Создание 3-мерных сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценка их чувствительности к лекарствам

Резюме

Настоящий протокол описывает создание 3D-моделей опухолевых культур из первичных раковых клеток и оценку их чувствительности к лекарственным средствам с использованием анализов жизнеспособности клеток и микроскопических исследований.

Аннотация

Несмотря на замечательные успехи в понимании биологии опухоли, подавляющее большинство кандидатов на онкологические препараты, участвующие в клинических испытаниях, терпят неудачу, часто из-за отсутствия клинической эффективности. Эта высокая частота неудач подчеркивает неспособность современных доклинических моделей предсказывать клиническую эффективность, главным образом из-за их неадекватности в отражении гетерогенности опухоли и микроокружения опухоли. Эти ограничения могут быть устранены с помощью 3-мерных (3D) культуральных моделей (сфероидов), созданных из образцов опухолей человека, полученных от отдельных пациентов. Эти 3D-культуры представляют реальную биологию лучше, чем установленные клеточные линии, которые не отражают гетерогенность опухоли. Кроме того, 3D-культуры лучше, чем 2-мерные (2D) модели культур (монослойные структуры), поскольку они воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия, и сохраняют естественную форму и рост клеток. В настоящем исследовании был разработан метод получения первичных культур раковых клеток от отдельных пациентов, которые являются 3D и растут в многоклеточных сфероидах. Клетки могут быть получены непосредственно из опухолей пациента или ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Метод широко применим к солидным опухолям (например, толстой кишки, молочной железы и легких), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен в полном объеме в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Представлен протокол генерации 3D-моделей опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценки их чувствительности к лекарственным препаратам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Эти многоклеточные сфероиды могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов в лекарства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.

Введение

Исследования in vitro и in vivo представляют собой взаимодополняющие подходы к разработке методов лечения рака. Модели in vitro позволяют контролировать большинство экспериментальных переменных и облегчают количественный анализ. Они часто служат недорогими платформами для скрининга, а также могут использоваться для механистических исследований¹. Однако их биологическая значимость по своей сути ограничена, поскольку такие модели лишь частично отражают микроокружение опухоли¹. Напротив, модели in vivo, такие как ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), фиксируют сложность микроокружения опухоли и больше подходят для трансляционных исследований и индивидуализации лечения у пациентов (т.е. исследования реакции на лекарства в модели, полученной от отдельного пациента)¹. Однако модели in vivo не способствуют высокопроизводительным подходам к скринингу лекарств, поскольку экспериментальные параметры не могут контролироваться так же жестко, как модели in vitro, и потому что их разработка требует много времени, труда и средств ^1,2.

Модели in vitro доступны уже более 100 лет, а клеточные линии доступны уже более 70 лет³. Однако за последние несколько десятилетий сложность доступных моделей солидных опухолей in vitro резко возросла. Эта сложность варьируется от 2-мерных (2D) моделей культивирования (монослойных структур), которые являются либо укоренившимися клеточными линиями, полученными из опухоли, либо первичными клеточными линиями, до более поздних подходов, включающих 3-мерные (3D) модели¹. В 2D-моделях ключевое различие между установленными и первичными клеточными линиями⁴. Установленные клеточные линии увековечены; Таким образом, одна и та же клеточная линия может использоваться во всем мире в течение многих лет, что с исторической точки зрения облегчает сотрудничество, накопление данных и разработку многих стратегий лечения. Однако генетические аберрации в этих клеточных линиях накапливаются с каждым проходом, что ставит под угрозу их биологическую значимость. Кроме того, ограниченное количество доступных клеточных линий не отражает гетерогенность опухолей у пациентов ^4,5. Первичные линии раковых клеток получают непосредственно из резецированных образцов опухолей, полученных с помощью биопсии, плеврального выпота или резекций. Таким образом, первичные линии раковых клеток более биологически значимы, поскольку они сохраняют элементы микроокружения опухоли и характеристики опухоли, такие как межклеточное поведение (например, перекрестные помехи между здоровыми и раковыми клетками) и стволовые фенотипы раковых клеток. Однако репликативная способность первичных клеточных линий ограничена, что приводит к узкому времени культивирования и ограничивает количество опухолевых клеток, которые могут быть использованы для анализов ^4,5.

Модели, использующие 3D-культуры, более биологически значимы, чем модели 2D-культур, поскольку сохраняются условия in vivo. Таким образом, 3D-модели культур сохраняют естественную форму и рост клеток и воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия. Наиболее часто используемые 3D-модели в исследованиях рака включают многоклеточные сфероиды, структуры на основе скаффолдов и культуры с матрицей ^4,6,7.

Настоящий протокол генерирует 3D-модели опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценивает их чувствительность к лекарственным средствам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Репрезентативные результаты, представленные в настоящем документе, относятся к раку молочной железы и толстой кишки; Тем не менее, этот протокол широко применим к другим типам солидных опухолей (например, холангиокарциноме, раку желудка, легких и поджелудочной железы), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен полностью в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Многоклеточные сфероиды, полученные с использованием этого подхода, могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов на лекарственные средства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.

Этот протокол разделен на три раздела: (1) генерация, сбор и подсчет сфероидов при подготовке к их использованию в качестве модели для тестирования эффективности лекарств; (2) анализ МТТ для оценки эффективности лекарственного средства на сфероидах; и (3) микроскопическая оценка морфологических изменений после обработки сфероидов лекарственными препаратами в качестве еще одного подхода к оценке эффективности лекарственного средства (рис. 1).

протокол

Сбор образцов опухолей человека, используемых для первичных культур опухолевых клеток, проводился в соответствии с протоколами, одобренными институциональным наблюдательным советом (IRB) в Медицинском центре им. Рабина, с письменного информированного согласия пациентов. Пациенты, имеющие право на участие в исследовании, включали взрослых и детей мужского и женского пола с неметастатическим раком молочной железы, толстой кишки, печени, легких, нейроэндокринным раком, раком яичников или поджелудочной железы, любым детским раком или любым метастатическим раком. Единственным критерием исключения является отсутствие возможности дать информированное согласие.

1. Генерация и сбор сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение первичных опухолевых клеток может быть выполнено, как описано Kodak et ^al.8. Важно отметить, что первичные опухолевые клетки, используемые для генерации сфероидов, могут быть получены непосредственно из образцов пациентов, полученных с помощью биопсии, резекции и т. д., или косвенно с использованием образцов опухолей из моделей ксенотрансплантата пациента (PDX), как описано Moskovits et ^al.9.

1. Приготовьте одноклеточную суспензию адгезивных первичных опухолевых клеточных культур с 75%-100% слиянием, взяв небольшую колбу (T25) с одноклеточной адгезивной первичной клеточной культурой, удалив среду для клеточных культур, промыв PBS, а затем добавив 1 мл 1x Accutase (раствор для отсоединения клеток) (см. Таблицу материалов) в течение 3 мин при 37 ° C.
2. Нейтрализуют раствор аккутазы, добавляя 5 мл среды для культивирования клеток (питательная среда RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1:100 пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глютамина; см. Таблицу материалов).
3. Аспирируйте клетки серологической пипеткой объемом 10 мл и поместите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 800 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Удалите среду для культивирования клеток, добавьте 5 мл свежей среды для культивирования клеток поверх гранулы клеток и аккуратно перемешайте.
5. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра¹⁰. Для этого берут аликвоту 50 мкл клеточной суспензии, и смешивают ее с 50 мкл трипанового синего. Подсчитайте живые клетки (клетки, которые отрицательны для синего цвета) и рассчитайте общее количество живых клеток в суспензии.
6. Приготовьте «3D-питательную среду» (среду для культивирования клеток, дополненную 5% матриксом базальной мембраны; см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: «3D-питательная среда» имеет жидкую форму при комнатной температуре. При 37 ° C консистенция становится более гелеобразной (так что клетки остаются вместе), хотя ее все еще можно пипетировать (поскольку она содержит только 5% матрикса базальной мембраны).
7. Рассчитайте количество клеток, необходимых для анализа, и общий требуемый объем; каждая лунка должна содержать 2 000-8 000 клеток в 200 мкл среды.
8. Приготовьте клеточную суспензию с желаемым количеством клеток (например, 4000 клеток) в 200 мкл «3D-питательной среды» и аккуратно перемешайте с пипеткой, чтобы обеспечить однородное распределение.
9. Перенесите суспензию в резервуар для пипетки. Используя многоканальную пипетку, добавьте 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой (см. Таблицу материалов). Перед каждым сбором клеток хорошо перемешивайте суспензию.
10. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы усилить кластеризацию клеток, тем самым улучшая агрегацию клеток, и инкубируйте планшет при 37 ° C в 5% увлажненном инкубаторе CO₂.
11. Каждые 2-3 дня обновляйте «3D-питательную среду». Центрифугируйте пластину при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре, осторожно удалите и выбросьте 50% среды (100 мкл) и добавьте 100 мкл свежей «3D-питательной среды» для замены существующего раствора. Повторите шаг 1.11 и поместите тарелку обратно в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO₂.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление среды должно производиться, когда пластина удерживается под углом 45°, и среда должна собираться только из верхней части, чтобы избежать скопления клеток. Не следует использовать вакуумную систему всасывания. Свежую среду нужно добавлять медленно и аккуратно, чтобы не нарушить сфероиды, которые уже начнут формироваться.
12. Осматривайте клетки под микроскопом каждые 1-2 дня, чтобы контролировать образование сфероидов. Измерьте диаметр сформированных сфероидов с помощью инструмента «масштаб» в программном обеспечении для обработки изображений (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопический осмотр должен сначала выявить неправильные круглые и овальные тела, которые принимают сфероидальную форму с течением времени^11,12.
    1. Когда диаметр сфероида достигнет 100-200 мкм, проводят эксперименты по эффективности препарата.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по эффективности лекарств проводятся, когда сфероиды достигают этого диаметра, поскольку в это время большинство клеток размножаются, что способствует оценке ответа на лечение. Сфероиды большего диаметра содержат некротическое ядро и покойный слой^11,12, что приводит к меньшей доле пролиферирующих клеток, которые реагируют на лечение.
13. Для сбора сфероидов используйте пипетку объемом 1000 мкл, чтобы собрать сфероиды из каждой лунки и поместить их в коническую пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды по своей природе хрупкие и требуют бережного обращения. При переносе среды со сфероидами в коническую трубку держите пробирку под углом 45° и медленно пипеткой наносите на стенку пробирки. Сфероиды видны глазу.
14. Центрифугируйте коническую пробирку при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
15. Добавьте 0,5 мл среды для культивирования клеток и хорошо и осторожно ресуспендируйте гранулу. Избегайте образования пузырей.
16. Выполните подсчет сфероидов, выполнив следующие действия.
    1. Используйте табличку с 96 лунками и нарисуйте знак плюса на нижней стороне колодца, чтобы разделить скважину на квадранты (чтобы помочь отслеживать подсчет).
    2. Добавьте 50 мкл суспензии в лунку и подсчитайте сфероиды вручную под микроскопом (используя 10-кратную линзу объектива).
    3. Подсчитайте сфероиды в каждом квадранте, будьте осторожны, чтобы не пересчитать дважды, и рассчитайте общее количество сфероидов в колодце.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для точности подсчета насчитайте не менее 50 сфероидов в лунке. Если сфероидов менее 50, аккуратно перемешайте суспензию, чтобы обеспечить однородное распределение, и снова посчитайте, используя больший объем суспензии, добавленный в новую лунку. В качестве альтернативы, если в лунке менее 50 сфероидов, сфероиды можно центрифугировать и осторожно ресуспендировать в объеме <0,5 мл. Если сфероидов более 100, добавьте среду для культивирования клеток в суспензию сфероида, аккуратно перемешайте и пересчитайте.
    4. Рассчитайте концентрацию сфероидов (количество сфероидов/объем подсчета [мкл]), а затем рассчитайте общее количество сфероидов в суспензии (концентрация сфероида × общий объем).

2. Анализ эффективности лекарственного средства (анализ МТТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробнее см. van Meerloo et ^al.13. Кроме того, для анализа МТТ необходимо использовать только среду для культивирования клеток, а не «3D-питательную среду» (добавление матрицы базальной мембраны не требуется и потенциально может помешать анализу МТТ).

1. В новой пробирке готовят сфероидную суспензию в концентрации 200 сфероидов на 200 мкл среды для культивирования клеток (питательная среда RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1:100 пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глютамина).
   1. Для каждого медикаментозного лечения подготовьте запас сфероидов в пробирке объемом 15 мл. Рассчитайте количество, необходимое для каждого препарата, по количеству лунок, необходимых для повторов: (5-8) × 200 мкл. Добавьте препарат в пробирку до конечной необходимой концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с репрезентативным разделом результатов, касающимся лекарств, используемых для настоящего исследования, и их дозировки. Кроме того, коммерческие детали препаратов перечислены в Таблице материалов.
2. Перенесите 200 мкл сфероидной суспензии в лунки 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой и инкубируйте пластину при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂. Не используйте для анализа внешние ряды и колонки 96-луночной пластины, так как эти лунки характеризуются повышенным испарением, что может привести к повышенной вариабельности между повторными экспериментами; вместо этого добавьте PBS в эти скважины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы культура сфероидов была однородной до того, как культура будет аликвотирована в 96-луночную пластину. Кроме того, контрольное условие (т.е. необработанные сфероиды) должно быть включено в каждый эксперимент.
3. После инкубации сфероидов с исследуемым препаратом в течение 24-72 ч центрифугируют планшет при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно удаляют 170 мкл среды для культивирования клеток, оставляя 30 мкл (включая сфероиды) на дне лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление 170 мкл среды для культивирования клеток должно производиться осторожно, чтобы не удалить сфероиды. Держите пластину под углом 45° и положите одну руку (в темной перчатке для контраста) под лунки так, чтобы были видны сфероиды (белые точки).
4. Приготовьте раствор МТТ (0,714 мг/мл в RPMI, не содержащем фенола, см. Таблицу материалов).
5. Добавьте 70 мкл раствора МТТ в каждую лунку до конечного объема 100 мкл на лунку (конечная концентрация МТТ в лунке составит 0,05 мг на 100 мкл). Кроме того, подготовьте «Холостые» лунки с раствором МТТ без ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: МТТ чувствителен к свету. Поэтому свет в вытяжке необходимо выключить, а трубку, содержащую раствор МТТ, накрыть алюминиевой фольгой.
6. Инкубируют планшет при 37 °C в 5%-ном увлажненном инкубаторе CO₂ в течение 3-4 ч до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение цвета раствора в лунках (фиолетовый цвет представляет собой живые клетки).
7. При наблюдении изменения добавьте 100 мкл стоп-раствора (0,1 Н HCl в изопропаноле) в каждую лунку и аккуратно перемешайте содержимое лунок, не создавая пузырьков.
8. Считайте поглощение пластины в считывателе флуорометра-ИФА (см. Таблицу материалов) при длине волны 570 нм и фоновой длине волны 630-690 нМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если имеющийся считыватель флуорометра-ИФА не может считывать 96-луночную пластину со сверхнизкой насадкой, перенесите содержимое каждой лунки на соответствующую 96-луночную пластину с плоским дном.
9. Рассчитайте жизнеспособность клеток, выполнив следующие действия.
   1. Для каждой скважины рассчитайте «удельный сигнал» («удельный сигнал» = сигнал на длине волны 570 нм – сигнал на длине волны 630-690 нм). Затем рассчитайте среднее значение скважин «Холостые» и вычтите это значение из каждой скважины.
   2. Рассчитайте среднее значение «специфических сигналов» в контрольных лунках, которые содержат клетки, которые не были обработаны исследуемым препаратом («AV-SS-unt»).
   3. Рассчитайте жизнеспособность (процент) клеток в каждой лунке относительно лунок с необработанными клетками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность = (удельный сигнал в каждой скважине/"AV-SS-unt") × 100

3. Мониторинг и анализ морфологических изменений сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается анализа МТТ, в этой оценке следует использовать только среду для культивирования клеток, а не «3D-питательную среду» (добавление матрицы базальной мембраны не является необходимым и потенциально может помешать анализу).

1. После подсчета сфероидов разбавьте суспензию в среде для культивирования клеток (питательная среда RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1:100 пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глютамина) примерно до 1-2 сфероидов на 20 мкл.
2. Поместите 80 мкл среды для культивирования клеток в лунки 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой, а затем добавьте в лунки 20 мкл сфероидной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, лунки будут содержать 1-2 сфероида объемом 100 мкл.
3. Внимательно проверьте лунки под микроскопом и отметьте лунки, которые содержат один сфероид, так как они будут использоваться для этого анализа.
4. Приготовьте исследуемый препарат в концентрации, в два раза превышающей интересующую концентрацию. Добавьте 100 мкл раствора препарата в соответствующие лунки (тогда общая концентрация в лунке будет равна 1x).
5. Сделайте снимок каждой лунки в день 0 (перед добавлением исследуемого препарата) и используйте инструмент «масштабирования» в программном обеспечении для визуализации (см. Таблицу материалов) для определения диаметров сфероидов.
6. Инкубируйте планшет при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂, исследуйте морфологию и измеряйте диаметр сфероидов (с помощью инструмента «масштаб») ежедневно в течение 3-7 дней, в зависимости от того, когда наблюдается эффект препарата (например, диссеминация клеток, инвазивные стручки, разрушение структуры и т. д.).
7. В конце эксперимента постройте график изменения диаметров сфероидов (относительно Дня 0) с течением времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение (в процентах) = (диаметр сфероида в определенный день / диаметр этого сфероида в день 0) × 100

Результаты

В этом протоколе представлены процедуры получения гомогенной культуры сфероидов из первичных опухолевых клеток, количественной оценки эффективности препарата на культуре сфероидов (анализ МТТ) и определения влияния исследуемых препаратов на морфологию сфероидов. Представлены данн?...

Обсуждение

Настоящий протокол описывает простой способ получения 3D-первичных клеточных культур (сфероидов), полученных из образцов опухолей человека. Эти сфероиды могут быть использованы для различных анализов, включая оценку потенциальных кандидатов на лекарства и комбинации лекарств, иденти?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracil	TEVA Israel	lot 16c22NA	Fluorouracil, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Flurometer ELISA reader	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	320331	for stop solution
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.52a	Open-source software ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	for stop solution
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Palbociclib	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	2119399
Phenol-free RPMI 1640	Biological industries, Israel	01-103-1A
Pippeting reservoir	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0.5% solution	Biological industries, Israel	03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine