Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.

Abstract

Nonostante i notevoli progressi nella comprensione della biologia tumorale, la stragrande maggioranza dei candidati farmaci oncologici che entrano negli studi clinici falliscono, spesso a causa della mancanza di efficacia clinica. Questo alto tasso di fallimento illumina l'incapacità degli attuali modelli preclinici di prevedere l'efficacia clinica, principalmente a causa della loro inadeguatezza nel riflettere l'eterogeneità del tumore e il microambiente tumorale. Queste limitazioni possono essere affrontate con modelli di coltura tridimensionali (3D) (sferoidi) stabiliti da campioni di tumore umano derivati da singoli pazienti. Queste colture 3D rappresentano la biologia del mondo reale meglio delle linee cellulari stabilite che non riflettono l'eterogeneità del tumore. Inoltre, le colture 3D sono migliori dei modelli di coltura bidimensionale (2D) (strutture monostrato) poiché replicano elementi dell'ambiente tumorale, come ipossia, necrosi e adesione cellulare, e preservano la forma e la crescita naturale delle cellule. Nel presente studio, è stato sviluppato un metodo per preparare colture primarie di cellule tumorali da singoli pazienti che sono 3D e crescono in sferoidi multicellulari. Le cellule possono essere derivate direttamente da tumori del paziente o xenotrapianti derivati dal paziente. Il metodo è ampiamente applicabile ai tumori solidi (ad esempio, colon, seno e polmone) ed è anche conveniente, in quanto può essere eseguito nella sua interezza in un tipico laboratorio di ricerca sul cancro / biologia cellulare senza fare affidamento su attrezzature specializzate. Qui viene presentato un protocollo per generare modelli di coltura tumorale 3D (sferoidi multicellulari) da cellule tumorali primarie e valutare la loro sensibilità ai farmaci utilizzando due approcci complementari: un saggio di vitalità cellulare (MTT) e esami microscopici. Questi sferoidi multicellulari possono essere utilizzati per valutare potenziali candidati farmacologici, identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e studiare i meccanismi di risposta e resistenza.

Introduzione

Gli studi in vitro e in vivo rappresentano approcci complementari per lo sviluppo di trattamenti contro il cancro. I modelli in vitro consentono il controllo della maggior parte delle variabili sperimentali e facilitano le analisi quantitative. Spesso fungono da piattaforme di screening a basso costo e possono essere utilizzati anche per studi meccanicistici¹. Tuttavia, la loro rilevanza biologica è intrinsecamente limitata, in quanto tali modelli riflettono solo parzialmente il microambiente tumorale¹. Al contrario, i modelli in vivo, come gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX), catturano la complessità del microambiente tumorale e sono più adatti per studi traslazionali e trattamenti individualizzanti nei pazienti (cioè, studiando la risposta ai farmaci in un modello derivato da un singolo paziente)¹. Tuttavia, i modelli in vivo non favoriscono approcci ad alto rendimento per lo screening dei farmaci, poiché i parametri sperimentali non possono essere controllati strettamente come nei modelli in vitro e perché il loro sviluppo richiede tempo, manodopera e costoso ^1,2.

I modelli in vitro sono disponibili da oltre 100 anni e le linee cellulari sono disponibili da oltre 70 anni³. Negli ultimi decenni, tuttavia, la complessità dei modelli in vitro disponibili di tumori solidi è aumentata drammaticamente. Questa complessità varia da modelli di coltura 2-dimensionali (2D) (strutture monostrato) che sono linee cellulari stabilite derivate dal tumore o linee cellulari primarie agli approcci più recenti che coinvolgono modelli tridimensionali (3D)¹. All'interno dei modelli 2D, una distinzione chiave è tra le linee cellulari stabilite e primarie⁴. Le linee cellulari stabilite sono immortalate; Pertanto, la stessa linea cellulare può essere utilizzata globalmente per molti anni, il che da una prospettiva storica, facilita la collaborazione, l'accumulo di dati e lo sviluppo di molte strategie di trattamento. Tuttavia, le aberrazioni genetiche in queste linee cellulari si accumulano ad ogni passaggio, compromettendo così la loro rilevanza biologica. Inoltre, il numero limitato di linee cellulari disponibili non riflette l'eterogeneità dei tumori nei pazienti ^4,5. Le linee cellulari tumorali primarie derivano direttamente da campioni tumorali resecati ottenuti tramite biopsie, versamenti pleurici o resezioni. Pertanto, le linee cellulari tumorali primarie sono biologicamente più rilevanti in quanto conservano elementi del microambiente tumorale e le caratteristiche tumorali, come i comportamenti intercellulari (ad esempio, cross-talk tra cellule sane e cancerose) e i fenotipi staminali delle cellule tumorali. Tuttavia, la capacità replicativa delle linee cellulari primarie è limitata, il che porta a un tempo di coltura ristretto e limita il numero di cellule tumorali che possono essere utilizzate per le analisi ^4,5.

