Stima della resa dei composti sulla piastra TLC tramite la tecnica di illuminazione a LED blu

Riepilogo

Il presente protocollo ha sviluppato un metodo per stimare la resa dei composti sulla piastra TLC utilizzando la tecnica di illuminazione blu-LED. I vantaggi di questo approccio sono che è sicuro, efficace, economico e consente al ricercatore di misurare più campioni contemporaneamente.

Abstract

La cromatografia su strato sottile (TLC) è una tecnica analitica accessibile che è stata ampiamente utilizzata nella ricerca di chimica organica per quantificare la resa di campioni sconosciuti. Il presente studio ha sviluppato un metodo efficace, economico e sicuro per stimare la resa dei campioni su una piastra TLC utilizzando l'illuminatore blu-LED. La lovastatina estratta da Aspergillus terreus è stato il composto di esempio utilizzato nel presente studio. Sono stati utilizzati modelli di regressione basati sullo standard di lovastatina per valutare la resa di lovastatina. Sono stati confrontati tre metodi: biotest, rilevamento UV e illuminazione blu-LED. Il risultato ha mostrato che il metodo di illuminazione blu-LED è significativamente più efficace in termini di tempo rispetto ai metodi di rilevamento UV e di bioanalisi. Inoltre, l'illuminazione blu-LED era un'opzione relativamente sicura a causa della preoccupazione dei rischi biologici nel metodo di bioanalisi (ad esempio, infezione microbica) e dell'esposizione ai raggi ultravioletti nel metodo di rilevamento UV. Rispetto ai metodi costosi che richiedono strumenti specializzati e formazione a lungo termine prima di lavorare in modo indipendente, come GC, HPLC e HPTLC, l'utilizzo dell'illuminatore blu-LED era un'opzione economica per stimare la resa dei campioni da una piastra TLC.

Introduzione

La cromatografia su strato sottile (TLC) è ampiamente utilizzata come tecnica qualitativa e quantitativa nel campo della chimica organica ^1,2,3. I principali vantaggi di TLC sono che fornisce un rilevamento rapido, requisiti di campionamento flessibili e non richiede attrezzature specializzate⁴. Ad oggi, anche se sono stati stabiliti molti approcci avanzati, TLC è ancora il metodo principale per identificare campioni sconosciuti in una miscela. Tuttavia, la sfida di questo approccio è la mancanza di attrezzature sicure e poco costose per quantificare la resa del campione, in particolare per lo sviluppo di laboratori con budget limitati. Il presente studio, quindi, mirava a sviluppare un metodo efficiente, sicuro ed economico combinato con TLC per stimare la resa dei campioni.

A differenza della TLC ad alte prestazioni (HPTLC), della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e della gascromatografia (GC) con requisiti rigorosi di campionamento, dispendiosi in termini di tempo e coinvolgimento di multistep per la preparazione del campione^1,5, TLC ha mostrato diversi vantaggi. In primo luogo, per la preparazione del campione, l'HPLC e il GC non sono in grado di rilevare l'estratto grezzo perché l'estratto grezzo può ostruire la colonna di HPLC e GC. In secondo luogo, quando i campioni non sono adatti ai raggi UV (importante per l'analisi HPLC) o con bassa volatilità (importante per l'analisi GC), TLC può essere applicato a questi campioni e l'uso del reagente di visualizzazione rende i campioni isolati visibili su strati sottili ^6,7,8. In terzo luogo, per gli utenti generici, HPLC e GC richiedono generalmente un tempo relativamente lungo di pre-formazione prima di lavorare in modo indipendente, rispetto a TLC. Inoltre, l'analisi quantitativa TLC, nota come TLC ad alte prestazioni (HPTLC), può digitalizzare le informazioni su una piastra TLC con uno scanner altamente sensibile. Tuttavia, il costo del sistema HPTLC è relativamente costoso. Pertanto, lo sviluppo di un approccio economico e rapido per quantificare i campioni sulla piastra TLC è un argomento importante.

Metodi simili sono stati sviluppati per la quantificazione della resa TLC; ad esempio, Johnson⁹ ha riportato una tecnica che consente la quantificazione dei campioni su una piastra TLC utilizzando uno scanner piano collegato a un computer. Nel 2001, El-Gindy et al.10 hanno sviluppato il metodo TLC-densitometrico, che è stato utilizzato per rilevare il composto con densità ottica, e la tecnica è stata applicata anche da Elkady et ^al.11. Nel 2007, Hess² ha presentato il metodo digitally enhanced-TLC (DE-TLC) applicato per rilevare la resa di un composto su una piastra TLC utilizzando una fotocamera digitale combinata con luce UV. Hess ha anche confrontato le differenze di costo tra HPTLC e metodo DE-TLC e ha concluso che il metodo DE-TLC potrebbe essere utilizzato nei laboratori delle scuole superiori e universitari a causa del suo costo accessibile². Tuttavia, il costo del metodo TLC-densitometrico era ancora costoso e il funzionamento della luce ultravioletta richiede un'adeguata pre-formazione nel caso in cui gli utenti potessero essere esposti alle radiazioni ultraviolette. Pertanto, compatibilmente con TLC, è auspicabile lo sviluppo di un metodo efficiente, sicuro ed economico per quantificare la resa del campione.

Il presente studio ha descritto un protocollo per rilevare il campione su una piastra TLC utilizzando l'illuminatore blu-LED e ha sviluppato un modello di regressione ad alta affidabilità (alto valore R-quadrato) per misurare le dimensioni delle bande e quindi determinare la resa del composto. Infine, è stato riscontrato che il metodo di illuminazione blu-LED è relativamente sicuro (vs. Metodo di rilevamento UV), economico (vs. GC, HPLC e HPTLC) e approccio efficace (rispetto al metodo di saggio biologico) per la quantificazione della resa.

Protocollo

Il presente protocollo è descritto usando la lovastatina come esempio. La lovastatina è stata estratta da Aspergillus terreus di una settimana.

1. Estrazione del composto

NOTA: Per i dettagli sull'estrazione dei composti, vedere la Figura 1.

1. Coltura Aspergillus terreus su agar destrosio di patate (PDA; vedi tabella dei materiali) terreno a 30 °C.
2. Asciugare la coltura a 40 °C per 24 ore. Trasferire la coltura essiccata in una provetta da 50 ml utilizzando una pinzetta sterilizzata e aggiungere 15 ml di acetato di etile.
3. Agitare vigorosamente la miscela a vortice per 1 minuto e incubare per 1 ora a 40 °C agitando a 200 giri/min.
4. Sonicare la miscela utilizzando un bagno ad ultrasuoni a 40 kHz (vedi Tabella dei materiali) a 40 °C per 1 ora.
5. Centrifugare la miscela a 5.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente e filtrare attraverso una carta da filtro da 11 μm.
6. Estrarre il filtrato con un volume uguale di acqua sterile in un imbuto separatore.
7. Dopo la separazione di fase, raccogliere lo strato organico e quindi evaporare in un evaporatore rotante (vedere Tabella dei materiali). Sciogliere il residuo in 2 ml di acetato di etile.

2. Separazione dell'estratto grezzo mediante colonna di adsorbimento in fase normale (NP)

1. Impacchettare la colonna con gel di silice NP come fase stazionaria e utilizzare n-esano:acetato di etile:acido trifluoroacetico (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) come fase mobile.
2. Caricare 2 mL dell'estratto (fase 1) sulla colonna e aggiungere il solvente in fase mobile ad una portata di 1 mL/min per eluire l'estratto.
   NOTA: La portata è stata controllata manualmente utilizzando un rubinetto.
3. Verificare l'effluente mediante TLC per confermare la presenza di lovastatina, quindi evaporare in un evaporatore rotante a 45 °C fino a quando il solvente non viene rimosso. Questo passaggio richiede circa 20-25 minuti.
4. Sciogliere il residuo in 1 ml di acetato di etile e quindi mescolare con un volume uguale di acido trifluoroacetico all'1%.
5. Centrifugare la miscela a 5.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente e raccogliere lo strato organico in un nuovo tubo di vetro.

3. Preparazione e caricamento di lastre per cromatogramma su strato sottile (TLC)

1. Puntare 5 μL di campioni e standard di lovastatina (vedere Tabella dei materiali) sulla linea di base della piastra TLC utilizzando una pipetta capillare, lasciando un bordo di 1 cm sui lati della piastra TLC.
2. Asciugare la piastra TLC in una cappa aspirante per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Posizionare delicatamente la piastra mediante una pinza in una camera di vetro satura contenente il solvente di fase mobile. Coprire la camera con un coperchio di vetro e lasciare che la piastra si sviluppi completamente.
4. Rimuovere la piastra dalla camera quando la linea del solvente raggiunge 1 cm dalla parte superiore della piastra.

4. Analisi mediante illuminatore blu-LED

1. Segna la linea del solvente con una matita. Asciugare la piastra nella cappa aspirante per 10 minuti a temperatura ambiente.
2. Dopo l'essiccazione, immergere immediatamente la piastra in solvente 10% H₂SO₄ , quindi asciugare nella cappa aspirante per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Posizionare la piastra sul pannello riscaldante fino a quando non compaiono le macchie marroni. Assicurarsi che la piastra non sia surriscaldata, poiché ciò potrebbe rendere difficile la visualizzazione della lovastatina.
4. Trasferire la piastra sull'illuminatore blu-LED e scansionarla utilizzando un freeware compatibile (MiBio Fluo) (vedi Tabella dei materiali).

5. Stima della resa mediante il modello di regressione

1. Misurare la dimensione delle bande utilizzando il software ImageJ (vedere Tabella dei materiali).
2. Stabilire un modello di regressione utilizzando software di analisi dei dati e grafici (vedere Tabella dei materiali) basato sulle concentrazioni decrescenti degli standard di lovastatina, tra cui 1 mg / ml, 0,75 mg / ml, 0,5 mg / ml e 0,25 mg / ml.
3. Applicare il modello di regressione per stimare la resa dei campioni.

Risultati

Questo studio ha presentato il metodo di illuminazione blu-LED per stimare la resa dei composti, e questo metodo è stato convalidato e confrontato con i metodi di bioanalisi e rilevati UV (Tabella 1). I modelli di regressione sono stati sviluppati sulla base delle dimensioni delle bande e della concentrazione degli standard per tre metodi, rispettivamente, per prevedere la resa dei campioni. In primo luogo, nei risultati del metodo di bioanalisi, il quadrato R tra le dimensioni della zona di inibizione ...

Discussione

Il presente studio ha descritto un nuovo approccio, l'illuminatore blu-LED, per quantificare i composti senza utilizzare apparecchiature costose e specializzate, come HPTLC, HPLC e metodo GC, e il metodo è stato confrontato con il saggio biologico e i metodi rilevati dai raggi UV per valutare le prestazioni di quantificazione. Di conseguenza, si è concluso che il metodo di illuminazione blu-LED è un protocollo relativamente sicuro ed efficace utilizzato per quantificare la resa di composti mirati sulla piastra TLC.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600