הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED

Summary

הפרוטוקול הנוכחי פיתח שיטה להערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED. היתרונות של גישה זו הם שהיא בטוחה, יעילה, זולה, ומאפשרת לחוקר למדוד מספר דגימות בו זמנית.

Abstract

כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) היא טכניקה אנליטית נגישה שנעשה בה שימוש נרחב במחקר בכימיה אורגנית כדי לכמת את התשואה של דגימות לא ידועות. המחקר הנוכחי פיתח שיטה יעילה, זולה ובטוחה להעריך את תפוקת הדגימות על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה. לובסטטין שהופק מאספרגילוס טראוס היה התרכובת לדוגמה ששימשה במחקר הנוכחי. מודלים של רגרסיה המבוססים על תקן lovastatin שימשו להערכת התשואה של lovastatin. הושוו שלוש שיטות: ביו-אסאי, גילוי UV ותאורת LED כחולה. התוצאה הראתה כי שיטת התאורה blue-LED יעילה הרבה יותר בזמן מאשר שיטות זיהוי UV ובדיקת ביולוגיה. בנוסף, תאורת ה-LED הכחולה הייתה אופציה בטוחה יחסית בגלל החשש מסכנות ביולוגיות בשיטת הביו-אסאי (למשל, זיהום מיקרוביאלי) וחשיפה לקרינה אולטרה סגולה בשיטת גילוי ה-UV. בהשוואה לשיטות היקרות הדורשות מכשירים מיוחדים והכשרה ארוכת טווח לפני עבודה עצמאית, כגון GC, HPLC ו- HPTLC, השימוש בתאורת Blue-LED היה אפשרות חסכונית להעריך את תפוקת הדגימות מצלחת TLC.

Introduction

כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) נמצאת בשימוש נרחב כטכניקה איכותית וכמותית בתחום הכימיה האורגנית ^1,2,3. היתרונות העיקריים של TLC הם שהיא מספקת זיהוי מהיר, דרישות מדגם גמישות, ואינה דורשת ציוד מיוחד⁴. עד כה, למרות שגישות מתקדמות רבות הוקמו, TLC היא עדיין השיטה העיקרית לזיהוי דגימות לא ידועות בתערובת. עם זאת, האתגר של גישה זו הוא היעדר ציוד בטוח וזול לכימות תפוקת הדגימה, במיוחד לפיתוח מעבדות עם תקציבים מוגבלים. המחקר הנוכחי, אם כן, נועד לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה בשילוב עם TLC כדי להעריך את התשואה של הדגימות.

שלא כמו TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וכרומטוגרפיית גז (GC) עם דרישות דגימה מחמירות, זמן רב ומעורבות של multistep להכנת דגימה ^1,5, TLC הראה מספר יתרונות. ראשית, לצורך הכנת הדגימה, HPLC ו- GC אינם יכולים לזהות את התמצית הגולמית מכיוון שהתמצית הגולמית עשויה לחבר את העמודה של HPLC ו- GC. שנית, כאשר הדגימות אינן מתאימות ל- UV (חשוב לניתוח HPLC) או עם תנודתיות נמוכה (חשוב לניתוח GC), ניתן להחיל TLC על דגימות אלה, והשימוש במגיב הדמיה הופך את הדגימות המבודדות לגלויות על שכבות דקות ^6,7,8. שלישית, עבור משתמשים כלליים, HPLC ו- GC דורשים בדרך כלל זמן רב יחסית לפני שהם עובדים באופן עצמאי, בהשוואה ל- TLC. בנוסף, ניתוח TLC כמותי, המכונה TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), יכול להפוך את המידע על לוח TLC לדיגיטלי באמצעות סורק רגיש במיוחד. עם זאת, העלות של מערכת HPTLC הוא יקר יחסית. ככזה, פיתוח גישה חסכונית ומהירה לכימות דגימות על צלחת TLC הוא נושא חשוב.

שיטות דומות פותחו לכימות תפוקת TLC; לדוגמה, Johnson⁹ דיווח על טכניקה המאפשרת לכמת את הדגימות על צלחת TLC באמצעות סורק שטוח המחובר למחשב. בשנת 2001, El-Gindy et al.10 פיתחו את השיטה TLC- densitometric, אשר שימשה לאיתור התרכובת עם צפיפות אופטית, והטכניקה יושמה גם על ידי Elkady et ^al.11. בשנת 2007, הס² הציג את שיטת ה-TELC (DE-TLC) המשופרת דיגיטלית המיושמת כדי לזהות את התפוקה של תרכובת על צלחת TLC באמצעות מצלמה דיגיטלית בשילוב עם אור UV. הס גם השווה את הבדלי העלויות בין שיטת HPTLC לשיטת DE-TLC והגיע למסקנה כי ניתן להשתמש בשיטת DE-TLC במעבדות תיכון ומכללות בגלל עלותה הזולה². עם זאת, העלות של שיטת TLC-densitometric עדיין הייתה יקרה, והפעלת אור אולטרה סגול דורשת הכשרה מקדימה מספקת למקרה שהמשתמשים עלולים להיחשף לקרינה אולטרה סגולה. לכן, בהתאם ל- TLC, רצוי לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה לכימות תפוקת המדגם.

המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול לגילוי הדגימה על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה, ופיתח מודל רגרסיה עם אמינות גבוהה (ערך ריבועי R גבוה) כדי למדוד את מידות הפסים ולאחר מכן לקבוע את התפוקה המורכבת. לבסוף, נמצא כי שיטת התאורה blue-LED היא בטוחה יחסית (לעומת שיטת גילוי UV), זולה (לעומת. GC, HPLC ו-HPTLC), וגישה יעילה (לעומת שיטת bioassay) לכימות תשואה.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי מתואר באמצעות lovastatin כדוגמה. לובסטטין הופק מאספרגילוס טראוס בן שבוע.

1. מיצוי תרכובת

הערה: לפרטים על מיצוי תרכובת, ראו איור 1.

1. תרבית אספרגילוס טראוס על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA, ראו טבלת חומרים) בינונית ב-30 מעלות צלזיוס.
2. ייבשו את התרבית בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העבירו את התרבית המיובשת לצינור של 50 מ"ל באמצעות פינצטה מעוקרת והוסיפו 15 מ"ל אתיל אצטט.
3. נערו את התערובת במרץ על ידי מערבולת במשך דקה אחת ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד.
4. סוניקו את התערובת באמצעות אמבט אולטראסוני של 40 קילוהרץ (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 40°C למשך שעה אחת.
5. סובבו את התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וסננו באמצעות נייר סינון של 11 מיקרומטר.
6. מוציאים את התסנין בנפח שווה של מים סטריליים במשפך מפריד.
7. לאחר הפרדת פאזה, אספו את השכבה האורגנית, ולאחר מכן התאדו במאייד סיבובי (ראו טבלת חומרים). ממיסים את השאריות ב-2 מ"ל של אתיל אצטט.

2. הפרדת התמצית הגולמית לפי עמודת ספיחה בפאזה רגילה (NP)

1. ארזו את העמודה עם ג'ל סיליקה NP כפאזה נייחת, והשתמשו ב-n-הקסאן:אתיל אצטט:חומצה טריפלואורואצטית (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) כשלב הנייד.
2. טען 2 מ"ל של התמצית (שלב 1) על העמודה והוסף את ממס הפאזה הנייד בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה כדי לחמוק מהתמצית.
   הערה: קצב הזרימה נשלט באופן ידני באמצעות stopcock.
3. אמת את השפכים על ידי TLC כדי לאשר את נוכחותו של lovastatin, ולאחר מכן להתאדות במאייד סיבובי ב 45 מעלות צלזיוס עד שהממס מוסר. צעד זה אורך כ-20-25 דקות.
4. ממיסים את השאריות ב-1 מ"ל של אתיל אצטט, ואז מערבבים עם נפח שווה של 1% חומצה טריפלואורואצטית.
5. צנטריפוגות התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ואוספים את השכבה האורגנית בצינור זכוכית חדש.

3. הכנה וטעינה של לוחות כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC)

1. יש לזהות 5 μL של דגימות ותקני לובסטטין (ראו טבלת חומרים) על קו הבסיס של לוח TLC באמצעות פיפטה נימית, ולהשאיר גבול של 1 ס"מ בצידי לוח TLC.
2. יבשו את צלחת ה- TLC במכסה אדים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הניחו את הצלחת בעדינות על ידי מלקחיים בתא זכוכית רוויה המכיל את ממס הפאזה הנייד. מכסים את התא במכסה זכוכית ומאפשרים לצלחת להתפתח במלואה.
4. הסר את הצלחת מהתא כאשר קו הממס מגיע ל -1 ס"מ מראש הצלחת.

4. ניתוח על ידי תאורת ה- LED הכחולה

1. סמן את קו הממס בעיפרון. יבשו את הצלחת במכסה האדים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. לאחר הייבוש, יש להשרות מיד את הצלחת בממס 10% H₂SO₄ , ולאחר מכן לייבש במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מניחים את הצלחת על לוח החימום עד להופעת הכתמים החומים. ודא שהצלחת אינה מחוממת יתר על המידה, מכיוון שהדבר עלול להקשות על הדמיה של לובסטטין.
4. העבירו את הלוחית לתאורת ה-LED הכחולה וסרקו באמצעות תוכנה חופשית תואמת (MiBio Fluo) (ראו טבלת חומרים).

5. הערכת תשואה לפי מודל הרגרסיה

1. מדוד את ממד הפסים באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).
2. צור מודל רגרסיה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים (ראה טבלת חומרים) המבוססת על הריכוזים היורדים של תקני לובסטטין, כולל 1 מ"ג/מ"ל, 0.75 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל ו-0.25 מ"ג/מ"ל.
3. החל את מודל הרגרסיה כדי להעריך את התשואה של הדגימות.

תוצאות

מחקר זה הציג את שיטת תאורת ה-LED הכחולה כדי להעריך את תפוקת התרכובות, ושיטה זו אומתה והושוותה לשיטות ביו-אסאי ו-UV שזוהו (טבלה 1). מודלי הרגרסיה פותחו על בסיס ממדי הפסים וריכוז התקנים לשלוש שיטות, בהתאמה, כדי לחזות את תפוקת הדגימות. ראשית, בתוצאות שיטת הביו-אסאי, ריבוע ה-R בין ממדי אזור ה?...

Discussion

המחקר הנוכחי תיאר גישה חדשה, תאורת ה-LED הכחולה, לכמת תרכובות ללא שימוש בציוד יקר ומתמחה, כגון שיטת HPTLC, HPLC ו-GC, והשיטה הושוותה לשיטות הביו-אסאי וה-UV שזוהו כדי להעריך את ביצועי הכימות. כתוצאה מכך, הוסק כי שיטת התאורה הכחולה-LED היא פרוטוקול בטוח ויעיל יחסית המשמש לכימות התפוקה של תרכובות ממוקדות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600