Etablierung eines einfachen und effektiven Rattenmodells für die intraoperative Bildgebung der Nebenschilddrüse

Zusammenfassung

Bisher ist die Entwicklung von Methoden zur Identifizierung der Nebenschilddrüse (PG) durch das Fehlen von Tiermodellen in der präklinischen Forschung begrenzt. Hier etablieren wir ein einfaches und effektives Rattenmodell für die intraoperative PG-Bildgebung und evaluieren dessen Wirksamkeit durch den Einsatz von Eisenoxid-Nanopartikeln als neuartiges PG-Kontrastmittel.

Zusammenfassung

Die Identifizierung der Nebenschilddrüse (PG) ist ein kritischer ungedeckter Bedarf bei der Thyreoidektomie. Die Identifizierung der PG ist in der Schilddrüsenchirurgie eine Herausforderung, da sie in ihrer Farbe der Schilddrüse ähnelt. Der Mangel an effektiven Tiermodellen in der präklinischen Forschung stellt eine schwerwiegende Einschränkung für die Entwicklung von PG-Identifizierungstechniken dar. Dieses Protokoll ermöglicht die Etablierung eines einfachen und effektiven Rattenmodells für die PG-Identifikation. In diesem Modell werden schwarze Eisenoxid-Nanopartikel (IONPs) lokal in die Schilddrüse injiziert und diffundieren schnell in der Schilddrüse, aber nicht in der PG. Ein negativ gefärbtes PG und eine positiv gefärbte Schilddrüse können mit bloßem Auge leicht identifiziert werden, ohne dass externe Mikroskope erforderlich sind. Die Position des PG kann identifiziert werden, indem der Farbkontrast zwischen der Schilddrüse und dem PG basierend auf der Farbe der schwarzen IONPs erhöht wird. Dieses Rattenmodell ist kostengünstig und praktisch für die PG-Identifizierung, und die IONPs sind ein neuartiges PG-Kontrastmittel.

Einleitung

Nebenschilddrüse (PG) sind kleine, ovale endokrine Drüsen im Nacken von Menschen und anderen Wirbeltieren, die Parathormonen produzieren und absondern, um den Kalzium- und Phosphorspiegel im Blut und in den Knochen zu regulieren und auszugleichen¹. Menschen haben normalerweise zwei Paare von PG, die sich hinter den Schilddrüsenlappen an variablen Stellen befinden; Die Größe des menschlichen PG misst typischerweise 6 mm x 4 mm x 2 mm, mit einem Gewicht von etwa 35-40 mg². Die Entfernung oder Schädigung des PG verursacht Hypoparathyreoidismus (HP), eine endokrine Störung, die durch Hypokalzämie und niedrige oder nicht nachweisbare Parathormonspiegel gekennzeichnet ist, die eine Vielzahl von Symptomen verursachen, von krampfartigen Krämpfen über missgebildete Zähne bis hin zu chronischen Nierenerkrankungen. Einige dieser Komplikationen sind tödlich (z. B. Herzinsuffizienz und Krampfanfälle)^3,4,5; Daher ist PG essentiell für die Regulierung des Stoffwechsels des Körpers und die Erhaltung des Lebens.

HP ist eine der häufigsten Komplikationen nach einer Operation am vorderen Hals, insbesondere bei der Thyreoidektomie, einer etablierten kurativen Behandlung von Schilddrüsenkrebs, der weltweit häufigsten endokrinen Krebserkrankung ^6,7. Die HP-Post-Thyreoidektomie wird überwiegend durch direktes Trauma, Ischämie oder Entfernung des PG in der Chirurgie verursacht, da das PG nicht in der Lage ist, das PG zuverlässig von Schilddrüsenlappen und anderen umgebenden Geweben (z. B. Lymphknoten und peripheren Fettpartikeln) in Echtzeit im Operationssaal zu unterscheiden. Im Jahr 2021 berichteten Barrios et al. über eine durchschnittliche PG-Fehlschnittrate von 22,4 % innerhalb von 1.114 Thyreoidektomiefällen und sogar erfahrene Chirurgen, die eine minimale Fehlerquote von 7,7 ^% aufwiesen8. Solche hohen PG-Fehlschnittraten stehen im Einklang mit anderen ähnlichen Berichten 9,10,11. Daher ist eine falsche Parathyreoidektomie ein unabhängiger Risikofaktor für vorübergehende und dauerhafte postoperative HP.

