Estimando o rendimento de compostos na placa TLC através da técnica de iluminação Blue-LED

Resumo

O presente protocolo desenvolveu um método para estimar o rendimento de compostos na placa TLC utilizando a técnica de iluminação azul-LED. As vantagens dessa abordagem são que ela é segura, eficaz, barata e permite que o pesquisador meça várias amostras simultaneamente.

Resumo

A cromatografia em camada fina (TLC) é uma técnica analítica acessível que tem sido amplamente utilizada em pesquisas em química orgânica para quantificar o rendimento de amostras desconhecidas. O presente estudo desenvolveu um método eficaz, barato e seguro para estimar o rendimento de amostras em uma placa TLC utilizando o iluminador azul-LED. A lovastatina extraída de Aspergillus terreus foi o composto de exemplo utilizado no presente estudo. Modelos de regressão baseados no padrão de lovastatina foram utilizados para avaliar o rendimento de lovastatina. Três métodos foram comparados: bioensaio, detecção de UV e iluminação azul-LED. O resultado mostrou que o método de iluminação azul-LED é significativamente mais eficaz no tempo do que os métodos de detecção UV e bioensaio. Além disso, a iluminação LED-azul foi uma opção relativamente segura devido à preocupação com os riscos biológicos no método de bioensaio (por exemplo, infecção microbiana) e a exposição ultravioleta no método de detecção UV. Em comparação com os métodos caros que exigem instrumentos especializados e treinamento de longo prazo antes de trabalhar de forma independente, como GC, HPLC e HPTLC, o uso do iluminador blue-LED foi uma opção econômica para estimar o rendimento de amostras de uma placa TLC.

Introdução

A cromatografia em camada fina (TLC) é amplamente utilizada como técnica qualitativa e quantitativa no campo da química orgânica ^1,2,3. As principais vantagens do TLC são que ele fornece detecção rápida, requisitos de amostra flexíveis e não requer equipamentos especializados⁴. Até o momento, embora muitas abordagens avançadas tenham sido estabelecidas, o TLC ainda é o principal método para identificar amostras desconhecidas em uma mistura. No entanto, o desafio dessa abordagem é a falta de equipamentos seguros e baratos para quantificar o rendimento da amostra, especialmente para o desenvolvimento de laboratórios com orçamentos limitados. O presente estudo, portanto, teve como objetivo desenvolver um método eficiente, seguro e barato de combinação com CPT para estimar o rendimento das amostras.

Ao contrário do TLC de alta eficiência (HPTLC), da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e da cromatografia gasosa (GC) com requisitos rigorosos de amostra, demorado e envolvimento de várias etapas para o preparo da amostra^1,5, o TLC mostrou várias vantagens. Em primeiro lugar, para a preparação da amostra, a HPLC e a CG não podem detectar o extracto bruto porque o extracto bruto pode ligar a coluna de HPLC e GC. Em segundo lugar, quando as amostras não são adequadas aos raios UV (importante para a análise por HPLC) ou com baixa volatilidade (importante para a análise de CG), o TLC pode ser aplicado a essas amostras, e o uso de reagente de visualização torna as amostras isoladas visíveis em camadas finas ^6,7,8. Em terceiro lugar, para usuários em geral, HPLC e GC geralmente exigem um pré-treinamento de tempo relativamente longo antes de trabalhar de forma independente, em comparação com o TLC. Além disso, a análise quantitativa de TLC, conhecida como TLC de alto desempenho (HPTLC), pode digitalizar as informações em uma placa TLC com um scanner altamente sensível. No entanto, o custo do sistema HPTLC é relativamente caro. Como tal, o desenvolvimento de uma abordagem econômica e rápida para quantificar amostras na placa TLC é um tópico importante.

Métodos semelhantes foram desenvolvidos para quantificação do rendimento de TLC; por exemplo, Johnson⁹ relatou uma técnica que permite a quantificação das amostras em uma placa TLC usando um scanner de mesa conectado a um computador. Em 2001, El-Gindy et al.10 desenvolveram o método densitométrico TLC-, que foi utilizado para detectar o composto com densidade óptica, e a técnica também foi aplicada por Elkady et ^al.11. Em 2007, Hess² apresentou o método digitalmente aprimorado-TLC (DE-TLC) aplicado para detectar o rendimento de um composto em uma placa TLC usando uma câmera digital combinada com luz UV. Hess também comparou as diferenças de custo entre o método HPTLC e DE-TLC e concluiu que o método DE-TLC poderia ser usado em laboratórios de ensino médio e universitário devido ao seu custo acessível². No entanto, o custo do método densitométrico TLC ainda era caro, e a operação da luz ultravioleta requer pré-treinamento adequado no caso de os usuários ficarem expostos à radiação ultravioleta. Portanto, compatível com TLC, é desejável o desenvolvimento de um método eficiente, seguro e barato para quantificar o rendimento da amostra.

O presente estudo descreveu um protocolo para detecção da amostra em uma placa TLC utilizando o iluminador azul-LED, e desenvolveu um modelo de regressão com alta confiabilidade (alto valor R-quadrado) para medir as dimensões das bandas e, em seguida, determinar o rendimento do composto. Finalmente, verificou-se que o método de iluminação azul-LED é relativamente seguro (vs. Método de detecção UV), barato (vs. GC, HPLC e HPTLC) e abordagem eficaz (vs. método de bioensaio) para quantificação do rendimento.

Protocolo

O presente protocolo é descrito usando lovastatina como exemplo. A lovastatina foi extraída de Aspergillus terreus de uma semana de idade.

1. Extração composta

NOTA: Para obter detalhes sobre a extração de compostos, consulte a Figura 1.

1. Cultura de Aspergillus terreus no meio de ágar batata-dextrose (PDA, ver Tabela de Materiais) a 30 °C.
2. Secar a cultura a 40 °C durante 24 h. Transfira a cultura seca para um tubo de 50 mL usando pinças esterilizadas e adicione 15 mL de acetato de etila.
3. Agitar vigorosamente a mistura por vórtice durante 1 min e incubar durante 1 h a 40 °C com agitação a 200 rpm.
4. Sonicate a mistura usando um banho ultra-sônico de 40 kHz (ver Tabela de Materiais) a 40 °C por 1 h.
5. Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e filtrar através de um papel de filtro de 11 μm.
6. Extrair o filtrado com um volume igual de água estéril numa ampola separatória.
7. Após a separação de fases, recolha a camada orgânica e, em seguida, evapore num evaporador rotativo (ver Tabela de Materiais). Dissolver o resíduo em 2 mL de acetato de etila.

2. Separação do extracto bruto por coluna de adsorção de fase normal (NP)

1. Embale a coluna com sílica gel NP como fase estacionária e use n-hexano:acetato de etila:ácido trifluoroacético (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) como fase móvel.
2. Carregar 2 ml do extracto (passo 1) na coluna e adicionar o solvente de fase móvel a um caudal de 1 ml/min para eluír o extracto.
   NOTA: A taxa de fluxo foi controlada manualmente usando uma torneira.
3. Verificar o efluente por TLC para confirmar a presença de lovastatina e, em seguida, evaporar num evaporador rotativo a 45 °C até que o solvente seja removido. Este passo leva aproximadamente 20-25 min.
4. Dissolva o resíduo em 1 mL de acetato de etila e, em seguida, misture com um volume igual de ácido trifluoroacético a 1%.
5. Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e recolher a camada orgânica num novo tubo de vidro.

3. Preparação e carregamento de placas de cromatograma de camada fina (TLC)

1. Colocar 5 μL de amostras e padrões de lovastatina (ver Tabela de Materiais) na linha de base da placa TLC usando uma pipeta capilar, deixando uma borda de 1 cm nas laterais da placa TLC.
2. Seque a placa TLC em um exaustor por 5 minutos à temperatura ambiente.
3. Coloque a placa suavemente por pinça em uma câmara de vidro saturada contendo o solvente de fase móvel. Cubra a câmara com uma tampa de vidro e deixe a placa se desenvolver completamente.
4. Remova a placa da câmara quando a linha de solvente atingir 1 cm do topo da placa.

4. Análise pelo iluminador azul-LED

1. Marque a linha de solvente com um lápis. Seque a placa no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
2. Após a secagem, mergulhe imediatamente a placa em 10% de solvente H₂SO₄ e, em seguida, seque no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
3. Coloque a placa no painel de aquecimento até que as manchas marrons apareçam. Certifique-se de que a placa não esteja superaquecida, pois isso pode dificultar a visualização da lovastatina.
4. Transfira a placa para o iluminador de LED azul e digitalize usando um freeware compatível (MiBio Fluo) (consulte a Tabela de Materiais).

5. Estimativa de rendimento pelo modelo de regressão

1. Meça a dimensão das bandas usando o software ImageJ (consulte Tabela de materiais).
2. Estabeleça um modelo de regressão usando software de análise de dados e gráficos (ver Tabela de Materiais) com base nas concentrações decrescentes dos padrões de lovastatina, incluindo 1 mg/mL, 0,75 mg/mL, 0,5 mg/mL e 0,25 mg/mL.
3. Aplicar o modelo de regressão para estimar o rendimento das amostras.

Resultados

Este estudo apresentou o método de iluminação azul-LED para estimar o rendimento de compostos, e este método foi validado e comparado com os métodos de bioensaio e UV-detectados (Tabela 1). Os modelos de regressão foram desenvolvidos com base nas dimensões das bandas e concentração dos padrões para três métodos, respectivamente, para predizer o rendimento das amostras. Primeiramente, nos resultados do método de bioensaio, o R-quadrado entre as dimensões da zona de inibição e os padrões d...

Discussão

O presente estudo descreveu uma nova abordagem, o iluminador azul-LED, para quantificar compostos sem o uso de equipamentos caros e especializados, como HPTLC, HPLC e GC, e o método foi comparado com os métodos de bioensaio e UV detectados para avaliar o desempenho de quantificação. Como resultado, concluiu-se que o método de iluminação azul-LED é um protocolo relativamente seguro e eficaz usado para quantificar o rendimento de compostos alvo na placa TLC.

Estudos prévios relataram v?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600