환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

요약

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

초록

종양 생물학에 대한 이해의 놀라운 발전에도 불구하고, 임상 시험에 참여하는 종양학 약물 후보의 대다수는 종종 임상 효능의 부족으로 인해 실패합니다. 이 높은 실패율은 주로 종양 이질성과 종양 미세 환경을 반영하는 데 부적절하기 때문에 현재 전임상 모델이 임상 효능을 예측할 수 없음을 보여줍니다. 이러한 한계는 개별 환자에서 추출한 인간 종양 샘플에서 확립된 3차원(3D) 배양 모델(스페로이드)로 해결할 수 있습니다. 이러한 3D 배양은 종양 이질성을 반영하지 않는 기존 세포주보다 실제 생물학을 더 잘 나타냅니다. 또한 3D 배양은 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제하고 자연적인 세포 형태 및 성장을 보존하기 때문에 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)보다 우수합니다. 본 연구에서는 3D 및 다세포 스페로이드에서 성장하는 개별 환자로부터 암세포의 1차 배양물을 제조하는 방법을 개발했습니다. 세포는 환자 종양 또는 환자 유래 이종이식으로부터 직접 유래될 수 있다. 이 방법은 고형 종양(예: 결장, 유방 및 폐)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다. 여기에서는 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사라는 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이러한 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

시험관 내 및 생체 내 연구는 암 치료법 개발을 위한 보완적인 접근 방식을 나타냅니다. 체외 모델은 대부분의 실험 변수를 제어하고 정량적 분석을 용이하게 합니다. 그들은 종종 저비용 스크리닝 플랫폼 역할을 하며 기계론적 연구에도 사용할 수 있습니다¹. 그러나, 이들의 생물학적 관련성은 본질적으로 제한적인데, 그러한 모델은 종양 미세환경을 부분적으로만 반영하기 때문이다¹. 대조적으로, 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 생체 내 모델은 종양 미세 환경의 복잡성을 포착하고 환자의 중개 연구 및 개별화 치료(즉, 개별 환자에서 파생된 모델에서 약물에 대한 반응 ^조사)에 더 적합합니다1. 그러나 생체 내 모델은 실험 매개 변수를 시험관 내 모델만큼 엄격하게 제어 할 수 없으며 개발에 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 약물 스크리닝을위한 고 처리량 접근법에 도움이되지 않습니다 ^1,2.

시험관 내 모델은 100년 이상 사용되어 왔으며 세포주는 70년 이상 사용되어 왔습니다³. 그러나 지난 수십 년 동안 고형 종양의 시험관 내 모델의 복잡성이 극적으로 증가했습니다. 이러한 복잡성은 종양 유래 확립된 세포주 또는 1차 세포주인 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)에서 3차원(3D^{) 모델을 포함하는} 최신 접근 방식에 이르기까지 다양합니다1. 2D 모델 내에서, 확립된 세포주와 일차 세포주 사이의 중요한 차이점이 있다⁴. 확립 된 세포주는 불멸화됩니다. 따라서 동일한 세포주를 수년에 걸쳐 전 세계적으로 사용할 수 있으며, 이는 역사적 관점에서 협업, 데이터 축적 및 많은 치료 전략의 개발을 용이하게 합니다. 그러나 이러한 세포주의 유전적 이상은 모든 통과와 함께 축적되어 생물학적 관련성을 손상시킵니다. 또한, 이용가능한 세포주의 제한된 수는 환자에서 종양의 이질성을 반영하지 않는다 ^4,5. 원발성 암 세포주는 생검, 흉막 삼출액 또는 절제를 통해 얻은 절제된 종양 샘플에서 직접 파생됩니다. 따라서 원발성 암 세포주는 종양 미세 환경 및 종양 특성의 요소, 예를 들어 세포간 행동(예: 건강한 세포와 암세포 간의 누화) 및 암세포의 줄기 유사 표현형을 보존하기 때문에 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 그러나, 일차 세포주의 복제 능력은 제한되어 있어 배양 시간이 짧아지고 분석에 사용할 수 있는 종양 세포의 수가 제한된다 ^4,5.

3D 배양을 사용하는 모델은 생체 내 조건이 유지되기 때문에 2D 배양 모델보다 생물학적으로 더 관련성이 높습니다. 따라서 3D 배양 모델은 자연적인 세포 형태와 성장을 보존하고 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제합니다. 암 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 3D 모델에는 다세포 스페로이드, 스캐폴드 기반 구조 및 매트릭스 내장 배양이 포함됩니다 ^4,6,7.

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사의 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가합니다. 본원에 제시된 대표적인 결과는 유방암 및 결장암; 그러나 이 프로토콜은 다른 고형 종양 유형(예: 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있기 때문에 비용 효율적입니다. 이 접근법을 사용하여 생성된 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다: (1) 약물 효능을 테스트하기 위한 모델로 사용하기 위한 준비에서 스페로이드의 생성, 수집 및 계수; (2) 스페로이드에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 MTT 분석; (3) 약물 효능을 평가하기 위한 또 다른 접근 방식으로서 스페로이드를 약물로 처리한 후 형태학적 변화를 현미경으로 평가합니다(그림 1).

프로토콜

원발성 종양 세포 배양에 사용된 인간 종양 샘플의 수집은 환자의 서면 동의와 함께 Rabin Medical Center에서 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 연구에 참여할 수 있는 환자는 비전이성 유방암, 결장암, 간암, 폐암, 신경내분비암, 난소암 또는 췌장암, 소아암 또는 전이성 암이 있는 남성 및 여성 성인 및 소아암 환자를 포함했습니다. 유일한 제외 기준은 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있는 능력이 부족하다는 것이었습니다.

1. 스페로이드의 생성 및 수집

참고: 원발성 종양 세포의 분리는 Kodak et ^al.8에 설명된 대로 수행할 수 있습니다. 중요하게도, 스페로이드를 생성하는데 사용되는 원발성 종양 세포는 생검, 절제 등에 의해 얻어진 환자 샘플로부터 직접 유도될 수 있거나, Moskovits et ^al.9에 의해 기술된 바와 같이, 환자-유래 이종이식 (PDX) 모델로부터의 종양 샘플을 사용하여 간접적으로 유래될 수 있다.

1. 단일 세포 부착 일차 세포 배양액이 있는 작은 플라스크(T25)를 취하여 75%-100% 합류의 부착성 원발성 종양 세포 배양액의 단일 세포 현탁액을 준비하고, 세포 배양 배지를 제거하고, PBS로 세척한 다음, 1x Accutase(세포 분리 용액)( 재료 표 참조) 1mL를 37°C에서 3분 동안 첨가합니다.
2. 세포 배양 배지 5mL(10% FBS, 1:100 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배양 배지, 재료 표 참조)를 추가하여 Accutase 용액을 중화합니다.
3. 10mL 혈청학적 피펫으로 세포를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 증착합니다. 튜브를 실온에서 800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 세포 배양 배지를 제거하고 세포 펠릿 위에 신선한 세포 배양 배지 5mL를 넣고 부드럽게 혼합합니다.
5. 혈구계¹⁰으로 생존 세포를 계수한다. 이를 위해 세포 현탁액 50μL의 분취량을 취하여 50μL의 트리판 블루와 혼합합니다. 살아있는 세포(파란색에 대해 음수인 세포)를 세고 현탁액에 있는 살아있는 세포의 총 수를 계산합니다.
6. "3D 배양 배지"(5% 기저막 매트릭스로 보충된 세포 배양 배지; 재료 표 참조)를 준비합니다.
   참고: "3D 배양 배지"는 실온에서 액체와 같습니다. 37°C에서는 농도가 더 겔처럼 되어(세포가 함께 유지되도록) 피펫팅할 수 있습니다(기저막 매트릭스가 5%만 포함되어 있기 때문에).
7. 분석에 필요한 세포 수와 필요한 총 부피를 계산합니다. 각 웰은 200μL의 배지에 2,000-8,000개의 세포를 포함해야 합니다.
8. 200 μL의 "3D 배양 배지"에 원하는 수의 세포(예: 4,000개 세포)의 세포 현탁액을 준비하고 균질한 분포를 보장하기 위해 피펫과 부드럽게 혼합합니다.
9. 현탁액을 피펫팅 저장소로 옮깁니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 200μL의 세포 현탁액을 초저 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다( 재료 표 참조). 세포를 채취하기 전에 현탁액을 잘 섞는다.
10. 플레이트를 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포의 클러스터링을 시행하고, 세포 응집을 개선하고, 플레이트를 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.
11. 2-3일마다 "3D 배양 배지"를 새로 고칩니다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 300 x g 로 원심분리하고, 배지(100 μL)의 50%를 부드럽게 제거 및 버리고, 100 μL의 신선한 "3D 배양 배지"를 추가하여 기존 용액을 대체합니다. 단계 1.11을 반복하고, 플레이트를 다시 37°C, 5%_CO2 가습 인큐베이터에 넣는다.
    참고: 배지 제거는 플레이트를 45°로 유지한 상태에서 수행해야 하며, 배지는 세포가 수집되지 않도록 상부에서만 수집해야 합니다. 진공 흡입 시스템을 사용해서는 안 됩니다. 신선한 배지는 이미 형성되기 시작한 스페로이드를 방해하지 않도록 천천히 부드럽게 첨가해야 합니다.
12. 스페로이드 형성을 모니터링하기 위해 1-2일마다 현미경으로 세포를 검사합니다. 이미징 소프트웨어의 "스케일" 도구를 사용하여 형성된 스페로이드의 직경을 측정합니다( 재료 표 참조).
    참고: 현미경 검사는 먼저 시간이 지남에 따라 스페로이드 모양을 취하는 불규칙한 원형에서 타원형의 몸체를 밝혀야 합니다^11,12.
    1. 스페로이드 직경이 100-200 μm에 도달하면 약물 효능 실험을 수행합니다.
       참고: 약물 효능 실험은 스페로이드가 이 직경에 도달할 때 수행되며, 그 당시 대부분의 세포가 증식하여 치료에 대한 반응을 평가하는 데 도움이 됩니다. 더 큰 직경의 스페로이드는 괴사 코어와 정지 층^11,12를 함유하여^, 치료에 반응하는 증식 세포의 비율이 더 작다.
13. 스페로이드 수집을 위해 1,000μL 피펫을 사용하여 각 웰에서 스페로이드를 수집하고 15mL 코니컬 튜브에 증착합니다.
    알림: 스페로이드는 본질적으로 깨지기 쉬우므로 조심스럽게 다루어야 합니다. 스페로이드가 있는 매체를 원뿔형 튜브로 옮길 때 튜브를 45°로 잡고 튜브 벽에 천천히 피펫을 끼웁니다. 스페로이드는 눈으로 볼 수 있습니다.
14. 원뿔형 튜브를 실온에서 300 x g 로 5분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인하고 버립니다.
15. 세포 배양 배지 0.5mL를 넣고 펠렛을 잘 그러나 부드럽게 재현탁합니다. 거품을 만들지 마십시오.
16. 아래 단계에 따라 스페로이드 카운팅을 수행합니다.
    1. 96웰 플레이트를 사용하고 우물 밑면에 더하기 기호를 그려 우물을 사분면으로 나눕니다(계수 추적에 도움이 됨).
    2. 50 μL의 현탁액을 웰에 넣고 현미경으로 수동으로 스페로이드를 계수합니다(10x 대물 렌즈 사용).
    3. 각 사분면의 스페로이드를 세고, 두 번 세지 않도록 주의하고, 우물에 있는 스페로이드의 총 수를 계산합니다.
       알림: 계산의 정확성을 위해 우물에서 최소 50개의 스페로이드를 계수하십시오. 스페로이드가 50개 미만인 경우 현탁액을 부드럽게 혼합하여 균질한 분포를 보장하고 새 웰에 추가된 더 많은 양의 현탁액을 사용하여 다시 계산합니다. 또는 웰에 스페로이드가 50개 미만인 경우 스페로이드를 원심분리하고 <0.5mL 부피로 부드럽게 재현탁할 수 있습니다. 스페로이드가 100개 이상인 경우 세포 배양 배지를 스페로이드 현탁액에 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 다시 계산합니다.
    4. 스페로이드 농도(스페로이드 수/계수 부피[μL])를 계산한 다음 현탁액의 총 스페로이드 수(스페로이드 농도 × 총 부피)를 계산합니다.

2. 약효 분석(MTT assay)

참고: 자세한 내용은 van Meerloo et ^al.13을 참조하십시오. 또한 MTT 분석의 경우 "3D 배양 배지"가 아닌 세포 배양 배지만 사용해야 합니다(기저막 매트릭스를 추가할 필요가 없으며 잠재적으로 MTT 분석을 방해할 수 있음).

1. 새로운 튜브에서 세포 배양 배지 200μL당 스페로이드 200개 농도의 스페로이드 현탁액을 준비합니다(10% FBS, 1:100 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배양 배지).
   1. 각 약물 처리에 대해 15mL 튜브에 스페로이드 스톡을 준비합니다. 반복에 필요한 웰 수로 각 약물에 필요한 양을 계산하십시오 : (5-8) × 200 μL. 필요한 최종 농도까지 튜브에 약물을 첨가하십시오.
      참고: 현재 연구에 사용된 약물 및 복용량에 대한 대표 결과 섹션을 참조하십시오. 또한 약물의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.
2. 200 μL의 스페로이드 현탁액을 초저부착 96-웰 플레이트의 웰 내로 옮기고, 플레이트를 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다. 분석을 위해 96-웰 플레이트의 외부 행과 열을 사용하지 마십시오., 이러한 웰은 증가된 증발을 특징으로 하므로 반복 실험 간의 변동성이 증가할 수 있습니다.; 대신 이 웰에 PBS를 추가합니다.
   참고: 배양물이 96웰 플레이트에 분주되기 전에 스페로이드의 배양이 균질해야 합니다. 또한 모든 실험에는 대조 조건(즉, 처리되지 않은 스페로이드)이 포함되어야 합니다.
3. 스페로이드를 연구 약물과 함께 24-72시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 170 μL의 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고, 30 μL(스페로이드 포함)를 웰 바닥에 남겨둔다.
   참고: 170μL의 세포 배양 배지는 스페로이드가 제거되지 않도록 조심스럽게 제거해야 합니다. 플레이트를 45°로 잡고 한 손(대비를 위해 어두운 장갑을 끼고)을 웰 아래에 놓아 스페로이드가 보이도록(흰색 점) 합니다.
4. MTT 용액(페놀이 없는 RPMI에서 0.714mg/mL, 재료 표 참조)을 준비합니다.
5. 70μL의 MTT 용액을 각 웰에 웰당 100μL의 최종 부피에 추가합니다(웰의 최종 MTT 농도는 100μL당 0.05mg임). 또한, 세포가없는 MTT 용액으로 "블랭크 (Blank)"웰을 준비하십시오.
   알림: MTT는 빛에 민감합니다. 따라서 후드의 조명을 꺼야 하며 MTT 용액이 들어 있는 튜브를 알루미늄 호일로 덮어야 합니다.
6. 플레이트를 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 웰 내의 용액의 색 변화(보라색은 살아있는 세포를 나타냄)가 관찰될 때까지 3-4시간 동안 인큐베이션한다.
7. 변화가 관찰되면 각 웰에 정지 용액(이소프로판올 중 0.1N HCl) 100μL를 추가하고 기포를 생성하지 않고 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다.
8. 570 nm의 파장과 630-690 nM의 배경 파장에서 Fluorometer-ELISA 판독기 ( 재료 표 참조)에서 플레이트의 흡광도를 읽습니다.
   알림: 사용 가능한 형광계-ELISA 판독기가 초저 부착 96웰 플레이트를 읽을 수 없는 경우 각 웰의 내용물을 해당 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다.
9. 아래 단계에 따라 세포 생존율을 계산하십시오.
   1. 각 웰에 대해 "특정 신호"( "특정 신호"= 570 nm의 신호 - 630-690 nm의 신호)를 계산하십시오. 그런 다음 "블랭크" 웰의 평균값을 계산하고 각 웰에서 이 값을 뺍니다.
   2. 연구 약물("AV-SS-unt")로 처리되지 않은 세포를 포함하는 대조군 웰에서 "특정 신호"의 평균을 계산합니다.
   3. 처리되지 않은 세포가 있는 웰에 대한 각 웰의 세포 생존율(백분율)을 계산합니다.
      참고: 생존율 = (각 웰의 특정 신호/"AV-SS-unt") × 100

3. 스페로이드의 형태학적 변화 모니터링 및 분석

참고: MTT 분석의 경우 이 평가에는 "3D 배양 배지"가 아닌 세포 배양 배지만 사용해야 합니다(기저막 매트릭스를 추가할 필요가 없으며 잠재적으로 분석을 방해할 수 있음).

1. 스페로이드를 계수한 후 세포 배양 배지(10% FBS, 1:100 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배양 배지)에서 현탁액을 20μL당 약 1-2개의 스페로이드로 희석합니다.
2. 80μL의 세포 배양 배지를 초저 부착 96웰 플레이트의 웰에 넣은 다음 20μL의 스페로이드 현탁액을 웰에 추가합니다.
   참고: 따라서 웰에는 100μL 용량의 스페로이드 1-2개가 포함됩니다.
3. 현미경으로 웰을 주의 깊게 확인하고 이 분석에 사용될 스페로이드 하나가 포함된 웰을 표시합니다.
4. 관심 농도의 2배인 농도로 연구 약물을 준비합니다. 100 μL의 약물 용액을 관련 웰에 추가합니다 (웰의 총 농도는 1x가 됨).
5. 0일(연구 약물을 추가하기 전)에 각 웰의 이미지를 캡처하고 이미징 소프트웨어의 "스케일" 도구( 재료 표 참조)를 사용하여 스페로이드의 직경을 결정합니다.
6. 플레이트를 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 37°C로 배양하고, 약물 효과가 관찰되는 시기(예: 세포 파종, 침습성 포드, 구조 파괴 등)에 따라 3-7일 동안 매일 형태를 검사하고 스페로이드의 직경을 측정합니다("스케일" 도구 사용).
7. 실험이 끝나면 시간 경과에 따른 스페로이드 직경의 변화(0일 기준)를 플로팅합니다.
   참고: 변화(백분율) = (특정 날짜의 스페로이드 직경/0일의 해당 스페로이드 직경) × 100

결과

이 프로토콜은 원발성 종양 세포에서 스페로이드의 균질한 배양을 생성하고, 스페로이드 배양에 대한 약물 효능을 정량적으로 평가하고(MTT 분석), 스페로이드 형태에 대한 연구 약물의 효과를 결정하는 절차를 제시합니다. 결장암 및 유방암 세포 배양에서 생성된 스페로이드의 대표적인 실험 데이터가 제시됩니다. 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암을 포함한 다른 종양 유형을 사용하여 유사한 실험?...

토론

본 프로토콜은 인간 종양 샘플로부터 유래된 3D 일차 세포 배양물(스페로이드)을 생성하기 위한 간단한 방법을 설명한다. 이러한 스페로이드는 잠재적인 약물 후보 및 약물 조합 평가, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적 식별, 반응 및 내성 메커니즘 조사를 포함한 다양한 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 환자 샘플에서 직접 파생된 원발성 종양 세포 또는 환자 샘플을 사용하여 확립?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracil	TEVA Israel	lot 16c22NA	Fluorouracil, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Flurometer ELISA reader	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	320331	for stop solution
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.52a	Open-source software ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	for stop solution
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Palbociclib	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	2119399
Phenol-free RPMI 1640	Biological industries, Israel	01-103-1A
Pippeting reservoir	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0.5% solution	Biological industries, Israel	03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine