TLC Plakasındaki Bileşiklerin Veriminin Mavi-LED Aydınlatma Tekniği ile Tahmin Edilmesi

Özet

Mevcut protokol, mavi-LED aydınlatma tekniğini kullanarak TLC plakasındaki bileşiklerin verimini tahmin etmek için bir yöntem geliştirdi. Bu yaklaşımın avantajları, güvenli, etkili, ucuz olması ve araştırmacının aynı anda birden fazla örneği ölçmesine izin vermesidir.

Özet

İnce tabaka kromatografisi (TLC), bilinmeyen numunelerin verimini ölçmek için organik kimya araştırmalarında yaygın olarak kullanılan erişilebilir bir analitik tekniktir. Bu çalışma, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanarak bir TLC plakasındaki numunelerin verimini tahmin etmek için etkili, ucuz ve güvenli bir yöntem geliştirdi. Aspergillus terreus'tan ekstrakte edilen Lovastatin, bu çalışmada kullanılan örnek bileşiktir. Lovastatin verimini değerlendirmek için lovastatin standardına dayanan regresyon modelleri kullanılmıştır. Üç yöntem karşılaştırıldı: biyotahlil, UV algılama ve mavi-LED aydınlatma. Sonuç, mavi-LED aydınlatma yönteminin UV algılama ve biyotahlil yöntemlerinden önemli ölçüde daha fazla zaman etkili olduğunu göstermiştir. Ek olarak, mavi-LED aydınlatma, biyotahlil yöntemindeki biyolojik tehlikeler (örneğin, mikrobiyal enfeksiyon) ve UV algılama yönteminde ultraviyole maruziyeti endişesi nedeniyle nispeten güvenli bir seçenekti. GC, HPLC ve HPTLC gibi bağımsız olarak çalışmadan önce özel cihazlar ve uzun süreli eğitim gerektiren pahalı yöntemlerle karşılaştırıldığında, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanmak, bir TLC plakasından numunelerin verimini tahmin etmek için ekonomik bir seçenekti.

Giriş

İnce tabaka kromatografisi (TLC), organik kimya alanında kalitatif ve kantitatif bir teknik olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ^1,2,3. TLC'nin başlıca avantajları, hızlı algılama, esnek numune gereksinimleri sağlaması ve özel ekipman gerektirmemesidir⁴. Bugüne kadar, birçok gelişmiş yaklaşım oluşturulmuş olmasına rağmen, TLC hala bir karışımdaki bilinmeyen numuneleri tanımlamak için ana yöntemdir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın zorluğu, özellikle sınırlı bütçeli laboratuvarlar geliştirmek için numune verimini ölçmek için güvenli ve ucuz ekipman eksikliğidir. Bu nedenle bu çalışma, numunelerin verimini tahmin etmek için TLC ile birleşen verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmeyi amaçlamıştır.

Yüksek performanslı TLC (HPTLC), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz kromatografisinin (GC) aksine, katı numune gereksinimleri, zaman alıcı ve numune hazırlama^1,5 için çok adımlı katılım^, TLC çeşitli avantajlar göstermiştir. İlk olarak, numune hazırlama için, HPLC ve GC ham ekstraktı tespit edemez, çünkü ham ekstrakt HPLC ve GC sütununu tıkayabilir. İkincisi, numuneler UV açısından uygun olmadığında (HPLC analizi için önemli) veya düşük uçuculukta (GC analizi için önemli), bu numunelere TLC uygulanabilir ve görselleştirme reaktifinin kullanılması, izole edilmiş numuneleri ince tabakalar üzerinde görünür kılar ^6,7,8. Üçüncüsü, genel kullanıcılar için, HPLC ve GC genellikle TLC'ye kıyasla bağımsız olarak çalışmadan önce nispeten uzun bir ön eğitim gerektirir. Ek olarak, yüksek performanslı TLC (HPTLC) olarak bilinen nicel TLC analizi, son derece hassas bir tarayıcıyla TLC plakasındaki bilgileri dijitalleştirebilir. Bununla birlikte, HPTLC sisteminin maliyeti nispeten pahalıdır. Bu nedenle, TLC plakasındaki numuneleri ölçmek için uygun maliyetli ve hızlı bir yaklaşım geliştirmek önemli bir konudur.

TLC verim ölçümü için benzer yöntemler geliştirilmiştir; Örneğin, Johnson⁹, bir bilgisayara bağlı düz yataklı bir tarayıcı kullanarak TLC plakasındaki numunelerin miktarının belirlenmesine izin veren bir teknik bildirmiştir. 2001 yılında, El-Gindy ve ark.10, bileşiği optik yoğunlukla tespit etmek için kullanılan TLC-dansitometrik yöntemini geliştirdi ve teknik Elkady ve ^ark.11 tarafından da uygulandı. 2007 yılında Hess², UV ışığı ile birleştirilmiş bir dijital kamera kullanarak TLC plakası üzerindeki bir bileşiğin verimini tespit etmek için uygulanan dijital olarak geliştirilmiş TLC (DE-TLC) yöntemini sundu. Hess ayrıca HPTLC ve DE-TLC yöntemi arasındaki maliyet farklarını karşılaştırdı ve DE-TLC yönteminin uygun maliyetli olması nedeniyle lise ve üniversite laboratuvarlarında kullanılabileceği sonucuna vardı². Bununla birlikte, TLC-densitometrik yöntemin maliyeti hala pahalıydı ve ultraviyole ışığın çalışması, kullanıcıların ultraviyole radyasyona maruz kalabileceği durumlarda yeterli ön eğitim gerektiriyordu. Bu nedenle, TLC ile uyumlu, numune verimini ölçmek için verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmek arzu edilir.

Bu çalışma, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanarak bir TLC plakası üzerindeki numuneyi tespit etmek için bir protokol tanımladı ve bantların boyutlarını ölçmek ve ardından bileşik verimini belirlemek için yüksek güvenilirliğe (yüksek R-kare değeri) sahip bir regresyon modeli geliştirdi. Son olarak, mavi-LED aydınlatma yönteminin nispeten güvenli olduğu bulunmuştur (vs. UV algılama yöntemi), ucuz (vs. GC, HPLC ve HPTLC) ve verim ölçümü için etkili (biyotahlil yöntemine karşı) yaklaşım.

Protokol

Mevcut protokol örnek olarak lovastatin kullanılarak açıklanmıştır. Lovastatin, bir haftalık Aspergillus terreus'tan çıkarıldı.

1. Bileşik ekstraksiyon

NOT: Bileşik ekstraksiyonu ile ilgili ayrıntılar için lütfen Şekil 1'e bakınız.

1. Kültür Aspergillus terreus patates dekstroz agar üzerinde (PDA, bakınız Malzeme Tablosu) 30 °C'de orta.
2. Kültürü 24 saat boyunca 40 °C'de kurutun. Kurutulmuş kültürü sterilize cımbız kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 15 mL etil asetat ekleyin.
3. Karışımı 1 dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice çalkalayın ve 200 rpm'de çalkalayarak 40 ° C'de 1 saat inkübe edin.
4. 1 saat boyunca 40 ° C'de 40 kHz ultrasonik banyo ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak karışımı sonikleştirin.
5. Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj yapın ve 11 μm filtre kağıdından süzün.
6. Filtrasyonu bir ayırma hunisinde eşit miktarda steril su ile çıkarın.
7. Faz ayırmadan sonra, organik tabakayı toplayın ve ardından döner bir evaporatörde buharlaştırın (bkz. Kalıntıyı 2 mL etil asetat içinde çözün.

2. Ham ekstraktın normal faz (NP) adsorpsiyon sütunu ile ayrılması

1. Kolonu sabit faz olarak NP silika jel ile paketleyin ve mobil faz olarak n-hekzan: etil asetat: trifloroasetik asit (H: E: T; 80: 20: 0.1, v / v / v) kullanın.
2. Ekstraktın 2 mL'sini (adım 1) kolona yükleyin ve ekstraktı ertelemek için mobil faz çözücüyü 1 mL / dak akış hızında ekleyin.
   NOT: Akış hızı bir stopcock kullanılarak manuel olarak kontrol edildi.
3. Lovastatinin varlığını doğrulamak için atık suyu TLC ile doğrulayın ve ardından çözücü çıkarılana kadar 45 ° C'de döner bir evaporatörde buharlaştırın. Bu adım yaklaşık 20-25 dakika sürer.
4. Kalıntıyı 1 mL etil asetat içinde çözün ve daha sonra% 1'lik eşit hacimli trifloroasetik asit ile karıştırın.
5. Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve organik tabakayı yeni bir cam tüp içinde toplayın.

3. İnce tabakalı kromatogram (TLC) plakaların hazırlanması ve yüklenmesi

1. Bir kılcal pipet kullanarak TLC plakasının taban çizgisine 5 μL numune ve lovastatin standartlarını (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin ve TLC plakasının yanlarında 1 cm'lik bir kenarlık bırakın.
2. TLC plakasını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir davlumbazda kurulayın.
3. Plakayı forseps ile nazikçe mobil faz çözücüyü içeren doymuş bir cam hazneye yerleştirin. Odayı bir cam kapakla örtün ve plakanın tamamen gelişmesine izin verin.
4. Solvent hattı plakanın üstünden 1 cm'ye ulaştığında plakayı odadan çıkarın.

4. Mavi-LED aydınlatıcı ile analiz

1. Çözücü çizgisini bir kalemle işaretleyin. Plakayı davlumbazda oda sıcaklığında 10 dakika kurutun.
2. Kuruduktan sonra, plakayı hemen% 10_H2SO₄ çözücüye batırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca davlumbazda kurutun.
3. Kahverengi lekeler görünene kadar plakayı ısıtma paneline yerleştirin. Plakanın aşırı ısınmadığından emin olun, çünkü bu lovastatinin görselleştirilmesini zorlaştırabilir.
4. Plakayı mavi-LED aydınlatıcıya aktarın ve uyumlu bir ücretsiz yazılım (MiBio Fluo) kullanarak tarayın ( bkz.

5. Regresyon modeli ile verim tahmini

1. ImageJ yazılımını kullanarak bantların boyutunu ölçün (bkz.
2. 1 mg / mL, 0.75 mg / mL, 0.5 mg / mL ve 0.25 mg / mL dahil olmak üzere lovastatin standartlarının azalan konsantrasyonlarına dayanan veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak bir regresyon modeli oluşturun (bkz.
3. Örneklerin verimini tahmin etmek için regresyon modelini uygulayın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, bileşiklerin verimini tahmin etmek için mavi-LED aydınlatma yöntemi sunulmuş ve bu yöntem biyotahlil ve UV ile saptanan yöntemlerle doğrulanarak karşılaştırılmıştır (Tablo 1). Regresyon modelleri, numunelerin verimini tahmin etmek için sırasıyla üç yöntem için bantların boyutlarına ve standartların konsantrasyonuna dayanarak geliştirilmiştir. İlk olarak, biyotahlil yönteminin sonuçlarında, inhibisyon bölgesinin boyutları ile lovastatin standartları aras...

Tartışmalar

Bu çalışmada, HPTLC, HPLC ve GC yöntemi gibi pahalı ve özel ekipman kullanmadan bileşikleri ölçmek için yeni bir yaklaşım olan mavi-LED aydınlatıcı tanımlanmıştır ve yöntem, nicelleştirme performansını değerlendirmek için biyotahlil ve UV tarafından tespit edilen yöntemlerle karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, mavi-LED aydınlatma yönteminin, TLC plakası üzerinde hedeflenen bileşiklerin verimini ölçmek için kullanılan nispeten güvenli ve etkili bir protokol olduğu sonucuna var...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600