Die Entwicklung effektiver intraoperativer PG-Identifizierungsmethoden ist der Schlüssel zur Deckung dieses kritischen ungedeckten medizinischen Bedarfs. Es wurde jedoch durch den Mangel an Tiermodellen in der präklinischen Forschung stark eingeschränkt. Bisher wurden die meisten intraoperativen Untersuchungen zur PG-Identifizierung an menschlichen Patienten und großen Tieren (z. B. Hunden)¹² durchgeführt, die teuer und schwierig sind, eine ethische Zulassung zu erhalten, die Anzahl der Probanden zu erweitern und Tests zu wiederholen. Inzwischen hat die Maus, das am häufigsten verwendete Wirbeltiermodell in der biologischen Forschung, ein extrem kleines PG mit einer Größe von weniger als 1 mm¹³. Aufgrund dieser Einschränkung wurden Maus-PG-Modelle selten in der intraoperativen PG-Identifizierungsforschung verwendet.

In diesem Artikel wird über die Etablierung eines einfachen, unkomplizierten und effektiven Rattenmodells für intraoperative PG-Identifizierungsstudien berichtet. Wir untersuchten die Verwendung von einheimischen Sprague-Dawley (SD) Ratten ohne chirurgische Modifikationen oder Gentechnik als zuverlässiges Tiermodell für die Prüfung eines PG-Bildgebungskontrastmittels, IONPs, in einer Thyreoidektomie-Operation. Dieses Rattenmodell zeigt eine sehr ähnliche physiologische Struktur von PG und der umgebenden Mikroumgebung wie der von Menschen, und die Größe von Ratten-PG ist groß genug, um im Vergleich zu denen von Mäusen visuell erkannt zu werden. Die meisten Ratten haben ein PG auf jeder Seite der Schilddrüse. Die Einfachheit und Wirksamkeit dieses Rattenmodells wurde durch die Durchführung einer intraoperativen IONP-verstärkten PG-Bildgebung in der Thyreoidektomie-Chirurgie nachgewiesen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Institute of Basic Medicine and Cancer der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigt. Dies ist eine Nicht-Überlebens-Operation.

1. Tier

1. Verwenden Sie eine 6-8 Wochen alte weibliche SD-Ratte mit einem Gewicht von 250 g für die intraoperative PG-Bildgebung.

2. Anästhesie

1. Schalten Sie das Anästhesiegerät ein.
2. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass der Isofluranspiegel im Anästhesie-Vaporizer voll ist. Schalten Sie dann den Sauerstoff ein und stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4-0,8 l / min ein. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 3-5% Isofluran und halten Sie es bei 2% Isofluran (Flussrate: 0,4-0,8 l/min).
3. Legen Sie die SD-Ratte in die Box des Anästhesiegeräts und wählen Sie das Kanalmodell aus, um mit der Tieranästhesie zu beginnen.
4. Beobachten Sie die Rattenaktivität in der Box. Wenn die Ratte ins Koma fällt, bewegen Sie sie in den Nasenkegel, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten (unbewusste Rückenlage ohne Schmerzreflex und Hornhautreflex).
5. Verwenden Sie die Anästhesiemaske, um die Nase der Ratte zu bedecken, und schalten Sie das Anästhesiegerät in den Maskenmodus , um das Tier während der Operation unter Narkose zu halten.

3. Haltung und Fixierung

1. Übertragen Sie die anästhesierte Ratte auf ein chirurgisches Tuch auf einem OP-Operationstisch. Legen Sie ein vorgewärmtes Heizkissen unter das Tier, um die Körpertemperatur des Tieres während der Operation aufrechtzuerhalten.
2. Verwenden Sie Gummibänder, um die Gliedmaßen der Ratte am Operationstisch zu fixieren. Legen Sie ein zylindrisches Kissen aus Vorhang unter die Schulter der Ratte, um den Kopf nach hinten zu lehnen und den Nackenbereich vollständig freizulegen.
3. Tragen Sie künstliche Tränensalbe auf beide Augen der Ratte auf, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.

4. Haarentfernung

1. Tragen Sie die Enthaarungscreme auf den Halsbereich auf: bis zum Unterkieferraum, bis zum Xiphoidfortsatz und auf beiden Seiten bis zur Außenseite des Musculus sternocleidomastoideus.
2. Wischen Sie nach 3 Minuten die Haare und die Enthaarungscreme vorsichtig mit einem Taschentuch ab.

5. Sterilisation

1. Verwenden Sie einen Iodophor-Wattebausch, um den Operationsbereich 3 Mal von der Mitte des Halses bis zur Umgebung zu desinfizieren. Desinfizieren Sie nur den Bereich, aus dem die Haare entfernt wurden.

6. Chirurgische Tuchverlegung

1. Verwenden Sie einen chirurgischen Vorhang, um den Operationsbereich des Halses der Ratte abzudecken. Halten Sie das Loch des chirurgischen Vorhangs auf den Desinfektionsbereich des Tieres ausgerichtet.

7. Inzision

1. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes, bevor Sie den Schnitt machen. Dann stecken Sie die Klinge in das Skalpell und verwenden Sie das Skalpell, um einen Längsschnitt in der vorderen Mittellinie des Halses der Ratte zu machen. Stellen Sie sicher, dass die Schnittlänge ca. 5 cm beträgt und nur in der Dermis.

8. Dissektion von Unterhautgewebe aus dem vorderen Halsmuskel

1. Heben Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts an.
2. Schneiden Sie mit einer Schere längs entlang der Linea alba cervicalis.
3. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Musculus sternohyoideus und den Musculus sternothyroideus zu trennen.

9. Fixieren Sie die vordere Nackenmuskulatur auf beiden Seiten

1. Verwenden Sie eine Gefäßzange, um den getrennten Sternohyoideusmuskel und den Sternothyroidmuskel vor dem Hals zu klemmen und das eingeklemmte Gewebe nach außen zu ziehen.
2. Verwenden Sie einen Retraktor oder die Nadel, um die Naht (3-0 #) durch das eingeklemmte Gewebe zu führen, einen Knoten zu machen und die Naht am chirurgischen Vorhang des Operationstisches zu fixieren.

10. Lokalisation der Schilddrüse

1. Lokalisieren Sie den Schildknorpel und den Ringknorpel als obere Grenze im Operationsgebiet. Identifizieren Sie den Schildknorpel anhand seiner Schildform und den Ringknorpel anhand seiner Ringform.
2. Lokalisieren Sie die Luftröhre als untere Grenze im Operationsbereich. Suchen Sie nach der Luftröhre in der Vorder- und Mitte des Halses, basierend auf ihrer röhrenförmigen Knorpelringform.
3. Lokalisieren Sie die Schilddrüse zwischen der oberen und unteren Grenze - eine rote Drüse in Form eines Schmetterlings auf der gegenüberliegenden Seite der Luftröhre.

11. Visuelle Identifikation des PG

1. Lokalisieren Sie das PG an der Ober- und Außenseite der Schilddrüse. Suchen Sie nach zwei PG in einer fusiformen Form von etwa 1,2-2 mm Länge und 1,0-1,5 mm Breite, die rötlich, aber heller sind als die umgebende Schilddrüse mit einer bestimmten Grenze.
2. Machen Sie ein frontales Foto des PG mit der Luftröhre, der Schilddrüse und dem Kehlkopf, um die Auswirkungen von IONP vor und nach der Injektion quantitativ zu vergleichen.
3. Sezieren Sie die Rückseite der Speiseröhre und verwenden Sie dann den Retraktor, um die rechte Seite des PG freizulegen. Machen Sie ein Foto der PG auf der rechten Seite mit der Schilddrüse und der Luftröhre.
4. Tauschen Sie den Retraktor aus, um die gegenüberliegende Seite des PG freizulegen, und machen Sie ein Foto von der linken Seite mit der Schilddrüse und der Luftröhre.

12. Schilddrüseninjektion der IONPs

1. Verwenden Sie eine Insulinspritze, um lokal 10 μl IONPs-Suspension (20 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) in das Zentrum der Schilddrüse zu injizieren. Drücken Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit Gaze für 5 s.

13. Identifizierung des PG nach IONPs-Injektion

1. Beobachten Sie nach der Injektion die schnelle Diffusion der IONPs in den Schilddrüsen, aber nicht des PG, da es das PG negativ färbt und sie von der umgebenden Schilddrüse unterscheidet.
2. Machen Sie ein Frontfoto des negativ gefärbten PG zusammen mit der Luftröhre, der Schilddrüse und dem Kehlkopf.
3. Machen Sie Fotos von der linken und rechten Seite des negativ gefärbten PG mit den gleichen Verfahren wie oben erwähnt.

14. Resektion des Rachens und der Luftröhre mit der Schilddrüse und PG

1. Sobald die Ratten überschüssiges Isofluran (5% Isofluran für mehr als 5 Minuten) eingeatmet haben und sich unter tiefer Narkose befinden, werden sie durch intrakardiale Injektion von 0,5 ml gesättigter Kaliumchloridlösung eingeschläfert.
2. Postmortal entfernen Sie den Rachen, die Luftröhre, die Schilddrüse und PG.
3. Unter einem Abzug werden die entfernten Hals-, Luftröhren-, Schilddrüsen- und PG-Proben für 24 h in 4% ige Paraformaldehydlösung gegeben.

15. Histopathologische Untersuchungen

1. Dehydrieren Sie das Gewebe und betten Sie es in Paraffin ein. In 5 μm dicke Abschnitte schneiden. Die Abschnitte über Nacht bei 37 °C im Backofen und 1 Stunde bei 65 °C backen.
2. Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) nach dem Waschen 3 x 5 min mit 75%, 95%, 100% Gradientenalkohol und Wasser bei Raumtemperatur.
3. Lassen Sie Pathologen die H & E-gefärbten Abschnitte unter einem Lichtmikroskop untersuchen.

Ergebnisse

In diesem Tiermodell haben wir den Hals einer SD-Ratte chirurgisch eingeschnitten, um die Luftröhre, den Kehlkopf und das umgebende Gewebe freizulegen. Dann befand sich die Schilddrüse visuell auf beiden Seiten der Luftröhre; Er ist schmetterlingsförmig und etwa 3 mm x 5 mm groß. Ein Paar PG befindet sich normalerweise im oberen Teil der Schilddrüse, und ihre Farbe ist der der Schilddrüsenlappen sehr ähnlich, was es extrem schwierig macht, sie mit bloßem Auge zu unterscheiden (Abbildung 1

Diskussion

Wir demonstrieren eine IONPs-gesteuerte negative Bildgebungstechnik von Ratten-PG unter Verwendung von schwarzen IONPs, die lokal in der Mitte der Schilddrüse injiziert und in der Schilddrüse, aber nicht in der PG diffundiert wurden. Es ermöglicht eine eindeutige Identifikation des PG mit bloßem Auge ohne Hilfe eines Mikroskops. Obwohl über transgene Mäuse mit grün fluoreszierendem Protein, das selektiv im PG exprimiert wird, berichtet wurde¹³, ist das in dieser Arbeit beschriebene Modell e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
alcohol	Li feng	9400820067
anesthesia machine	RWD Company	R520IE	Machine number
blade	Daopian	TB-JZ-10#
cylindrical pillow			made by ourselves
depilatory cream	Nair	TMG-001
electronic scale	Hong xingda	CN-HXD2
eosin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-2
erythromycin	Shuang ji (Beijing, China)	200409
gauze	Fulanns	YY0331-2006
heating pad	Johon (ShenZhen,China)	JH-36-2006
hematoxylin	Thermo Fisher (Waltham, USA).	C0105S-1
insulin injection needle	Jiangyin NanquanMacromolecule	20170702
iodophor cotton ball	HOYON	19-6007
iron oxide nanoparticle solution	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag9110-05
isoflurane	Sigma Aldrich (St Louis USA).	21112801
needle holder	Meijun	MH0587
operation table	BioJane	BJ-P-M
paraformaldehyde solution	Biosharp	21269333
rubber	G-CLONE	XT41050
scanning machine	Olympus	Slideview VS200
surgical forceps	Suping	SPHC-0676
surgical knife handle	Aladdin	S3052-06-1EA
surgical retractor	TOCYTO	18-4010
surgical scissors	Suping	SPHC-0795
surgical towel	Along technology	YCKJ-RJ-036205
suture	Ethicon	SA84G
suture with needle	Jinhuan (Shanghai,China)	F301
vascular forceps	Along technology	YCKJ-RJ-016218
Water Bath-Slide Drier	Hua su (Jinhua, China)	HS-1145