve PG örneklerini 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine yerleştirin.

15. Histopatoloji çalışmaları

1. Dokuları kurutun ve parafine gömün. 5 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri 37 °C'de gece boyunca fırında ve 65 °C'de 1 saat pişirin.
2. Bölümleri hematoksilin ve eozin (H&E) ile 3 x 5 dakika yıkadıktan sonra %75, %95, %100 gradyan alkol ve oda sıcaklığında suyla yıkayın.
3. Patologların H & E boyalı bölümleri ışık mikroskobu altında incelemelerini sağlayın.

Sonuçlar

Bu hayvan modelinde, trakea, larinks ve çevresindeki dokuları ortaya çıkarmak için bir SD sıçanın boynunu cerrahi olarak kestik. Daha sonra, tiroid bezi görsel olarak trakeanın her iki tarafına yerleştirildi; kelebek şeklindedir ve yaklaşık 3 mm x 5 mm boyutlarındadır. Bir çift PG genellikle tiroid bezinin üst kısmında bulunur ve renkleri tiroid bezi loblarınınkine çok benzer, bu da onları çıplak gözle ayırt etmeyi son derece zorlaştırır (Şekil 1).

Tartışmalar

Tiroid bezinin merkezine lokal olarak enjekte edilen ve tiroid bezi içinde yayılan, ancak PG içinde olmayan siyah IONP'leri kullanarak sıçan PG'nin IONP rehberliğinde negatif görüntüleme tekniğini gösterdik. PG'nin herhangi bir mikroskop yardımı olmadan çıplak gözle net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. PG'de seçici olarak eksprese edilen yeşil floresan proteinli transgenik fareler bildirilmiş olmasına rağmen¹³, bu makalede açıklanan modelin gerçekleştirilmesi daha b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
alcohol	Li feng	9400820067
anesthesia machine	RWD Company	R520IE	Machine number
blade	Daopian	TB-JZ-10#
cylindrical pillow			made by ourselves
depilatory cream	Nair	TMG-001
electronic scale	Hong xingda	CN-HXD2
eosin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-2
erythromycin	Shuang ji (Beijing, China)	200409
gauze	Fulanns	YY0331-2006
heating pad	Johon (ShenZhen,China)	JH-36-2006
hematoxylin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-1
insulin injection needle	Jiangyin NanquanMacromolecule	20170702
iodophor cotton ball	HOYON	19-6007
iron oxide nanoparticle solution	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag9110-05
isoflurane	Sigma Aldrich (St Louis USA).	21112801
needle holder	Meijun	MH0587
operation table	BioJane	BJ-P-M
paraformaldehyde solution	Biosharp	21269333
rubber	G-CLONE	XT41050
scanning machine	Olympus	Slideview VS200
surgical forceps	Suping	SPHC-0676
surgical knife handle	Aladdin	S3052-06-1EA
surgical retractor	TOCYTO	18-4010
surgical scissors	Suping	SPHC-0795
surgical towel	Along technology	YCKJ-RJ-036205
suture	Ethicon	SA84G
suture with needle	Jinhuan (Shanghai,China)	F301
vascular forceps	Along technology	YCKJ-RJ-016218
Water Bath-Slide Drier	Hua su (Jinhua, China)	HS-1145