יצירה, הגבלה והתבוננות בנמטיקה פעילה מבוססת מיקרוטובולים

Summary

מוצגות כאן שיטות להכנת נמטיקה פעילה ממיקרוטובולים ומנועי קינסין, כולל הכנה ובנייה של חלבונים ושימוש בבארות לכליאה נמטית פעילה.

Abstract

היווצרות פאזות פעילות מבוססות ביופולימרים הפכה לטכניקה חשובה עבור חוקרים המעוניינים לחקור את התחום המתפתח של גבישים נוזליים פעילים ואת תפקידיהם האפשריים בביולוגיה של התא. מערכות חדשניות אלה מורכבות מתת-יחידות המונעות על ידי עצמן הצורכות אנרגיה באופן מקומי, ומייצרות נוזל דינמי מחוץ לשיווי משקל. כדי ליצור את שלב הגביש הנוזלי הפעיל המתואר בדוח זה, רכיבי חלבון מטוהרים כולל ביופולימרים ומנועים מולקולריים משולבים, והפאזה הנמטית הפעילה נוצרת באופן ספונטני בנוכחות אדנוזין טריפוספט (ATP). כדי לבחון את המצב הנמטי, החומר חייב להיות מוגבל בגיאומטריה מתאימה למיקרוסקופיה בצפיפות גבוהה מספיק. מאמר זה מתאר שתי שיטות שונות להיווצרות פאזה נמטית פעילה באמצעות מיקרוטובולים ומנועי קינסין: הרכבה של שכבה פעילה דו-ממדית בממשק שמן ומים והרכבה תחת שכבת שמן באמצעות באר אלסטומרית. מתוארות גם טכניקות להכנסת החומר הפעיל לבארות קטנות בצורות שונות.

Introduction

נוזלים פעילים מורכבים מחלקיקים מונעי אנרגיה או מיסודות השואבים דלק מסביבתם המקומית. בתנאים הנכונים, האלמנטים הפעילים התנועתיים האלה יכולים לפעול באופן קולקטיבי כדי לייצר דינמיקה של נוזלים מתפתחים על פני קני מידה ארוכים של אורך. ישנן מגוון דוגמאות להתנהגות פאזה כזו מחוץ לשיווי משקל בספרות וניתן למצוא פאזות פעילות על פני הספקטרום של מערכות חיים. כמה דוגמאות בולטות הן מושבות של חיידקים¹, יריעות תאים ^2,3, ונחילה או נחיל של אורגניזמים ^4,5. שלבים פעילים נחקרו בהרחבה גם בשלבים מעובים של חוטים ציטוסקטליים, בין אם כחלק מתא⁶ או במערכות סינתטיות שנועדו לעשות שימוש ברכיבים שחולצו ביולוגית ^7,8,9. סידור גבישי נוזלי והיווצרות פגמים טופולוגיים הן במערכות טבעיות והן במערכות סינתטיות המורכבות מתמציות ביולוגיות מעניינים במיוחד את קהילת המחקר. בשנים האחרונות, קבוצות מחקר בחנו מערכות כאלה, את התכונות הפיזיקליות הבסיסיות שלהן ואת הרלוונטיות שלהן לביולוגיה 2,3,10,11.

מאמר זה מתמקד בהיווצרות המצב הנמטי הפעיל משילוב של מיקרוטובולים וחלבונים מוטוריים קינזיניים. הגביש הנוזלי הנמטי המסורתי הוא שלב שיווי משקל של חומר שבו המולקולות המרכיבות מציגות סדר אוריינטלי. לדוגמה, נוזל המורכב ממולקולות דמויות מוט קשיחות יחסית עשוי להציג הן את הפאזה הנמטית והן, בטמפרטורות גבוהות יותר, פאזת נוזל איזוטרופית לא מכוונת¹². הדוגמה הניסויית הראשונה של פאזה נמטית פעילה פותחה על ידי Sanchez et al.13, תוך התאמת ניסוי חוץ גופי ^{מוקדם יותר 14} שבו אשכולות של חלבונים מוטוריים שימשו ליצירת תנועת גזירה בין צרורות מיקרוטובולים שכנים. כאשר מערכת מיקרוטובולים זו הוגבלה לשכבה דקה, נוצר סדר נמטי ספונטני. בשנים האחרונות, המצב הנמטי הפעיל נחקר באינטנסיביות על ידי מספר קבוצות מחקר^{ניסיוניות של 15,16} ו-17,18 קבוצות מחקר תיאורטיות^, תוך התמקדות בתופעות כגון טורבולנציה פעילה - מצב שבו הנוזל מייצר זרימות כאוטיות מונעות עצמית ¹⁹ - ופגמים טופולוגיים ניידים. מאמר זה מתאר שיטות להכין וליצור את המצב הנמטי הפעיל ממיקרוטובולים ומנועי קינסין בגאומטריות ניסיוניות שונות. ראשית, מתוארות שיטות הכנה לפתרונות הרכיבים השונים, ואחריהן שיטות ליצירת הנמטיקה הפעילה באמצעות שתי גיאומטריות שונות של תאי זרימה. מוצגות תוצאות הדמיה אופייניות. לבסוף, מתוארות שיטות להגבלת הנמטי הפעיל בבארות ובתעלות.

Protocol

1. הכנת החומר הפעיל

הערה: הנמטיקה הפעילה הדו-ממדית מורכבת בתהליך בן שלושה שלבים. ראשית, מכינים שתי תמיסות נפרדות: א) מיקרוטובולים פולימריים ומיוצבים וב) MIX (תמיסה המכילה מנועי קינזין). אלה משולבים והפעילות מתחילה עם הוספת אדנוזין טריפוספט (ATP). לאחר מכן החומר מוגבל בגיאומטריה מתאימה, כך שצפיפותו גבוהה מספיק כדי שסדר נמטי יתגלה. פרוטוקולים כלולים להכנת כל הרכיבים הדרושים וכיצד להרכיב את השלב הפעיל.

1. הכנת אשכול חלבונים מוטוריים קינסין
   1. ניתן לבטא ולטהר חלבונים מוטוריים רקומביננטיים K401-BIO (מנועי K401) מ-Escherichia coli בהתאם לפרוטוקול של אדגר ק. יאנג²⁰.
      הערה: חלבוני מנוע K401-BIO הם דימריים ומורכבים משני ראשים המחוברים בגבעול סלילי. המנועים סופקו על ידי מתקן הביו-חומרים של ברנדייס ושימשו כפי שדווח בעבר¹⁶. לצורך יצירת נמטי פעיל, מולקולות הקינזין עוברות ביוטינילציה ולאחר מכן מחוברות באמצעות קישור סטרפטווידין ליצירת צבירי קינזין של עד ארבעה מנועים 13,15,21,22^. כדאי לבטא את הקינזין באמצעות תג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
   2. לאחר טיהור ודגירה של סטרפטווידין ומנועים על קרח למשך 40 דקות, הקפיאו את מנועי K401 בחנקן נוזלי ב-5 μL aliquots בריכוז סופי של 0.7 מ"ג/מ"ל, ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן. הפשירו בעדינות את הקינזין בעת הצורך ואל תקפיאו מחדש.
   3. הכן אשכולות של קינזין עם תווית ביוטין (KSA) על ידי ערבוב 24 vol% של מנועי K401 של 0.7 מ"ג/מ"ל, 27 vol% של 0.325 מ"ג/מ"ל סטרפטאבידין, ו-3 vol% של 5 mM dithiothreitol (DTT) (למניעת צבירה) ב-4 °C ב-46 vol% M2B buffer (צינורות 80 mM [1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, pH 6.8], 2 mM MgCl₂, ו-1 mM EGTA [אתילן גליקול-ביס(β-אמינואתיל אתר)-N, N,N′,N′-חומצה טטראקטית]). תנו ל-KSA לדגור על הקרח במשך 40 דקות.
2. הכנת תמיסת מיקרוטובול
   הערה: גואנוזין-5'-[(α,β)-מתילנו]טריפוספט, מלח נתרן (GMPCPP) הוא אנלוגיה הניתנת להידרוליזה איטית של גואנוזין טריפוספט (GTP), ומיקרוטובולים הנוצרים בנוכחות GMPCPP נוקשים פי שלושה ממיקרוטובולים GTP²³ וקצרים יותר. השימוש במיקרוטובולים קצרים ונוקשים הוא חיובי להיווצרות השלב הנמטי הפעיל, שכן גורמים אלה משתלבים יחד כדי לקדם סידור גבישי נוזלי.
   1. פולימריזציה של טובולין מחזורי ללא תווית (99%, ראו טבלת חומרים) באמצעות 0.6 mM GMPCPP בריכוז טובולין של 6 מ"ג/מ"ל.
      הערה: טובולין באיכות גבוהה יכול גם להיות מטוהר ממוח בקר או חזיר בעקבות פרוטוקולים מבוססים או מתקבל ממקור אמין אחר כגון מתקן Brandeis Biomaterials שבו ניתן לשלוח חומרים קפואים כדי למנוע נזק. לטיהור טובולין ממוח בקר, עיין בפרוטוקול שפורסם על ידי Bate et ^al.24. לטיהור טובולין ממוח חזירי, עיין בפרוטוקולים שפורסמו מ- Castoldi et al.25 ו- Tayar et ^al.26.
   2. כהכנה לפילמור, הכינו אמבט חום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וקיררו מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. שלב את תמיסת הטובולין ללא תווית במאגר M2B (שלב 1.1.3) בצינור אולטרה-צנטריפוגה של 500 μL עם טובולין עם 4 מול% רובולין עם תווית רודמין (ראה טבלת חומרים) כדי לייצר 4% מיקרוטובולים מסומנים לאחר פילמור.
   3. בדוק את ריכוז הטובולין באמצעות מבחן ברדפורד²⁷. ריכוז הטובולין הכולל בצינור הצנטריפוגה צריך להיות 6.5-6.9 מ"ג/מ"ל.
   4. דגרו את תערובת הטובולין על קרח למשך 10 דקות ואולטרה-צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-352,700 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. שלב זה מסיר טובולין לא מתפקד, אשר יהיה גלולה.
   5. באמצעות פיפטה, חלצו בזהירות את הסופר-נטנט המכיל טובולין פונקציונלי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף GMPCPP לריכוז סופי של 0.6 mM כדי לגרום לפילמור טובולין ו- DTT לריכוז סופי של 1 mM כדי למנוע הצטברות חלבונים.
   6. דגירה של התערובת באמבט החום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה שוב למשך 10 דקות בטמפרטורה של 14,000 x גרם בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט, ולאחר מכן דלל את הכדור עם חיץ M2B כדי להגיע לריכוז מיקרוטובול סופי של 6 מ"ג/מ"ל.
      הערה: ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות לפחות לפני השימוש.
   7. כדי לבדוק שהמיקרוטובולים עברו פולימריזציה מוצלחת, דיללו 1 μL מתמיסת המיקרוטובול 100:1 עם חיץ M2B ופיפטה על שקופית מיקרוסקופ. יש לכסות בכיסוי להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) עם עדשה אובייקטיבית של פי 40.
      הערה: אורכי גל של עירור ופליטה נבחרים על פי הסימון הפלואורסצנטי המשמש על המיקרוטובולים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בתיוג רודמין (ראה שלב 1.2.2), כך שההדמיה מתבצעת באמצעות רצועת עירור של 515-560 ננומטר ומסנן מעבר ארוך של 590 ננומטר. איור 1 מציג דוגמה מייצגת.
   8. לאחר השלמת הפימור, יש להקפיא את המיקרוטובולים כ-2 μL aliquots בחנקן נוזלי ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (במידת הצורך).
3. הכנת MIX
   הערה: MIX היא תמיסה מימית הכוללת את אשכולות קינזין-סטרפטווידין (KSA). תערובת מוכנה צריכה להיות מאוחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ב-4 μL aliquots לפני הניסוי. כאשר MIX משולב עם ATP ותמיסת המיקרוטובול המתוארת בשלב 1.2 בטמפרטורת החדר, מתחילה הפעילות. MIX מוכן כדלקמן^13,19.
   1. הכינו תמיסה למניעת דהייה פלואורסצנטית (ANTIFADE) על ידי ערבוב שתי תמיסות נוגדות חמצון. יש לערבב את AO1 (250 mM DTT, 65 mM קטלאז) ו-AO2 (קטלאז 750 μM, 3 mM גלוקוז אוקסידאז) ביחס נפח של 1:1. כלול 20 mM Trolox, נוגד חמצון נוסף המשמש להפחתת נזק שנגרם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
   2. הכינו את MIX על ידי הכנת תמיסה של KSA (המתוארת בשלב 1.1.3) הכוללת 6 wt% 20 kDa פוליאתילן גליקול (PEG) כדי לגרום לקשירת המיקרוטובולים, 3 וולט% ANTIFADE ו-5 vol% פירובט קינאז/דהידרוגנאז לקטי (PKLDH) ב-70 מ"ג/מ"ל להתחדשות ATP.

2. יצירת הנמטי הפעיל

הערה: הפעילות בחומר מתבצעת על-ידי תוספת ATP. הרשת הפעילה מוכנה טרייה לכל ניסוי על ידי הוספת ATP בריכוז גבוה מספיק כדי לגרום לפעילות מוטורית. כדי ליצור פאזה נמטית פעילה אחידה ומפותחת במלואה, המיקרוטובולים חייבים להיות בצפיפות גבוהה מספיק. ניתן להשיג זאת על ידי הגבלת המיקרוטובולים בין שני נוזלים בלתי ניתנים להפרדה ליצירת שכבה נמטית פעילה דו-ממדית (2D). שיטה זו פותחה במקור באוניברסיטת ברנדייס¹³ ונשארה טכניקה פופולרית לייצור פאזה נמטית הומוגנית, איכותית ופעילה.

1. שיטת תא זרימה להיווצרות נמטית פעילה
   1. הכינו כיסויים הידרופיליים עם ציפוי אקרילאמיד.
      1. נקו היטב את הכיסויים עם מי סבון, אתנול ו-0.1 M NaOH עם שטיפות חלופיות באמצעות מים ננו-פוריים. לאחר השטיפה, צפו את הכיסויים בתמיסת סילאן המורכבת מ-100 מ"ל אתנול, 1 מ"ל חומצה אצטית ו-500 מיקרו-ליטר של 3-(טרימתוקסיסיליל) פרופילמתקרילט למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטפו במים ננו-פוריים.
      2. הכינו תמיסת אקרילאמיד מ-95 מ"ל מים ננו-פוריים ו-5 מ"ל של 40 וולט% אקרילאמיד, ולאחר מכן הוציאו את התמיסה למשך 30 דקות בתנור ואקום.
      3. הוסף 35 μL של טטרה-מתילאתילנדיאמין (TEMED) לקבלת ריכוז סופי של 2.3 mM ולאחר מכן 0.07 גרם של אמוניום פרסולפט. יש לשפוך את תמיסת האקרילאמיד על הכיסויים עם הפנים כלפי מעלה ולדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   2. הכינו שקופיות מיקרוסקופ הידרופוביות. פיפטה 100 μL של תמיסה דוחה מים (ראו טבלת חומרים) על מגלשה במיקרוסקופ זכוכית נקי, ולאחר מכן הנח שקופית זכוכית נקייה נוספת מעל. זה מבטיח ציפוי אחיד של תמיסה דוחה מים על פני השטח שבו הוא יושב במשך 2 דקות. לאחר 2 דקות, הסירו את מגלשת הזכוכית השנייה ושטפו היטב את השקופית הראשונה במים ננו-טהורים, ולאחר מכן יבשו בגז חנקן. נקו בעדינות את האזור שבו הסרט יונח (סביב התבנית) עם אצטון כדי להבטיח שתמיסה דוחה מים לא תמנע הידבקות לזכוכית.
   3. הכינו תערובת של שמן מהונדס הכוללת 1.8% (v/v) 008-FluoroSurfactant (ראו טבלת חומרים).
   4. הרכיבו את מגלשת הזכוכית והכיסוי באמצעות שקופית הזכוכית ההידרופובית בתחתית תא הזרימה והכיסוי ההידרופילי מחליק כמשטח העליון בגיאומטריית סנדוויץ' באמצעות מרווחי דבק דו-צדדיים של 40 מיקרומטר. הניחו את הספייסרים במרחק של 1.5 מ"מ זה מזה על מגלשת המיקרוסקופ ההידרופובי. לאחר מכן הניחו את הכיסוי המצופה באקרילאמיד על גבי המרווחים, כאשר הצד המטופל פונה כלפי מטה כדי להידבק. ודא שההידבקות שלמה עם לחץ מאובייקט קהה.
      הערה: המטרה היא להרכיב תא זרימה עם ממשק שמן/מים שטוח בתוכו (איור 2A,B). כאן תיווצר השכבה הפעילה. קלטות וסרטים מרווחים חלופיים יכולים לשמש גם להפקת עובי תא דומה.
   5. לאחר בניית תא הזרימה, מיד מפילים את תערובת השמן לתוך תא הזרימה, וממלאים את החלל הסגור.
   6. באמצעות פיפטה, בבקבוקון נפרד מערבבים בעדינות 6 μL של חומר פעיל עם 3.73 μL של MIX, 1 μL של תמיסת מיקרוטובול, 0.6 μL של תמיסת ATP (הריכוז יכול להיות מגוון כדי לשנות את מהירות microtubule), ו 0.67 μL של חיץ M2B.
   7. פיפטה חומר פעיל מעורבב טרי לתוך קצה אחד פתוח של תא הזרימה, הנפחים ישתנו אך צריכים לעלות על נפח תא הזרימה (בערך 3-6 μL). חלק מהשמן ייעקר על ידי התמיסה המימית כשהוא מוזרק לתעלה; זה יכול להיות מרושע בקצה הנגדי של ערוץ הזרימה באמצעות פיסת נייר טישו קטנה.
   8. לאחר המילוי, יש לאטום את שני צידי תא הזרימה בדבק אפוקסי (ראו טבלת חומרים) המתקשה בעת חשיפה לאור UV למשך 20 שניות.
      הערה: בשלב זה, החומר הפעיל יוצר רשת תלת-ממדית שנשארת תלויה בשכבת המים.
   9. כדי להגביל את השכבה הפעילה בין שני הנוזלים הבלתי ניתנים להפרדה בשכבה מעין דו-ממדית, הניחו את תא הזרימה בצנטריפוגת דלי מתנדנדת (ראו טבלת חומרים) עם הפאזה המימית למעלה ושכבת השמן הצפופה יותר מתחת. צנטריפוגה ב 212 x גרם במשך 10 דקות. לאחר השלמת שלב זה, ניתן לקחת את תא הזרימה למיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי להדמיה עם מטרת הגדלה של פי 10 או 20. איור 2C,D מציג תמונות אופייניות לפני ואחרי שלב זה.
2. שיטה הפוכה להיווצרות נמטית פעילה
   הערה: שיטה חלופית לזו המתוארת בשלב 2.1 היא להרכיב את השכבה הנמטית הפעילה מתחת לשכבת שמן עבה המוגבלת לבאר PDMS עמוקה²⁸. שיטה זו מייצרת תוצאות דומות, וקצת יותר קל לשלוט בה; עם זאת, איכות התמונה בשיטה זו בדרך כלל אינה טובה כמו שיטת תא הזרימה.
   1. הכינו את הפולידימתילסילוקסן (PDMS) באמצעות חומר מרפא אלסטומר ובסיס אלסטומר (ראו טבלת חומרים). מערבבים את שני הרכיבים ביחס של 1:10 באמצעות מרית מתכת. במהלך הערבוב מופיעות בועות זעירות שקשה להסירן, והתערובת נראית חלבית. כדי להסיר את הבועות האלה, מניחים את התערובת מתחת לוואקום כדי degas במשך 1 שעות, ולאחר מכן PDMS uncured צריך להיראות שקוף.
      הערה: ה- PDMS מוכן כעת ליצור כל צורה באמצעות תבנית, או שהוא יכול לרפא במיכל ולאחר מכן לחתוך או לנקב בתבנית הרצויה.
   2. יוצקים את PDMS לתוך תבנית מתאימה ולהשאיר לילה לרפא ב 60 מעלות צלזיוס.
      הערה: לא מטופל, פני השטח של PDMS נרפא הוא הידרופובי, אבל עם טיפול פני השטח, זה יכול להיות הידרופילי.
   3. כדי להכין משטח PDMS הידרופילי, צפו את ה-PDMS במברשת פולימר אקרילאמיד²⁹. שלב זה גם מונע מחלבונים להידבק לפני השטח.
      1. התחילו בניקוי ה-PDMS למשך 10 דקות עם אתנול ואיזופרופנול, ולאחר מכן שטפו היטב במים שעברו דה-יוניזציה פי 3 ויבשים. השתמשו במנקה פלזמה למשך 5 דקות כדי לנקות את ה-PDMS היבש והנרפא. שלב זה הופך את פני השטח להידרופיליים יותר.
      2. לאחר מכן, הכינו תמיסת סילאן (98.5 wt% אתנול, 1 wt% חומצה אצטית, ו-0.5 wt% Trimethoxysilyl propyl methacrylate) וטבלו את המצע בתמיסה זו למשך 15 דקות כדי להתכונן לציפוי האקרילאמיד. שטפו היטב את המצע במים שעברו דה-יוניזציה וטבלו בתמיסת אקרילאמיד (תמיסת אקרילאמיד/ביס של 2 wt%, 2.3 mM TEMED ו-3 mM אמוניום פרסולפט).
         הערה: ניתן לאחסן מצעים אלה בטמפרטורת החדר כשהם מכוסים בתמיסת אקרילאמיד בצלחת פטרי זכוכית, ויש להשתמש בהם תוך שבועיים.
   4. כאשר הוא מוכן לשימוש, יש לשטוף את פני השטח במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש בחנקן לשימוש מיידי. מוסיפים את התערובת הפעילה (המתוארת בשלב 2.1.6) לבארות ומוסיפים מיד שמן סיליקון מלמעלה לעובי של כ-2 מ"מ.
      הערה: בשלב זה, התערובת הפעילה תהיה דחוקה בין השמן לבין הציפוי ההידרופילי ב- PDMS, אך היא עדיין תהיה תלת מימדית במקצת.
   5. כדי לדחוף את החומר עוד יותר לשכבה דו-ממדית, הדביקו את התקן ה-PDMS על מגלשת זכוכית, הניחו אותו בצנטריפוגת דלי מתנדנדת וסובבו במשך 12 דקות ב-212 x גרם. המכשיר יצטרך להיות ממוקם כך שמן הסיליקון הוא על החלק העליון של השכבה המיימית. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 3.

3. הכנת נמטיקה פעילה בגיאומטריות מוגבלות

הערה: נמטיקה פעילה כגון מערכת מעין-דו-ממדית זו יכולה להיות מאתגרת להגבלה לגיאומטריות מיקרופלואידיות קטנות כגון בארות או ערוצים. כאן מתוארת שיטה אמינה להגביל את החומר לבארות PDMS בצורות שונות.

1. ראשית, תכנן תבנית אב עבור PDMS. זה יכול להיות מושגת על ידי הדפסת עמודים 3D על מצע. לאחר הדפסה תלת-ממדית של התבנית הראשית בשרף, נקו עם איזופרופנול ולאחר מכן רפאו את התבנית מתחת למנורת UV למשך 45 דקות ובתנור בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך שעתיים (איור 4).
   הערה: ריפוי תחת UV ותרמי לאחר ריפוי משפר את איכות השכפול ב- PDMS על ידי הסרת מונומרים ושאריות מעכבי פוטו מהשרף³⁰.
2. השתמש בתבנית הראשית כדי ליצור בארות מ- PDMS. הכן את PDMS כמתואר בשלב 2.2.1. לטבול את התבנית הראשית ב-PDMS לא מעובד ולרפא לילה בתנור בטמפרטורה של 60°C.
3. לאחר השלמת ריפוי PDMS, הסירו בזהירות את התבנית הראשית וחתכו את ה-PDMS לפי הצורך כדי לעבוד עם הבארות (איור 4). טפל במשטח PDMS כמתואר בשלב 2.2.3. לפני הניסוי, ניתן לחבר את המשטח למגלשת זכוכית עם דבק אפוקסי כדי להקל על ההדמיה.
4. משנים 1 μL מהתערובת הפעילה המתוארת בשלב 2.1.6 על מצע PDMS ומוסיפים מיד שמן סיליקון עם צמיגות 100-1000 cSt²⁸ על גבי טיפת הרשת הפעילה. הרשת הפעילה תעבור לבאר; התהליך הזה אורך עד 60 דקות (איור 4). כפי שתואר בשלב 2.2.5, ניתן לשפר את הרשת הדו-ממדית על ידי סיבוב ה-PDMS היטב בצנטריפוגת הדלי המתנדנדת למשך 12 דקות ב-212 x g.

תוצאות

איור 1 מראה תמונה מייצגת של מיקרוטובולים בודדים שהוכנו מטובולין GMPCPP. התמונה מתארת מיקרוטובולים קצרים באורכים דומים (עם פיזור מסוים). דילול מספיק של תמיסת המיקרוטובול אמור לייצר תמונה של מיקרוטובולים מופרדים היטב לאימות אורך. המיקרוטובולים הבודדים עשויים להיות מאתגרים לצילום בשל גודלם הקטן. השימוש במצלמה בעלת רגישות גבוהה המיועדת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא הטוב ביותר עבור יישום זה. איור 2 ואיור 3 מראים תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות לדוגמה של ניסויים מוצלחים שבוצעו בשיטת תא הזרימה (סעיף 2.1) ובשיטה ההפוכה (סעיף 2.2), בהתאמה. שכבה נמטית פעילה שנוצרה היטב היא הומוגנית במרקם, ללא אזורים ריקים משמעותיים ופגמים טופולוגיים ניידים. עם זאת, שים לב שעשויים להיות כמה חללים קטנים מקובלים בליבות הפגם. בנוסף לדוגמאות המוצגות באיור 2 ובאיור 3, נכללו שלושה סרטים משלימים (סרט 1, סרט 2 וסרט 3) כדי להדגים כיצד הנמטיקה הפעילה צריכה להופיע בניסוי מוצלח. כל הסרטים מדגימים את התנועה הרציפה החלקה של הפאזה הנמטית הפעילה. לא ניכרים שינויים בריכוז המיקרוטובולים לאחר שהחומר הגיע למצבו היציב. כל עוד קיים מספיק ATP במערכת, החומר ימשיך לנוע באופן אחיד.

איור 1: תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מיקרוטובולים GMPCPP. המיקרוטובולים של GMPCPP סומנו ב-4% עם טובולין רודאמין ופולימריים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ההדמיה בוצעה בטמפרטורת החדר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: נמטיקה של מיקרוטובולים בתא זרימה . (A) סכמת חתך של תא הזרימה, גיאומטריה של 1 מ"מ x 18 מ"מ. (B) סכמת תצוגה עליונה של תא הזרימה. (C) תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המדגימה את המראה האופייני של התמיסה הפעילה לפני ההרכבה בממשק שמן/מים. (D) תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של הפאזה הנמטית הפעילה המורכבת בממשק השמן/מים בתוך תא הזרימה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המציגה נמטיקה פעילה שהוכנה בשיטה הפוכה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: דיאגרמת זרימה הממחישה את השיטה לכליאה נמטית פעילה בבאר PDMS, כולל ייצור עובש וטיפול בפני השטח. סרגל קנה מידה בתמונה הימנית (חומר פעיל מוגבל) = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרט 1: תוצאה מייצגת עבור נמטיקה פעילה שהוכנה בשיטת תא הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט 2: תוצאה מייצגת לנמטיקה פעילה שהוכנה בשיטה הפוכה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט 3: תוצאה מייצגת לנמטיקה פעילה שהוכנה בשיטה הפוכה המוגבלת לבאר אליפטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

Discussion

יש כמה נקודות לאורך הפרוטוקולים שבהן הנסיין יכול לבצע כמה בדיקות חשובות. לפני מילוי אחד מהמכשירים בחומר פעיל, יש להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ( ראו איור 1) כדי לבדוק שהמיקרוטובולים הם פולימריים ואורכם האידיאלי ~2-3 מיקרומטר. אם מיקרוטובולים אינם נראים תחת המיקרוסקופ, ייתכן שהם עברו דה-פולימריזציה והנמטיקה הפעילה לא תיווצר. מאחר שמיקרוטובולים בודדים הם קטנים מאוד, ייתכן שיהיה מאתגר לצפות בהם ישירות דרך המיקרוסקופ. במחקר זה, נעשה שימוש במצלמה פלואורסצנטית באיכות גבוהה המיועדת ליישומים מאתגרים בתאורה חלשה עם התוכנה המשויכת כדי לאמת את צמיחת החוטים. אגרגטים פלואורסצנטיים משמעותיים לא צריכים להיות נוכחים בשלב זה, שכן זה עשוי להצביע על דה-פולימריזציה או על נוכחות של חלבון דנטורציה. זה גם רעיון טוב לעשות שקופית בדיקה מיקרוסקופית פשוטה על ידי שילוב microtubules, MIX, ו- ATP באותם יחסים כפי שמתואר בפרוטוקולים. הפעילות צריכה להתחיל בשילוב הרכיבים והחומר צריך להיראות דומה לזה שמוצג באיור 2C עם צרורות נוכחים ותנועות נימה בולטות הנראות לאורכו.

בעת שימוש בשיטת תא הזרימה, זמן הצנטריפוגה והכיוון של תא הזרימה חשובים ליצירת שכבה פעילה אחידה. שלב זה עשוי לדרוש כוונון עדין בהתאם לסוג הצנטריפוגה שבה נעשה שימוש. צנטריפוגה של תא הזרימה כאשר המישור הפעיל מכוון בניצב למישור הסיבוב נותנת את התוצאות הטובות ביותר מכיוון שניתן לדחוף את החומר לממשק הנוזל באופן אחיד. בדוק שוב שתא הזרימה אטום בקפידה לפני הצנטריפוגה.

כאשר משתמשים בשיטה הפוכה כדי לייצר נמטיקה פעילה מוגבלת ישנם מספר שלבים כדי לייעל. ראשית, חשוב להשתמש בשיטת הדפסה תלת מימדית המייצרת מבנים ברזולוציה גבוהה. קירות צדדיים לא אחידים יכולים לגרום למיקרוטובולים לתפוס, מה שישבש את הזרימות. הבארות לא צריכות להיות עמוקות מדי (במחקר זה נעשה שימוש בבארות בעומק 150-200 מיקרומטר עם שכבת נפט עילי בעובי 2 מ"מ). ייתכן שנסיינים יצטרכו להתאים את הפרמטרים הללו מעט על ידי ניסוי וטעייה כדי לקבל את התוצאה הטובה ביותר.

שיטת תאי הזרימה והשיטה ההפוכה שימשו מחברים שונים כדי לבחון מגוון השפעות המשפיעות על הזרימות הפעילות, כולל שמנים שונים¹² ומבנים שקועים¹³. בחירת השיטה תלויה במטרה הניסויית. בשיטת תא הזרימה, הדמיה אופטית מעל השכבה הפעילה ברורה יותר מאשר בשיטה ההפוכה בשל הנוזלים השונים. בשיטת תאי הזרימה, ההדמיה מתבצעת באמצעות כיסוי זכוכית ושכבה דקה של מים, בעוד שהשיטה ההפוכה נועדה להחזיק את שכבת השמן למעלה. משמעות הדבר היא כי יש צורך ביעד מרחק עבודה ארוך עבור השיטה ההפוכה, ואיכות התמונה מופחתת. ניתן לראות הבדלים באיכות התמונה על-ידי השוואה בין איור 2D (שיטת תא זרימה) ואיור 3 (שיטה הפוכה), לבין סרט 1 וסרט 2, בהתאמה. עדשת הגדלה נמוכה יותר עם מרחק עבודה ארוך יותר נדרשה באיור 3 מזו ששימשה באיור 2. ניתן להימנע מחסרונות הדמיה אלה לשיטה ההפוכה אם קיים מיקרוסקופ הפוך מתאים, בשילוב עם מטרות עם מרחק עבודה מתאים למצעי ההחלקה של המיקרוסקופ. זכוכית דקה יותר יכולה לשמש כמצע כדי לאפשר שימוש במטרות סטנדרטיות של מרחק עבודה.

כיתרון, הגיאומטריה ההפוכה מאפשרת שימוש במגוון רחב יותר של צמיגות שמן, אינה דורשת בהכרח צנטריפוגה של דלי מתנדנד (אם זו אינה זמינה), והכנת המערכת קלה יחסית לאחר הכנת התבנית. עם זאת, עבור כליאה בבארות בשיטה הפוכה, צנטריפוגה מסוימת עשויה להיות חשובה כדי להכניס את החומר לשכבה דו-ממדית מוגדרת היטב.

שיטת תאי הזרימה שימשה לאחרונה בהצלחה רבה בניסויים שבהם נדרשת שכבה פעילה רציפה. עבודתנו האחרונה בחנה את הדינמיקה של פגמים טופולוגיים בשכבה הפעילה, שבה הדמיה איכותית וניתוח מרקם חשובים¹⁹. בנוסף, נעשה שימוש בשיטת תאי הזרימה כדי לחקור את ההשפעות של מיקרו-מבנים שקועים בשמן על זרימות פעילות¹⁶ ועמודים כדי ללכוד פגמים בזרימות הפעילות³¹. שיטה זו פועלת היטב להיווצרות שכבה פעילה רציפה, ואיכות התמונה מצוינת. עם זאת, שלב הצנטריפוגה המשמש לייצור השכבה הפעילה הדו-ממדית הסופית יכול להיות קשה לביצוע, ותאי הזרימה מועדים לדליפות ולבועות אוויר. השיטה ההפוכה היא חלופה שימושית מאוד עם אחוזי הצלחה גבוהים, קלה לבנייה, וניתן להשתמש בה לכל תבנית מצע או גיאומטריה בתנאי שניתן ליצור תבנית מאסטר מודפסת ברזולוציה גבוהה בתלת-ממד. שיטה זו שימושית גם לבחינת ההשפעות של כליאה גיאומטרית על דינמיקה נמטית פעילה מכיוון שהיא הופכת את מילוי בארות לפשוט יחסית.

במאמר זה מתוארות שתי דרכים ליצירת נמטיקה פעילה ממיקרוטובולים ומנועי קינסין, בתוספת טכניקה להגבלת החומרים בבארות. המערכת המוצגת מייצגת את הדוגמה הנקייה ביותר של שלב נמטי פעיל הקיים כיום בספרות ושוכפלה על ידי מספר קבוצות ברחבי העולם. משמעותו של חומר זה אינה טמונה רק במקורות הביולוגיים של מרכיביו, אלא גם משום שהוא פותח כיוון חדש לחלוטין בנוזלים מסודרים פעילים. על ידי עבודה עם מערכת זו והבהרת תכונותיה הבסיסיות, מדענים יכולים להתקדם לעבר תכנון של שלבים פעילים סינתטיים לחלוטין.

לניסויים המתמקדים בהשפעות הכליאה על נמטיקה פעילה יש פוטנציאל לענות על שאלות בסיסיות הנוגעות להתנהגות של זרימות פעילות ודינמיקה של פגמים טופולוגיים תחת כליאה טופולוגית. השיטה המוצגת כאן תסייע בביצוע מגוון ניסויים ממוקדי גיאומטריה וניתוחם, כולל מיקרופלואידיקה וערבוב פעיל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 kD PEG (polyethylene glycol))	Sigma Aldrich	1419109	Depletion agent CAS Number: 125061-88-3
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma Aldrich	M6514-50ML	CAS Number: 2530-85-0
3D printer & Resin	Phrozen		Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin
40% Acrylamide Solution	BIO-RAD	1610140	CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1
Acetic Acid	Fisher		CAS Number: 64-19-7
Acetone	Sigma Aldrich		CAS Number: 67-64-1
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative)	Grace Bio-Labs	620001	SecureSeal
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678	CAS Number: 7727-54-0
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative)	Aquapel Glass Treatment		hydrophobic glass treatment
ATP (Adenosine triphosphate)	Sigma Aldrich	A1852	CAS Number: 34369-07-8
Beakers	VWR
Catalase	Sigma Aldrich	C9322	CAS Number: "9001-05-2"
Desiccator	Bel-art
Digital CMOS camera	Hamamatsu	ORCA - Flash4.0 LT+
DTT (Dithiothreitol)	Sigma Aldrich	D9779	CAS Number: "3483-12-3"
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid)	Sigma Aldrich	MFCD00004291	CAS Number: 67-42-5
Ethanol	Sigma Aldrich		CAS Number: 64-17-5
Fluorescence microscope	Leica	DM 2500P
Glass Coverslips	VWR	48368-040
Glass Slides	VWR	16004-430
Glucose	Sigma Aldrich	G7021	CAS Number: 50-99-7
Glucose Oxidase	Sigma Aldrich	345386	CAS Number: 9001-37-0
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate)	Jena Bioscience	NU-405S	CAS Number: 14997-54-7
HFE7500 Oil	3M
Hot Plate	Fisher Scientific	Thermix hot plate model 100M
Isopropyl Alcohol	VWR
KCl (potassium chloride)	Sigma Aldrich	P5405	CAS Number: 7447-40-7
Methanol	Sigma Aldrich		CAS Number: 67-56-1
MgCl2 (Magnesium Chloride)	Sigma Aldrich	208337	CAS Number: 7786-30-3
Microcentrifuge tubes	Eppendorf - Thermo Fisher	1.5 mL
Nanopure water purifier	Sartorius	arium mini
NaOH (Sodium hydroxide)	Sigma Aldrich	SX0603	CAS Number: 1310-73-2
Petri Dishes	VWR
PH Meter	Thermo Scientist	Orion 3 STAR
Phosphoenol-pyruvate (PEP)	Sigma Aldrich	MFCD00044476	CAS Number: 4265-07-0
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid)	Sigma Aldrich		CAS Number: 5625-37-6
Pipettes (0.2 - 1000 µl)	VWR
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	2594628
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative)	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s)	Sigma Aldrich		CAS Number: 63148-52-7
Streptavidin	Thermofisher	S888
Swinging Bucket Centrifuge	Thermo Scientist	Sorvall legend RT+
Sylgard 184 Elastomer base	World Precision Instruments	SYLG184
Sylgard 184 Elastomer Curing agent	World Precision Instruments	SYLG184
Table top centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	BIO-RAD	1610800	CAS Number: 110-18-9
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)	Sigma Aldrich	MFCD00006846	CAS Number: 53188-07-1
Tubulin	Cytoskeleton	T240-B
Tubulin (Rhodamine labeled)	Cytoskeleton	TL590M-A
Ultracentrifuge	Beckman	Optima Max-TL
UV Light	RapidFix
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative)	RapidFix
Water Bath	Thelco
Whatman Filter paper	Sigma Aldrich	WHA1001325