I modelli che utilizzano colture 3D sono biologicamente più rilevanti dei modelli di coltura 2D poiché le condizioni in vivo vengono mantenute. Pertanto, i modelli di coltura 3D preservano la forma e la crescita naturale delle cellule e replicano elementi dell'ambiente tumorale, come ipossia, necrosi e adesione cellulare. I modelli 3D più comunemente usati nella ricerca sul cancro includono sferoidi multicellulari, strutture basate su scaffold e colture incorporate nella matrice ^4,6,7.

Il presente protocollo genera modelli di coltura tumorale 3D (sferoidi multicellulari) da cellule tumorali primarie e valuta la loro sensibilità ai farmaci utilizzando due approcci complementari: un saggio di vitalità cellulare (MTT) ed esami microscopici. I risultati rappresentativi qui presentati provengono dal cancro al seno e al colon; Tuttavia, questo protocollo è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido (ad esempio, colangiocarcinoma, cancro gastrico, polmonare e pancreatico) ed è anche conveniente, in quanto può essere eseguito nella sua interezza in un tipico laboratorio di ricerca sul cancro / biologia cellulare senza fare affidamento su attrezzature specializzate. Gli sferoidi multicellulari generati utilizzando questo approccio possono essere utilizzati per valutare potenziali candidati farmacologici, identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e studiare i meccanismi di risposta e resistenza.

Questo protocollo è diviso in tre sezioni: (1) la generazione, la raccolta e il conteggio degli sferoidi in preparazione al loro uso come modello per testare l'efficacia dei farmaci; (2) Saggio MTT per valutare l'efficacia del farmaco sugli sferoidi; e (3) la valutazione microscopica dei cambiamenti morfologici a seguito del trattamento degli sferoidi con farmaci come un altro approccio per valutare l'efficacia del farmaco (Figura 1).

Protocollo

La raccolta di campioni di tumore umano utilizzati per le colture di cellule tumorali primarie è stata eseguita secondo i protocolli approvati dal comitato di revisione istituzionale (IRB) presso il Rabin Medical Center con il consenso informato scritto dei pazienti. I pazienti eleggibili per la partecipazione allo studio includevano pazienti con cancro adulto e pediatrico di sesso maschile e femminile con cancro al seno, al colon, al fegato, ai polmoni, neuroendocrino, ovarico o pancreatico non metastatico, qualsiasi cancro pediatrico o qualsiasi cancro metastatico. L'unico criterio di esclusione era la mancanza di capacità di fornire il consenso informato.

1. Generazione e raccolta di sferoidi

NOTA: L'isolamento delle cellule tumorali primarie può essere eseguito come descritto da Kodak et ^al.8. È importante sottolineare che le cellule tumorali primarie utilizzate per generare gli sferoidi possono essere derivate direttamente da campioni di pazienti ottenuti da biopsia, resezione, ecc., O indirettamente utilizzando campioni tumorali da modelli di xenotrapianto derivati dal paziente (PDX), come descritto da Moskovits et ^al.9.

1. Preparare una sospensione unicellulare di colture cellulari tumorali primarie aderenti di confluenza del 75%-100% prendendo un piccolo matraccio (T25) con una coltura cellulare primaria aderente unicellulare, rimuovendo il terreno di coltura cellulare, lavando con PBS e quindi aggiungendo 1 mL di 1x Accutase (una soluzione di distacco cellulare) (vedere la Tabella dei materiali) per 3 minuti a 37 °C.
2. Neutralizzare la soluzione di Accutase aggiungendo 5 ml di terreno di coltura cellulare (terreno di coltura RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1:100 penicillina-streptomicina, 1% aminoacidi non essenziali e 1% L-glutammina; vedere la Tabella dei materiali).
3. Aspirare le cellule con una pipetta sierologica da 10 ml e depositarle in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare il tubo a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere il terreno di coltura cellulare, aggiungere 5 ml di terreno di coltura cellulare fresco sopra il pellet cellulare e mescolare delicatamente.
5. Contare le cellule vitali con un emocitometro¹⁰. Per fare ciò, prendere un'aliquota di 50 μL della sospensione cellulare e mescolarla con 50 μL di tripano blu. Contare le celle vive (le celle negative per il colore blu) e calcolare il numero totale di celle vive nella sospensione.
6. Preparare un "terreno di coltura 3D" (un terreno di coltura cellulare integrato con una matrice di membrana basale al 5%; vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Il "terreno di coltura 3D" è liquido a temperatura ambiente. A 37 °C, la consistenza diventa più gelatinosa (in modo che le cellule rimangano unite), sebbene possa ancora essere pipettata (poiché contiene solo il 5% di matrice di membrana basale).
7. Calcolare il numero di celle necessarie per il test e il volume totale richiesto; ogni pozzetto deve contenere 2.000-8.000 cellule in 200 μL di mezzo.
8. Preparare una sospensione cellulare con il numero desiderato di cellule (ad esempio, 4.000 cellule) in 200 μL del "terreno di coltura 3D" e mescolare delicatamente con la pipetta per garantire una distribuzione omogenea.
9. Trasferire la sospensione in un serbatoio di pipettaggio. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 μL della sospensione della cella a ciascun pozzetto di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali). Prima di ogni raccolta delle cellule, mescolare bene la sospensione.
10. Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per rafforzare il raggruppamento delle cellule, migliorando così l'aggregazione cellulare, e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂.
11. Ogni 2-3 giorni, aggiorna il "mezzo di coltura 3D". Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente ed eliminare il 50% del terreno (100 μL) e aggiungere 100 μL di "terreno di coltura 3D" fresco per sostituire la soluzione esistente. Ripetere il punto 1.11 e riposizionare la piastra nell'incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂.
    NOTA: La rimozione del mezzo deve essere eseguita quando la piastra è tenuta a 45°, e il mezzo deve essere raccolto solo dalla parte superiore per evitare di raccogliere le celle. Non utilizzare un sistema di aspirazione a vuoto. Il mezzo fresco deve essere aggiunto lentamente e delicatamente per non interrompere gli sferoidi, che avranno già iniziato a formarsi.
12. Ispezionare le cellule al microscopio ogni 1-2 giorni per monitorare la formazione di sferoidi. Misurare il diametro degli sferoidi formati utilizzando lo strumento "scala" nel software di imaging (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: L'ispezione microscopica dovrebbe prima rivelare corpi irregolari da rotondi a ovali che assumono una forma sferoidale con il progredire del tempo^11,12.
    1. Quando il diametro sferoidale raggiunge 100-200 μm, eseguire gli esperimenti di efficacia del farmaco.
       NOTA: Gli esperimenti di efficacia dei farmaci vengono eseguiti quando gli sferoidi raggiungono questo diametro poiché, in quel momento, la maggior parte delle cellule sta proliferando, il che è favorevole alla valutazione della risposta al trattamento. Gli sferoidi di diametro maggiore contengono un nucleo necrotico e uno strato quiescente^11,12, risultando in una percentuale minore di cellule proliferanti che rispondono al trattamento.
13. Per la raccolta degli sferoidi, utilizzare una pipetta da 1.000 μL per raccogliere gli sferoidi da ciascun pozzetto e depositarli in un tubo conico da 15 ml.
    NOTA: Gli sferoidi sono intrinsecamente fragili e richiedono una manipolazione delicata. Quando si trasferisce il mezzo con gli sferoidi nel tubo conico, tenere il tubo a 45° e pipettare lentamente sulla parete del tubo. Gli sferoidi sono visibili agli occhi.
14. Centrifugare il tubo conico a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare ed eliminare con cura il surnatante utilizzando una pipetta.
15. Aggiungere 0,5 ml di terreno di coltura cellulare e risospendere il pellet bene ma delicatamente. Evita di fare bolle.
16. Eseguire il conteggio degli sferoidi seguendo i passaggi seguenti.
    1. Usa una piastra a 96 pozzetti e disegna un segno più sul lato inferiore di un pozzo per dividere il pozzo in quadranti (per aiutare a tracciare il conteggio).
    2. Aggiungere 50 μL della sospensione al pozzetto e contare manualmente gli sferoidi al microscopio (usando una lente obiettivo 10x).
    3. Conta gli sferoidi in ogni quadrante, fai attenzione a non contare due volte e calcola il numero totale di sferoidi nel pozzo.
       NOTA: Per la precisione del conteggio, contare almeno 50 sferoidi in un pozzo. Se ci sono meno di 50 sferoidi, mescolare delicatamente la sospensione per garantire una distribuzione omogenea e contare di nuovo utilizzando un volume maggiore della sospensione aggiunto a un nuovo pozzetto. In alternativa, se ci sono meno di 50 sferoidi in un pozzo, gli sferoidi possono essere centrifugati e risospesi delicatamente in un volume di <0,5 ml. Se ci sono più di 100 sferoidi, aggiungere terreno di coltura cellulare alla sospensione sferoide, mescolare delicatamente e ricontare.
    4. Calcolare la concentrazione sferoidale (conta degli sferoidi/volume di conteggio [μL]), quindi calcolare il numero totale di sferoidi nella sospensione (concentrazione sferoide × volume totale).

2. Saggio di efficacia del farmaco (saggio MTT)

NOTA: Per i dettagli, vedere van Meerloo et ^al.13. Inoltre, per il test MTT, deve essere utilizzato solo il terreno di coltura cellulare e non il "terreno di coltura 3D" (l'aggiunta della matrice della membrana basale non è necessaria e potrebbe potenzialmente interferire con il test MTT).

1. In una nuova provetta, preparare una sospensione sferoidale ad una concentrazione di 200 sferoidi per 200 μL di terreno di coltura cellulare (terreno di coltura RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1:100 penicillina-streptomicina, 1% aminoacidi non essenziali e 1% L-glutammina).
   1. Per ogni trattamento farmacologico, preparare una scorta di sferoidi in un tubo da 15 ml. Calcolare la quantità necessaria per ciascun farmaco in base al numero di pozzetti necessari per le ripetizioni: (5-8) × 200 μL. Aggiungere il farmaco al tubo alla concentrazione finale necessaria.
      NOTA: Si prega di consultare la sezione dei risultati rappresentativi per quanto riguarda i farmaci utilizzati per il presente studio e il loro dosaggio. Inoltre, i dettagli commerciali dei farmaci sono elencati nella tabella dei materiali.
2. Trasferire 200 μL della sospensione sferoidale nei pozzetti di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂. Non utilizzare le righe e le colonne esterne della piastra a 96 pozzetti per il test, poiché questi pozzetti sono caratterizzati da una maggiore evaporazione, che potrebbe portare ad una maggiore variabilità tra gli esperimenti ripetuti; invece, aggiungi PBS a questi pozzi.
   NOTA: È fondamentale che la coltura degli sferoidi sia omogenea prima che la coltura venga aliquotata nella piastra a 96 pozzetti. Inoltre, una condizione di controllo (cioè sferoidi non trattati) deve essere inclusa in ogni esperimento.
3. Dopo aver incubato gli sferoidi con il farmaco in studio per 24-72 ore, centrifugare la piastra a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente 170 μL del terreno di coltura cellulare, lasciando 30 μL (che include gli sferoidi) sul fondo del pozzetto.
   NOTA: La rimozione dei 170 μL di terreno di coltura cellulare deve essere effettuata con attenzione, in modo da non rimuovere gli sferoidi. Tenere la piastra a 45° e posizionare una mano (indossando un guanto scuro per contrasto) sotto i pozzetti in modo che gli sferoidi siano visibili (punti bianchi).
4. Preparare la soluzione MTT (0,714 mg/ml in RPMI privo di fenolo, vedere la Tabella dei materiali).
5. Aggiungere 70 μL di soluzione MTT a ciascun pozzetto fino a un volume finale di 100 μL per pozzetto (la concentrazione finale di MTT nel pozzetto sarà di 0,05 mg per 100 μL). Inoltre, preparare pozzetti "vuoti" con soluzione MTT senza celle.
   NOTA: MTT è sensibile alla luce. Pertanto, la luce nella cappa deve essere spenta e il tubo contenente la soluzione MTT deve essere coperto con un foglio di alluminio.
6. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ per 3-4 ore fino a quando non si osserva un cambiamento nel colore della soluzione nei pozzetti (il colore viola rappresenta le cellule vive).
7. Quando si osserva un cambiamento, aggiungere 100 μL di soluzione di arresto (0,1N HCl in isopropanolo) a ciascun pozzetto e mescolare delicatamente il contenuto dei pozzetti senza creare bolle.
8. Leggere l'assorbanza della piastra in un lettore Fluorometer-ELISA (vedere la Tabella dei Materiali) ad una lunghezza d'onda di 570 nm e una lunghezza d'onda di fondo di 630-690 nM.
   NOTA: Se il lettore Fluorometer-ELISA disponibile non è in grado di leggere la piastra ultrabassa con attacco a 96 pozzetti, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto su una corrispondente piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
9. Calcola la vitalità cellulare seguendo i passaggi seguenti.
   1. Per ogni pozzetto, calcolare il "segnale specifico" ("segnale specifico" = il segnale a 570 nm - il segnale a 630-690 nm). Quindi, calcolare il valore medio dei pozzi "Blank" e sottrarre questo valore da ciascun pozzo.
   2. Calcolare la media dei "segnali specifici" nei pozzetti di controllo che contengono cellule che non sono state trattate con il farmaco in studio ("AV-SS-unt").
   3. Calcola la vitalità (percentuale) delle cellule in ciascun pozzetto rispetto ai pozzetti con cellule non trattate.
      NOTA: Viabilità = (segnale specifico in ciascun pozzetto/"AV-SS-unt") × 100

3. Monitoraggio e analisi dei cambiamenti morfologici negli sferoidi

NOTA: Per quanto riguarda il test MTT, in questa valutazione deve essere utilizzato solo il terreno di coltura cellulare e non il "terreno di coltura 3D" (l'aggiunta della matrice della membrana basale non è necessaria e potrebbe potenzialmente interferire con l'analisi).

1. Dopo aver contato gli sferoidi, diluire la sospensione in terreno di coltura cellulare (terreno di coltura RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1:100 penicillina-streptomicina, 1% aminoacidi non essenziali e 1% L-glutammina) a circa 1-2 sferoidi per 20 μL.
2. Inserire 80 μL di terreno di coltura cellulare nei pozzetti di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti, quindi aggiungere 20 μL della sospensione sferoidale ai pozzetti.
   NOTA: I pozzetti conterranno quindi 1-2 sferoidi in un volume di 100 μL.
3. Controllare attentamente i pozzetti al microscopio e contrassegnare i pozzetti che contengono uno sferoide, poiché verranno utilizzati per questa analisi.
4. Preparare il farmaco in studio in una concentrazione che è il doppio della concentrazione di interesse. Aggiungere 100 μL della soluzione farmacologica ai pozzetti pertinenti (la concentrazione totale nel pozzetto sarà quindi 1x).
5. Acquisire un'immagine di ciascun pozzetto al giorno 0 (prima di aggiungere il farmaco in studio) e utilizzare lo strumento "scala" nel software di imaging (vedere la tabella dei materiali) per determinare i diametri degli sferoidi.
6. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂, esaminare la morfologia e misurare il diametro degli sferoidi (utilizzando lo strumento "scala") ogni giorno per 3-7 giorni, a seconda di quando si osserva l'effetto del farmaco (ad esempio, disseminazione cellulare, baccelli invasivi, distruzione della struttura, ecc.).
7. Alla fine dell'esperimento, tracciare i cambiamenti nei diametri sferoidi (relativi al giorno 0) nel tempo.
   NOTA: Variazione (percentuale) = (diametro sferoide in un giorno specifico/diametro di quello sferoide al giorno 0) × 100

Risultati

Questo protocollo presenta procedure per generare una coltura omogenea di sferoidi da cellule tumorali primarie, valutando quantitativamente l'efficacia del farmaco sulla coltura sferoidale (saggio MTT) e determinando l'effetto dei farmaci in studio sulla morfologia sferoide. Vengono presentati i dati degli esperimenti rappresentativi in sferoidi generati da colture cellulari di cancro al colon e al seno. Esperimenti simili sono stati eseguiti utilizzando altri tipi di tumore, tra cui colangiocarcinoma, gastrico, polmona...

Discussione

Il presente protocollo descrive un metodo semplice per generare colture cellulari primarie 3D (sferoidi) derivate da campioni tumorali umani. Questi sferoidi possono essere utilizzati per varie analisi, tra cui la valutazione di potenziali candidati farmaci e combinazioni di farmaci, l'identificazione di potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e lo studio dei meccanismi di risposta e resistenza. Il protocollo utilizza cellule tumorali primarie derivate direttamente da campioni di pazienti o cellule tumorali da mod...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracil	TEVA Israel	lot 16c22NA	Fluorouracil, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Flurometer ELISA reader	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	320331	for stop solution
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.52a	Open-source software ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	for stop solution
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Palbociclib	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	2119399
Phenol-free RPMI 1640	Biological industries, Israel	01-103-1A
Pippeting reservoir	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0.5% solution	Biological industries, Israel	03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine