קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.

Abstract

למרות התקדמות מרשימה בהבנת הביולוגיה של הגידול, הרוב המכריע של התרופות האונקולוגיות המועמדות לניסויים קליניים נכשלים, לעתים קרובות בשל חוסר יעילות קלינית. שיעור כישלון גבוה זה מאיר את חוסר יכולתם של המודלים הפרה-קליניים הנוכחיים לחזות יעילות קלינית, בעיקר בשל חוסר יכולתם לשקף את הטרוגניות הגידול ואת המיקרו-סביבה של הגידול. ניתן לטפל במגבלות אלה באמצעות מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של תרבית (ספרואידים) שהוקמו מדגימות גידול אנושיות שמקורן בחולים בודדים. תרביות תלת-ממדיות אלה מייצגות ביולוגיה של העולם האמיתי טוב יותר מאשר קווי תאים מבוססים שאינם משקפים הטרוגניות של הגידול. יתר על כן, תרביות תלת-ממדיות טובות יותר ממודלים של תרביות דו-ממדיות (2D) (מבנים חד-שכבתיים) מכיוון שהן משכפלות אלמנטים של סביבת הגידול, כגון היפוקסיה, נמק והיצמדות תאים, ומשמרים את צורת התא הטבעית ואת צמיחתה. במחקר הנוכחי פותחה שיטה להכנת תרביות ראשוניות של תאים סרטניים מחולים בודדים שהם תלת ממדיים וגדלים בכדוריות רב-תאיות. התאים יכולים להיגזר ישירות מגידולים של חולים או xenografts שמקורם בחולה. השיטה ישימה באופן נרחב לגידולים מוצקים (למשל, מעי גס, שד וריאות) והיא גם חסכונית, מכיוון שניתן לבצע אותה בשלמותה במעבדה טיפוסית לחקר הסרטן / ביולוגיה של התא מבלי להסתמך על ציוד מיוחד. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידולים (ספרואידים רב-תאיים) מתאי סרטן ראשוניים ולהערכת רגישותם לתרופות באמצעות שתי גישות משלימות: בדיקת כדאיות התא (MTT) ובדיקות מיקרוסקופיות. ניתן להשתמש בספרואידים רב-תאיים אלה כדי להעריך מועמדים פוטנציאליים לתרופה, לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, ולחקור את מנגנוני התגובה והעמידות.

Introduction

מחקרי In vitro ו-in vivo מייצגים גישות משלימות לפיתוח טיפולים לסרטן. מודלים במבחנה מאפשרים שליטה ברוב משתני הניסוי ומאפשרים ניתוחים כמותיים. לעתים קרובות הם משמשים כפלטפורמות סינון בעלות נמוכה וניתן להשתמש בהם גם למחקרים מכניסטיים¹. עם זאת, הרלוונטיות הביולוגית שלהם מוגבלת מטבעה, שכן מודלים כאלה משקפים רק חלקית את המיקרו-סביבה של הגידול¹. לעומת זאת, מודלים in vivo, כגון xenografts שמקורם במטופל (PDX), לוכדים את המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול ומתאימים יותר למחקרים תרגומיים ולטיפול אינדיבידואלי בחולים (כלומר, חקירת התגובה לתרופות במודל הנגזר ממטופל בודד)¹. עם זאת, מודלים in vivo אינם תורמים לגישות בעלות תפוקה גבוהה לסינון תרופות, מכיוון שלא ניתן לשלוט בפרמטרים הניסיוניים בצורה הדוקה כמו במודלים במבחנה ומכיוון שפיתוחם גוזל זמן, דורש עבודה ויקר ^1,2.

מודלים במבחנה זמינים כבר מעל 100 שנה, וקווי תאים זמינים מעל 70 שנה³. במהלך העשורים האחרונים, עם זאת, המורכבות של מודלים זמינים במבחנה של גידולים מוצקים גדל באופן דרמטי. מורכבות זו נעה בין מודלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תרבית (מבנים חד-שכבתיים) שהם קווי תאים מבוססים שמקורם בגידול או קווי תאים ראשוניים ועד לגישות עדכניות יותר הכוללות מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים)¹. בתוך המודלים הדו-ממדיים, הבחנה מרכזית היא בין קווי התאים המבוססים והראשוניים⁴. קווי תאים מבוססים מונצחים; לכן, אותו קו תאים יכול לשמש באופן גלובלי לאורך שנים רבות, אשר בפרספקטיבה היסטורית, מאפשר שיתוף פעולה, הצטברות נתונים, ופיתוח אסטרטגיות טיפול רבות. עם זאת, סטיות גנטיות בקווי תאים אלה מצטברות עם כל מעבר, ובכך פוגעות ברלוונטיות הביולוגית שלהם. יתר על כן, המספר המוגבל של שורות תאים זמינות אינו משקף את ההטרוגניות של גידולים בחולים ^4,5. קווי תאים סרטניים ראשוניים נגזרים ישירות מדגימות גידול שנכרתו המתקבלות באמצעות ביופסיות, עירוי פלאורלי או כריתות. לכן, קווי תאים סרטניים ראשוניים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית מכיוון שהם משמרים אלמנטים של מיקרו-סביבה של הגידול ומאפייני הגידול, כגון התנהגויות בין-תאיות (למשל, דיבור צולב בין תאים בריאים וסרטניים) ופנוטיפים דמויי גזע של תאים סרטניים. עם זאת, יכולת השכפול של קווי תאים ראשוניים מוגבלת, מה שמוביל לזמן תרבית צר ומגביל את מספר תאי הגידול שניתן להשתמש בהם לאנליזות ^4,5.

מודלים המשתמשים בתרביות תלת-ממדיות רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית מאשר מודלים של תרביות דו-ממדיות מכיוון שתנאי in vivo נשמרים. לפיכך, מודלים של תרבית תלת ממדית משמרים את צורת התא הטבעית ואת צמיחתה ומשכפלים אלמנטים של סביבת הגידול, כגון היפוקסיה, נמק והיצמדות תאים. המודלים התלת-ממדיים הנפוצים ביותר בחקר הסרטן כוללים ספרואידים רב-תאיים, מבנים מבוססי פיגומים ותרביות משובצות מטריצה ^4,6,7.

הפרוטוקול הנוכחי מייצר מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידולים (ספרואידים רב-תאיים) מתאי סרטן ראשוניים ומעריך את רגישותם לתרופות באמצעות שתי גישות משלימות: בדיקת כדאיות התא (MTT) ובדיקות מיקרוסקופיות. התוצאות המייצגות המוצגות כאן הן מסרטן השד והמעי הגס; עם זאת, פרוטוקול זה ישים באופן נרחב לסוגי גידולים מוצקים אחרים (למשל, כולנגיוקרצינומה, סרטן קיבה, ריאות ולבלב) והוא גם חסכוני, מכיוון שניתן לבצע אותו במלואו במעבדה טיפוסית לחקר הסרטן / ביולוגיה של התא מבלי להסתמך על ציוד מיוחד. הספרואידים הרב-תאיים הנוצרים באמצעות גישה זו יכולים לשמש להערכת מועמדים פוטנציאליים לתרופה, לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, ולחקור את מנגנוני התגובה והעמידות.

פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים: (1) ייצור, איסוף וספירה של הספרואידים לקראת השימוש בהם כמודל לבדיקת יעילות התרופה; (2) בדיקת MTT להערכת יעילות התרופה על הספרואידים; ו-(3) הערכה מיקרוסקופית של שינויים מורפולוגיים בעקבות הטיפול בכדורידים בתרופות כגישה נוספת להערכת יעילות התרופה (איור 1).

Protocol

איסוף דגימות הגידול האנושי המשמשות לתרביות תאי הגידול הראשוניות בוצע בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית (IRB) במרכז הרפואי רבין ובהסכמה מדעת בכתב של החולים. בין החולים הזכאים להשתתף במחקר היו חולי סרטן מבוגרים וילדים עם סרטן שד, מעי גס, כבד, ריאה, נוירואנדוקרינה, שחלות או לבלב שאינו גרורתי, סרטן ילדים כלשהו או סרטן גרורתי כלשהו. קריטריון ההחרגה היחיד היה היעדר היכולת לתת הסכמה מדעת.

1. דור ואיסוף של ספרואידים

הערה: בידוד של תאי גידול ראשוניים יכול להתבצע כמתואר על ידי קודאק ואחרים ⁸. חשוב לציין, תאי גידול ראשוניים המשמשים לייצור הספרואידים יכולים להיגזר ישירות מדגימות המטופל המתקבלות על ידי ביופסיה, כריתה וכו ', או בעקיפין באמצעות דגימות גידול ממודלים של xenograft (PDX) שמקורם בחולה, כפי שתואר על ידי Moskovits et ^al.9.

1. הכינו תרחיף חד-תאי של תרביות תאי גידול ראשוניים דבקים במפגש של 75%-100% על ידי לקיחת בקבוק קטן (T25) עם תרבית תאים ראשונית דבק חד-תאי, הסרת מדיית תרבית התא, שטיפה עם PBS, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של 1x Accutase (תמיסת ניתוק תאים) (ראה טבלת חומרים) למשך 3 דקות ב-37°C.
2. נטרל את תמיסת Accutase על ידי הוספת 5 מ"ל של מדיום תרבית תאים (מדיום תרבית RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 1:100 פניצילין-סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% L-גלוטמין; ראה טבלת חומרים).
3. שואפים את התאים עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל, ומפקידים אותם בצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. מוציאים את מדיום תרבית התא, מוסיפים 5 מ"ל של מדיום תרבית תאים טרי על גבי גלולת התא, ומערבבים בעדינות.
5. לספור את התאים קיימא עם hemocytometer¹⁰. כדי לעשות זאת, לקחת aliquot של 50 μL של השעיית התא, ומערבבים אותו עם 50 μL של כחול טריפאן. ספור את התאים החיים (התאים השליליים לצבע כחול) וחשב את המספר הכולל של תאים חיים בהשעיה.
6. הכינו "מדיום תרבית תלת-ממדי" (מדיום תרבית תאים בתוספת מטריצת 5% קרום מרתף; ראו טבלת חומרים).
   הערה: "מדיום התרבית התלת-ממדית" הוא דמוי נוזל בטמפרטורת החדר. ב 37 ° C, עקביות הופך להיות יותר כמו ג'ל (כך התאים להישאר יחד), אם כי זה עדיין יכול להיות pipetted (שכן הוא מכיל רק 5% מטריצת קרום מרתף).
7. חישוב מספר התאים הדרושים לבדיקה ואת הנפח הכולל הנדרש; כל באר חייבת להכיל 2,000-8,000 תאים ב-200 מיקרוליטר של תווך.
8. הכינו תרחיף תאים עם מספר התאים הרצוי (למשל, 4,000 תאים) ב-200 מיקרוליטר של "מדיום התרבית התלת-ממדית" וערבבו בעדינות עם פיפטה כדי להבטיח פיזור הומוגני.
9. מעבירים את המתלה למאגר צנרת. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 200 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד 96 בארות (ראה טבלת חומרים). לפני כל אוסף של תאים, מערבבים היטב את התרחיף.
10. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאכוף את אשכולות התאים, ובכך לשפר את צבירת התא, ולדגור את הצלחת ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ לח.
11. כל 2-3 ימים, לרענן את "מדיום תרבות 3D". צנטריפוגו את הצלחת ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בעדינות ולהשליך 50% של המדיום (100 μL), ולהוסיף 100 μL של "מדיום תרבית 3D" טרי כדי להחליף את הפתרון הקיים. חזור על שלב 1.11, והחזיר את הצלחת לאינקובטור לחות 37°C, 5% CO₂.
    הערה: הסרת המדיום חייבת להתבצע כאשר הצלחת מוחזקת ב 45°, ואת המדיום יש לאסוף רק מהחלק העליון כדי למנוע איסוף התאים. אין להשתמש במערכת שאיבת ואקום. את המדיום הטרי יש להוסיף לאט ובעדינות כדי לא לשבש את הספרואידים, שכבר החלו להיווצר.
12. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כל 1-2 ימים כדי לפקח על היווצרות הספרואידים. מדדו את קוטר הספרואידים שנוצרו באמצעות כלי ה"קנה מידה" בתוכנת ההדמיה (ראו טבלת חומרים).
    הערה: בדיקה מיקרוסקופית אמורה לגלות תחילה גופים עגולים עד אליפטיים לא סדירים המקבלים צורה ספרואידית ככל שהזמן מתקדם^11,12.
    1. כאשר קוטר הספרואיד מגיע ל 100-200 מיקרומטר, בצע את ניסויי יעילות התרופה.
       הערה: ניסויי יעילות התרופה מבוצעים כאשר הספרואידים מגיעים לקוטר זה, שכן באותו זמן, רוב התאים מתרבים, מה שתורם להערכת התגובה לטיפול. ספרואידים בקוטר גדול יותר מכילים ליבה נמקית ושכבה שקטה^11,12, וכתוצאה מכך שיעור קטן יותר של תאים מתרבים המגיבים לטיפול.
13. לאיסוף ספרואידים, השתמשו בפיפט של 1,000 מיקרוליטר כדי לאסוף את הספרואידים מכל באר, והפקידו אותם בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    הערה: ספרואידים הם שבירים מטבעם ודורשים טיפול עדין. בעת העברת התווך עם הספרואידים לתוך הצינור החרוטי, להחזיק את הצינור ב 45°, פיפטה לאט על הקיר של הצינור. ספרואידים נראים לעין.
14. צנטריפוגו את הצינור החרוטי ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה.
15. מוסיפים 0.5 מ"ל של מדיום תרבית התא, ומשעיפים מחדש את הגלולה היטב אך בעדינות. הימנעו מיצירת בועות.
16. בצע ספירה ספרואידית לפי השלבים הבאים.
    1. השתמש בלוח של 96 בארות וצייר סימן פלוס בחלק התחתון של באר כדי לחלק את הבאר לרבעים (כדי לעזור לעקוב אחר הספירה).
    2. מוסיפים 50 μL של המתלה לבאר, וסופרים את הספרואידים ידנית תחת המיקרוסקופ (באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 10).
    3. ספרו את הספרואידים בכל רביע, היזהרו שלא לספור פעמיים, וחשבו את המספר הכולל של הספרואידים בבאר.
       הערה: לדיוק הספירה, ספרו לפחות 50 כדוריות בבאר. אם יש פחות מ-50 ספרואידים, ערבבו בעדינות את המתלה כדי להבטיח פיזור הומוגני, וספרו שוב באמצעות נפח גדול יותר של המתלה שנוסף לבאר חדשה. לחלופין, אם יש פחות מ -50 ספרואידים בבאר, ניתן לצנטריפוגה את הספרואידים ולהשהות אותם מחדש בעדינות בנפח של <0.5 מ"ל. אם יש מעל 100 ספרואידים, הוסיפו מדיום תרבית תאים לתרחיף הספרואידים, ערבבו בעדינות וספרו מחדש.
    4. חשב את ריכוז הספרואידים (ספירה ספרואידית/נפח ספירה [μL]), ולאחר מכן חשב את המספר הכולל של הספרואידים בתרחיף (ריכוז ספרואידים × נפח כולל).

2. בדיקת יעילות התרופה (בדיקת MTT)

הערה: לקבלת פרטים, ראה van Meerloo et ^al.13. כמו כן, עבור בדיקת MTT, יש להשתמש רק בתווך תרבית התא ולא ב"מדיום התרבית התלת-ממדית" (הוספת מטריצת קרום המרתף אינה הכרחית ועלולה להפריע לבדיקת MTT).

1. בצינור חדש, הכינו תרחיף ספרואידי בריכוז של 200 ספרואידים לכל 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים (מדיום תרבית RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 1:100 פניצילין-סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% L-גלוטמין).
   1. עבור כל טיפול תרופתי, להכין מלאי של spheroids בצינור 15 מ"ל. חשב את הכמות הדרושה לכל תרופה לפי מספר הבארות הדרושות לחזרות: (5-8) × 200 μL. הוסף את התרופה לצינור לריכוז הסופי הדרוש.
      הערה: עיין בסעיף התוצאות המייצגות לגבי התרופות המשמשות במחקר הנוכחי והמינון שלהן. כמו כן, הפרטים המסחריים של התרופות מפורטים בטבלת החומרים.
2. מעבירים 200 μL של תרחיף הספרואיד לבארות של צלחת חיבור 96 בארות נמוכה במיוחד, ודגרים על הצלחת ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO₂. אין להשתמש בשורות ובעמודות החיצוניות של צלחת 96 הקידוחים לבדיקה, שכן בארות אלה מאופיינות באידוי מוגבר, מה שעלול להוביל לשונות מוגברת בין הניסויים החוזרים; במקום זאת, הוסף PBS לבארות אלה.
   הערה: חשוב שתרבית הספרואידים תהיה הומוגנית לפני שהתרבות תשולב בצלחת בת 96 הקידוחים. כמו כן, תנאי בקרה (כלומר, ספרואידים לא מטופלים) חייב להיכלל בכל ניסוי.
3. לאחר הדגירה על הספרואידים עם תרופת המחקר במשך 24-72 שעות, צנטריפוגו את הצלחת ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר בעדינות 170 μL של מדיום תרבית התא, משאיר 30 μL (הכולל את הספרואידים) בתחתית הבאר.
   הערה: הסרת 170 μL של מדיום תרבית התא חייבת להיעשות בזהירות, כדי לא להסיר את הספרואידים. החזיקו את הצלחת בטמפרטורה של 45°, והניחו יד אחת (עם כפפה כהה לניגוד) מתחת לבארות כך שהספרואידים יהיו גלויים (נקודות לבנות).
4. הכינו את תמיסת MTT (0.714 מ"ג/מ"ל בסל"ד נטול פנול, ראו טבלת חומרים).
5. הוסף 70 μL של תמיסת MTT לכל באר לנפח סופי של 100 μL לכל באר (ריכוז MTT הסופי בבאר יהיה 0.05 מ"ג לכל 100 μL). בנוסף, להכין "ריק" בארות עם פתרון MTT ללא תאים.
   הערה: MTT רגיש לאור. לכן, יש לכבות את האור במכסה המנוע, ולכסות את הצינור המכיל את תמיסת MTT ברדיד אלומיניום.
6. לדגור על הצלחת ב 37 ° C ב 5% CO₂ אינקובטור לח במשך 3-4 שעות עד שינוי בצבע של תמיסה בבארות (צבע סגול מייצג תאים חיים) הוא ציין.
7. כאשר נצפה שינוי, הוסף 100 μL של תמיסת עצירה (0.1N HCl באיזופרופנול) לכל באר, וערבב בעדינות את תוכן הבארות מבלי ליצור בועות.
8. קרא את בליעת הלוח בקורא פלואורומטר-ELISA (ראה טבלת חומרים) באורך גל של 570 ננומטר ובאורך גל רקע של 630-690 ננומטר.
   הערה: אם קורא Fluorometer-ELISA הזמין אינו יכול לקרוא את לוח 96 הקידוחים בחיבור נמוך במיוחד, העבר את התוכן של כל באר ללוח 96 בארות שטוח תואם.
9. חשב את כדאיות התא לפי השלבים הבאים.
   1. עבור כל באר, לחשב את "האות הספציפי" ("אות ספציפי" = האות ב 570 ננומטר - האות ב 630-690 ננומטר). לאחר מכן, חשב את הערך הממוצע של בארות "ריק", ולהפחית ערך זה מכל באר.
   2. חשב את הממוצע של "אותות ספציפיים" בבארות הבקרה המכילות תאים שלא טופלו בתרופת המחקר ("AV-SS-unt").
   3. חישוב הכדאיות (אחוז) של תאים בכל באר ביחס לבארות עם תאים לא מטופלים.
      הערה: כדאיות = (אות ספציפי בכל באר/"AV-SS-unt") × 100

3. ניטור וניתוח השינויים המורפולוגיים בספרואידים

הערה: באשר לבדיקת MTT, יש להשתמש רק בתווך תרבית התא ולא ב"מדיום התרבית התלת-ממדית" בהערכה זו (הוספת מטריצת קרום המרתף אינה הכרחית ועלולה להפריע לניתוח).

1. לאחר ספירת הספרואידים, יש לדלל את התרחיף בתווך תרבית התאים (מדיום תרבית RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 1:100 פניצילין-סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% L-גלוטמין) לכ-1-2 ספרואידים לכל 20 מיקרוליטר.
2. שים 80 μL של מדיום תרבית תאים לתוך הבארות של צלחת חיבור נמוך במיוחד 96 בארות, ולאחר מכן להוסיף 20 μL של השעיה ספרואיד לבארות.
   הערה: הבארות יכילו אפוא 1-2 ספרואידים בנפח של 100 μL.
3. בדוק היטב את הבארות תחת המיקרוסקופ, וסמן את הבארות המכילות ספרואיד אחד, כפי שהם ישמשו לניתוח זה.
4. הכינו את תרופת המחקר בריכוז שהוא פי שניים מריכוז העניין. הוסף 100 μL של תמיסת התרופה לבארות הרלוונטיות (הריכוז הכולל בבאר יהיה אז 1x).
5. צלם תמונה של כל באר ביום 0 (לפני הוספת תרופת המחקר) והשתמש בכלי "קנה מידה" בתוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את הקטרים של הספרואידים.
6. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO₂, ובוחנים את המורפולוגיה ומודדים את קוטר הספרואידים (באמצעות כלי ה"סולם") מדי יום במשך 3-7 ימים, תלוי מתי נצפתה השפעת התרופה (למשל, הפצת תאים, תרמילים פולשניים, הרס מבנה וכו').
7. בסוף הניסוי, שרטט את השינויים בקטרים הספרואידים (ביחס ליום 0) לאורך זמן.
   הערה: שינוי (אחוזים) = (קוטר הספרואיד ביום מסוים/קוטר הספרואיד ביום 0) × 100

תוצאות

פרוטוקול זה מציג נהלים ליצירת תרבית הומוגנית של ספרואידים מתאי גידול ראשוניים, הערכה כמותית של יעילות התרופה על תרבית ספרואידים (בדיקת MTT), וקביעת ההשפעה של תרופות מחקר על מורפולוגיה ספרואידית. מוצגים נתונים מהניסויים המייצגים בספרואידים שנוצרו מתרביות תאי סרטן המעי הגס והשד. ניסויים דומ...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ליצירת תרביות תאים ראשוניות תלת-ממדיות (ספרואידים) שמקורן בדגימות גידול אנושיות. ספרואידים אלה יכולים לשמש לניתוחים שונים, כולל הערכת מועמדים פוטנציאליים לתרופות ושילובי תרופות, זיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, וחקירת מנגנוני התגובה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracil	TEVA Israel	lot 16c22NA	Fluorouracil, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Flurometer ELISA reader	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	320331	for stop solution
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.52a	Open-source software ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	for stop solution
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Palbociclib	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	2119399
Phenol-free RPMI 1640	Biological industries, Israel	01-103-1A
Pippeting reservoir	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0.5% solution	Biological industries, Israel	03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine