Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה דן בגישה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים מרקמת חלב ראשונית נורמלית וגידולית באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. יתר על כן, הוראות כלולות עבור תרבית תלת מימדית, כמו גם הדמיה immunofluorescent של אורגנואידים משובצים.

Abstract

אורגנואידים הם שיטה אמינה למידול רקמת איברים בשל תכונות הארגון העצמי שלהם ושמירה על תפקוד וארכיטקטורה לאחר התפשטות מרקמה ראשונית או תאי גזע. שיטה זו של יצירת אורגנואידים מוותרת על התמיינות של תא בודד דרך מעברים מרובים ובמקום זאת משתמשת בצנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד אורגנואידים אפיתל חלב מרקמות מנותקות מכנית ואנזימטית. פרוטוקול זה מספק טכניקה יעילה לייצור מהיר של אורגנואידים אפיתליאליים קטנים וגדולים מרקמת חלב עכברית ואנושית, בנוסף לטכניקות להטמעת אורגנואידים בקולגן ובמטריצה חוץ-תאית במרתף. יתר על כן, הוראות לקיבוע בג'ל וצביעה אימונופלואורסצנטית ניתנות לצורך הדמיה של מורפולוגיה וצפיפות אורגנואידים. מתודולוגיות אלה מתאימות למספר עצום של ניתוחים במורד הזרם, כגון תרבית משותפת עם תאי מערכת החיסון ומידול גרורות ex vivo באמצעות בדיקת פלישה לקולגן. ניתוחים אלה משמשים להבהרה טובה יותר של התנהגות התא וליצירת הבנה מלאה יותר של אינטראקציות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול.

Introduction

היכולת למדל תאי אפיתל במבחנה הייתה הבסיס למחקר הביו-רפואי המודרני מכיוון שהיא לוכדת תכונות תאיות שאינן נגישות in vivo. לדוגמה, גידול קווי תאי אפיתל במישור דו-ממדי יכול לספק הערכה של השינויים המולקולריים המתרחשים בתא אפיתל במהלך התפשטות1. יתר על כן, מדידת הוויסות הדינמי בין איתות לביטוי גנים מוגבלת במערכות in vivo 2. בחקר הסרטן, מידול קו תאי אפיתל של סרטן איפשר זיהוי של מניעים מולקולריים של התקדמות המחלה ומטרות פוטנציאליות של תרופות3. עם זאת, לגידול קווי תאי אפיתל סרטניים במישור דו-ממדי יש מגבלות, שכן רובם עברו אימורטליזציה גנטית והונדסה, לעתים קרובות משובטים בטבע, שנבחרו בשל יכולתם לגדול בתנאים לא פיזיולוגיים, מוגבלים בהערכתם את ארכיטקטורת רקמת הגידול התלת-ממדית (3D), ואינם מודלים כראוי אינטראקציות מיקרו-סביבה בסביבת רקמה מציאותית4. אילוצים אלה בולטים במיוחד במידול גרורות, אשר in vivo כולל כמה שלבים ביולוגיים ברורים, כולל פלישה, הפצה, מחזור והתיישבות באתר האיברים המרוחק5.

אורגנואידים אפיתל לסרטן פותחו כדי לשחזר טוב יותר את הסביבה התלת-ממדית ואת ההתנהגות של גידולים 6,7,8. אורגנואידים פותחו לראשונה מתאי קריפטה בודדים של המעי LRG5+ והתמיינו כדי לייצג את המבנה התלת-ממדי של יחידות קריפטו-וילוס ששמרו על המבנה ההיררכי של המעי הדק במבחנה9. גישה זו אפשרה הדמיה בזמן אמת ואפיון של ארכיטקטורת רקמות המארגנת את עצמה בתנאי הומיאוסטטיקה ולחץ. כהרחבה טבעית, אורגנואידים אפיתליאליים של סרטן פותחו כדי למדל סוגי סרטן רבים ושונים, כולל סרטן המעי הגס 10, לבלב11, שד 12, כבד 13, ריאות 14, מוח 15, וסרטן קיבה 16. אורגנואידים אפיתליאליים של סרטן נוצלו כדי לאפיין אבולוציה של סרטן17,18 והתנהגויות מרחביות-זמניות גרורתיות19,20 ולחקור הטרוגניות של הגידול21, ולבדוק כימותרפיות 22. אורגנואידים אפיתל לסרטן בודדו ונאספו גם במהלך ניסויים קליניים מתמשכים כדי לחזות את תגובת המטופלים לחומרים אנטי-סרטניים והקרנות ex vivo 8,23,24,25. יתר על כן, מערכות המשלבות אורגנואידים אפיתל סרטני יכולות להיות משולבות עם תאים אחרים שאינם סרטניים, כגון תאים חיסוניים, כדי ליצור מודל מקיף יותר של מיקרו-סביבה של הגידול כדי לדמיין אינטראקציות בזמן אמת, לחשוף כיצד תאי אפיתל סרטניים משנים את הטבע הבסיסי של תאים חיסוניים ציטוטוקסיים משפיעים כגון תאי הרג טבעיים, ולבדוק אימונותרפיה פוטנציאלית ופעילות ציטוטוקסית תלוית נוגדנים-תרופות26, 27,28. מאמר זה מדגים שיטה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים ללא מעבר והטבעה בקולגן ובמטריצה חוץ-תאית במרתף (ECM). בנוסף, טכניקות להדמיה במורד הזרם של אורגנואידים מבודדים משותפות גם כן.

Protocol

כל רקמת העכבר המשמשת בכתב יד זה נאספה באופן אתי בהתאם לתקנות והנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז הרפואי הדרום-מערבי של אוניברסיטת טקסס. כמו כן, כל החולים הסכימו לפני תרומת רקמות תחת פיקוח של ועדת ביקורת מוסדית (IRB), והדגימות זוהו.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את יצירת האורגנואידים מרקמה ראשונית.

1. הכנת חומרים למשך הלילה

  1. להטבעה במטריצה חוץ-תאית במרתף (BECM), הפשירו את האליקוט של BECM על ידי השארתו בטמפרטורה של 4°C.

2. הכנת תמיסת ציפוי אלבומין מסרום פור collagenase (BSA)

  1. הכנת תמיסת ציפוי BSA/PBS 2.64% (תמיסת BSA): מסנן סטרילי 50 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ו-4.10 מ"ל של תמיסת 30% BSA באמצעות בקבוק מסנן של 50 מ"ל/0.2 מיקרומטר. ניתן לסנן פתרון BSA זה ולהשתמש בו שוב.
  2. הכנת תמיסת collagenase לרקמת חלב עכבר: מסנן סטרילי 27 מ"ל של תא בסיס בינוני, 1.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 30 μL של 50 מ"ג / מ"ל גנטמיצין, 15 μL של 10 מ"ג / מ"ל אינסולין, 600 μL של 0.1 גרם / מ"ל collagenase A, ו 600 μL של 0.1 גרם / מ"ל טריפסין באמצעות בקבוק מסנן 50 מ"ל / 0.2 מיקרומטר. להקצות בין 10 מ"ל ל 30 מ"ל של פתרון collagenase לכל עכבר, בהתאם למסת הרקמה.
  3. הכן תמיסת קולגנאז לרקמת שד אנושית: מסנן סטרילי 18 מ"ל של RPMI-1640, 200 μL של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100x (עט/סטרפטוקו), 200 מיקרוליטר של 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) חוצץ, 1 מ"ל של FBS, ו-400 μL של 0.1 גרם/מ"ל Collagenase A באמצעות בקבוק מסנן של 50 מ"ל/0.2 מיקרומטר. להקצות בין 10 מ"ל ל 20 מ"ל לכל דגימת רקמה, בהתאם למסת הרקמה.

3. הכנת מדיה

  1. הכנת חומר אורגנואידים: מסנן סטרילי של תאי בסיס בינוניים עם 1% עט/סטרפטוקוקוס ו-1% אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS) באמצעות צלוחיות מסנן של 50 מ"ל/0.2 מיקרומטר. כדי ליצור גורם גדילה אורגנואידי מדיה, הוסף גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) לריכוז סופי של 2.5 ננומטר.
  2. הכנת מצע אפיתל החלב: כדי לייצר 100 מ"ל של מדיית אפיתל החלב, מסנן סטרילי גלוקוז גבוה מדיום בסיסי נפוץ עם 1 מ"ל של תוסף גלוטמין 100x, 1 מ"ל של עט / סטרפ, 1 מ"ל של 10 mM חיץ HEPES (7.3 pH), 250 μL של 30% מלאי BSA, 1 μL של 1 מ"ג / מ"ל מלאי רעלן כולרה, 1 מ"ל של 50 מיקרוגרם / מ"ל מלאי הידרוקורטיזון ב PBS, 50 μL של תמיסת אינסולין אנושית של 10 מ"ג/מ"ל, 10 μL של מלאי גורם גדילה אפידרמלי (EGF) של 50 מיקרוגרם/מ"ל, ו-1% FBS באמצעות בקבוק מסנן של 150 מ"ל/0.2 מיקרומטר. אחסן את המדיה בטמפרטורה של 4°C והשתמש למשך עד שבועיים.
  3. הכינו שטיפת אמפוטריצין: PBS מסנן סטרילי עם 2% עט/סטרפטוקוקוס ו-2% אמפוטריצין B. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.

4. איסוף ועיכול רקמות

  1. רקמת חלב עכבר
    1. הרדימו את העכבר על ידי הצבת תא CO 2 למשך2-5 דקות, ולאחר מכן המשיכו עם נקע צוואר הרחם. כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, שחקו את גפי העכבר והשתמשו בארבע מחטים של 19 G כדי להצמיד את העכבר בכפות ללוח מכוסה בכרית סופגת. יש לרסס באתנול 70% כדי להחליק את הפרווה ולחטא את העור. נגבו את הצואה בעזרת פד גזה או רקמה.
    2. החל ממש מעל האזור האנוגניטלי, לחתוך כלפי מעלה מקו האמצע באמצעות מספריים כירורגיים, נזהר לא לחדור דרך הצפק. עם ההגעה לסנטר, בצעו חתכים רוחביים בשתי עצמות הבריח ובמורד הרגליים האחוריות, והצמידו את עור העכבר מתוח ללוח כדי לחשוף רפידות שומן חלב.
    3. אתר את רפידות שומן החלב המפשעתי על עכברי בר על ידי זיהוי בלוטת הלימפה המפשעתית הממוקמת ליד הגפיים האחוריות. אתרו את רפידות שומן החלב של בית החזה על עכברי בר כרקמה העבה והסקולרית מתחת לגפיים הקדמיות.
    4. השתמש במלקחיים כדי להעלות את כרית שומן החלב. הימנעו מאיסוף השריר הבסיסי. בעזרת הקצה הקהה של מספריים חדים-קהים, יוצרים כיס מתחת לכרית שומן החלב, הרחק מהעור. חותכים את כרית שומן החלב בחתיכה אחת שלמה.
    5. לאחר הסרת רפידות שומן החלב, יש לשטוף ב-PBS לפני הכנסתן לצלחת תרבית רקמות סטרילית. העבר במהירות למכסה מנוע של תרבית רקמות.
      הערה: עבור גידולי חלב, השתמש בצמר גפן רטוב עם PBS כדי לגלגל בעדינות את הגידול הרחק מהעור. הקפידו להימנע מאזורים כהים או רכים, שכן שינוי צבע כהה מעיד על נמק, שלא יניב אורגנואידים בריאים.
    6. לטחון את גידולי החלב עם אזמל #10 או #11 כדי לשחרר רקמות עד שהוא מגיע עקביות דמוית לשחק. מעבירים את הרקמה הטחונה לתוך צינור חרוטי המכיל 10-30 מ"ל של תמיסת collagenase באמצעות אזמל. כדי להבטיח שכל הרקמה נאספת, פיפטה 1 מ"ל של תמיסת collagenase על צלחת תרבית הרקמה ובחזרה לתוך הצינור החרוט.
      הערה: כדי לייצר אורגנואידים גדולים יותר, יש למזער את העיכול המכני, ולהשאיר כמה פיסות רקמה קטנות גלויות שלמות. לחלופין, ניתן לאחסן רקמות קפואות להכנת אורגנואידים מאוחרת יותר עם אובדן מינימלי בכדאיות. כדי לעשות זאת, לשטוף רקמה בתמיסה של PBS או מדיה התא הבסיסי + 1% FBS, ולאחר מכן לטחון גס כדי להגדיל את שטח הפנים (שמירה על הרקמה בחתיכה מוצקה אחת או שתיים). העבר את הרקמה לבקבוקון קריו, למעלה עם מדיה מקפיא (90% FBS + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)). יש להקפיא את הבקבוקונים במיכל הקפאה בקצב מבוקר למשך הלילה לפני העברתם לאחסון בחנקן נוזלי.
    7. הכניסו את הצינור החרוטי לאינקובטור ניעור ספסל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהירות 180 סל"ד עד שהרקמה הופכת למיתר ותמיסת הקולגנאז הופכת לעכורה. לדוגמה, מסת רקמה גדולה (סביב 500-800 מ"ג) מגידול לוקח 30-60 דקות. מסת רקמה קטנה יותר (בסביבות 100-300 מ"ג) מרפידות שומן חלב מסוג בר אורכת כ-20-30 דקות. אם אינכם בטוחים, בדקו במרווחים של 5 דקות.
    8. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את הצינור החרוטי למשך 10 דקות ב 550 x גרם בטמפרטורת החדר (RT).
    9. בזהירות לשאוף את supernatant מן הצינור החרוט.
      הערה: קדימה, צפו מראש את כל קצות הפיפטה, הפיטות הסרולוגיות והצינורות החרוטיים בתמיסת BSA כדי למנוע אובדן אורגנואידים עקב הידבקות לפלסטיק.
    10. הוסף 8 מ"ל של מדיה של תאי בסיס ו-80 מיקרוליטר של תמיסת DNase [2 U/μL] לצינור. יש להפוך בעדינות למשך 1-3 דקות.
    11. הוסף 12 מ"ל של מדיה תא הבסיס לצינור וערבב בזהירות על ידי pipetting או בעדינות לסובב את הצינור 15 פעמים כדי לערבב.
    12. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 550 x גרם ב RT.
    13. לשאוף את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 12 מ"ל של מדיה התא הבסיסי.
    14. תנו לשברי הרקמה הכבדים ביותר להתיישב לתחתית. לאסוף את supernatant עם צינור סרולוגי ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. תרחיף זה מכיל אורגנואידים אפיתל ותאי סטרומה/מערכת החיסון.
  2. רקמת שד אנושית
    1. לעבד את דגימות רקמת השד האנושית עבור אורגנואידים או לאחסן אותם בתוך 24 שעות של איסוף. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C ב-CO2-Independent media עם 1% 100x אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית.
    2. מעבירים את הרקמה לצלחת תרבית רקמה. הטה את הצלחת ושאפו את אמצעי האחסון העודפים, ולאחר מכן שטפו את הרקמה עם 5 מ"ל של אמפוטריצין B לשטוף. יש להסיר מיד את שטיפת האמפוטריצין B.
    3. טחנו את דגימת הרקמה עם אזמל #10 או #11 כדי לשחרר את הרקמה עד שהיא מגיעה למרקם דמוי משחה. מעבירים את הרקמה הטחונה לתוך צינור חרוטי המכיל 10-30 מ"ל של תמיסת collagenase באמצעות אזמל. כדי להבטיח שכל הרקמה נאספת, פיפטה 1 מ"ל של תמיסת collagenase על צלחת תרבית הרקמה ולחזור לצינור החרוט.
      הערה: כדי לייצר אורגנואידים גדולים יותר, יש למזער את העיכול המכני, ולהשאיר כמה פיסות רקמה קטנות גלויות שלמות. מסת הרקמה ההתחלתית לפרוטוקול זה נעה בין 100-250 מ"ג. לחלופין, ניתן לאחסן רקמות קפואות להכנת אורגנואידים מאוחרת יותר עם אובדן מינימלי בכדאיות לאחר שלב 4.2.2 ב- 90% FBS + 10% DMSO כנ"ל.
    4. הכניסו את הצינור החרוטי לאינקובטור ניעור ספסל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהירות 180 סל"ד עד שהרקמה הופכת קטנה יותר והקולגנאז נעשה עכור. בדוק את הרקמה במרווחים של 5 דקות. דיסוציאציה של Collagenase של דגימות אנושיות אורכת בערך 5-20 דקות.
    5. לאחר הדגירה, סובב את הצינור החרוטי במשך 10 דקות ב 550 x גרם ב RT.
    6. בזהירות לשאוף את supernatant מן הצינור החרוט.
      הערה: קדימה, צפו מראש את כל קצות הפיפטה, הפיטות הסרולוגיות והצינורות החרוטיים בתמיסת BSA כדי למנוע אובדן אורגנואידים עקב הידבקות לפלסטיק.
    7. הוסף 4 מ"ל של מדיה תאי בסיס ו 40 μL של תמיסת DNase [2 U/μL] לצינור החרוט. הפוך בעדינות במשך 3 דקות.
    8. הוסף 6 מ"ל של מדיה התא הבסיסי לצינור וערבב בזהירות על ידי pipetting או בעדינות לסובב את הצינור החרוטי 15 פעמים כדי לערבב.
    9. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 550 x גרם ב RT.
    10. לשאוף את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מ"ל של מדיה התא הבסיסי.
    11. תנו לשברי הרקמה הכבדים ביותר להתיישב לתחתית. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור חרוטי 15 מ"ל. תרחיף זה מכיל אורגנואידים אפיתל ותאי סטרומה/מערכת החיסון.

5. צנטריפוגה דיפרנציאלית

  1. דופקים ל 550 x גרם במשך 3-4 שניות ב RT, שואפים את supernatant, ו resuspend את הגלולה ב 10 מ"ל של מדיה התא הבסיסי. חזור על שלב זה שלוש פעמים נוספות (סה"כ ארבעה סיבובים).
  2. לאחר כל צנטריפוגה, ודא כי הגלולה הופכת אטומה יותר ויותר. גלולה זו שנותרה תהיה אורגנואידים אפיתליאליים.

6. איסוף אורגנואידים קטנים

  1. פולס ל 80-100 x גרם במשך 3 שניות ב RT. לאסוף את supernatant לתוך צינור מצופה BSA טרי, ולאחר מכן פולסים ל 550 x גרם במשך 3 s ב RT כדי pelpel אורגנואידים קטנים.

7. הטמעת אורגנואידים ב-BECM

  1. Aliquot מתאים השעיה של אורגנואידים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות בהתאם לצפיפות האורגנואידים ביחס לכמות BECM לבאר (טבלה 1). לדוגמה, השתמש 50-100 אורגנואידים עבור 20 μL של BECM בבאר אחת של צלחת 96 באר.
    הערה: ניתן לספור צפיפות אורגנואידים באמצעות הנוסחה הבאה: ((מספר ממוצע של אורגנואידים)/50 μL) x גורם דילול.
  2. בצע את כל השלבים על קרח. הניחו את ה-BECM המופשר על קרח במכסה מנוע של תרבית רקמות. בזמן הכנת מכסה המנוע, מניחים את כל קצות פיפטה על קרח כדי להתקרר.
  3. צנטריפוגה את צינורות המיקרו-צנטריפוגות למשך 10 דקות ב-300 x גרם ב-RT. יש להשליך את הסופרנאטנט מהצינורות. העבר את הצינורות עם כדורי אורגנואיד לקרח והוסף את הנפח המתאים של BECM לכל צינור מיקרוצנטריפוגה (טבלה 1).
    הערה: מכיוון ש-BECM צמיג, הוסף נפחים נוספים (כ-10%-20% נוספים מנפח הכיפה) של BECM כדי להסביר את האובדן בקצה הפיפט.
  4. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את האורגנואידים ב- BECM, תוך הקפדה לא לייצר בועות.
  5. יש למרוח לאט ובזהירות את האורגנואידים המרחפים על משטח הציפוי. תוך כדי פיפט, לאט לאט להעלות את פיפטה כדי ליצור כיפה. מלא את כל הבארות הריקות עם PBS כדי לשמור על לחות.
  6. הכניסו את הצלחת לאינקובטור של 37°C למשך שעה אחת כדי לאפשר ל-BECM להתמצק, ולאחר מכן כסו בנפח המדיה המתאים (טבלה 1).

8. הטמעת אורגנואידים בקולגן

  1. בצע את כל השלבים על קרח. הכינו את תמיסת הקולגן על ידי שילוב, בסדר רציף, 375 μL של 10x DMEM, 100 μL של 1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH), ו-3 מ"ל של תמיסת קולגן I זנב חולדה בצינור חרוטי של 15 מ"ל. תערובת פיפטה, נזהרת לא לעשות בועות. טיטרט את התמיסה ל- pH של 7.2-7.4 עם כמויות קטנות (מרווחים של 1-3 μL) של NaOH או 10x DMEM לפי הצורך.
  2. מצפים את תחתית הבארות בכמות המינימלית של קולגן הנדרשת לכיסוי מלא של תחתית הבאר. גישה אחת היא להניח כמות קטנה של קולגן ולנענע את הצלחת מצד לצד כדי לצפות. הניחו לשכבות הקולגן להתייצב על 37°C למשך 30 דקות-2 שעות.
  3. Aliquot את התרחיף המתאים של אורגנואידים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות בהתאם לצפיפות האורגנואידים ביחס לכמות הקולגן לבאר (טבלה 1). מניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  4. אחסנו את תמיסת הקולגן בטמפרטורה של 4°C ועקבו אחר פילמור על ידי בדיקת היווצרות סיבים תחת מיקרוסקופ כל 10 דקות. הקולגן יגיע לפילמור מתאים בין 30 דקות ל-2 שעות.
    הערה: פילמור תקין יכול להיקבע על ידי נוכחות של סיבים מסתעפים ברחבי המטריצה. המשך לשלב 8.5 מיד לאחר שנצפו כמה סיבים בשדה הראייה.
  5. צנטריפוגה את צינורות המיקרו-צנטריפוגות במהירות של 300 x גרם למשך 10 דקות ב-RT. יש להשליך את הסופרנאטנט מהצינורות. העבירו את כדורי האורגנואיד לקרח והוסיפו את נפח הקולגן המתאים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה (טבלה 1).
    הערה: מאחר שקולגן צמיג, יש להוסיף כמויות נוספות (כ-10%-20% מנפח הכיפה) של קולגן כדי להסביר את אובדן קצה הפיפט.
  6. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות אורגנואידים בקולגן, נזהר לא לייצר בועות.
  7. יש למרוח לאט ובזהירות את האורגנואידים המרחפים בקולגן על משטח הציפוי. תוך כדי פיפט, לאט לאט להעלות את פיפטה כדי ליצור כיפה. מלא את כל הבארות הריקות עם PBS כדי לשמור על לחות.
  8. הכניסו את הצלחת לאינקובטור של 37°C למשך שעה אחת כדי לאפשר לקולגן להתמצק, ולאחר מכן כסו בנפח המדיה המתאים (טבלה 1).
  9. הערה: אורגנואידים שומרים על כדאיות במטריצה תלת-ממדית למשך עד 7 ימים. אם נעשה שימוש בהדמיה לצורך ניתוח, המשך לשלבים 9 ו- 10.

9. תיקון אורגנואידים משובצים

  1. השתמש פיפטה כדי להסיר את כל המדיה מן הבארות מבלי ליצור מגע עם כיפות ECM.
  2. תקן עם תמיסת 4% פרפורמאלדהיד (PFA)/PBS למשך 5 דקות.
  3. יש לשטוף פעמיים עד שלוש על ידי מריחת PBS על בארות לאחר הנחתן על שייקר הנע לאט. לאחר השטיפה, יש למרוח PBS טרי על הכיפות ולאחסן את הצלחת בטמפרטורה של 4°C.

10. צביעה אימונופלואורסצנטית של אורגנואידים משובצים

  1. הכנת פתרונות לצביעה אימונופלואורסצנטית
    1. חיץ חדירה: הכן פתרון PBS עם 10% Triton X-100.
    2. מאגר חסימה: הכן פתרון PBS עם 10% FBS ו-0.2% Triton X-100.
    3. מאגר דילול נוגדנים: הכינו תמיסת PBS עם 2% FBS ו-0.2% Triton X-100.
  2. חדירה וחסימה
    1. פיפטה מספיק חיץ חדירה כדי לכסות את כיפות ECM. יש לדגור במשך שעה אחת ב-RT על שייקר שנע לאט.
    2. הסר את מאגר החדירה עם פיפטה והחל את אותו נפח של מאגר חוסם למשך 3 שעות.
  3. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. הסר את המאגר החוסם עם פיפטה והחל את מאגר דילול הנוגדנים המכיל את הנוגדן הראשוני בריכוזים שצוינו על ידי היצרן. יש לדגור על הדגימה בטמפרטורה של 4°C למשך 12-16 שעות על שייקר הנע לאט.
    2. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS ב- RT על שייקר הנע לאט.
  4. דגירה משנית של נוגדנים וכתם גרעיני
    1. יש לשאוף לשטיפת PBS הנותרת ולהחיל את מאגר דילול הנוגדנים המכיל נוגדן משני בריכוזים שצוינו על ידי היצרן. בנוסף, הוסף DAPI או Hoechst (כדי לסמן גרעינים) או phalloidin (כדי לסמן אקטין - actin) למאגר ביחס של 1:250. יש לדגור במשך 2-4 שעות ב-RT על שייקר שנע לאט.
    2. הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטוף דגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות ב- PBS ב- RT על שייקר. אחסן את הדגימות ב- PBS ב- 4 ° C עד להדמיה.

תוצאות

התמונות המוצגות באיור 1 מספקות דוגמה לאורגנואידים אפיתל חלב מסוג בר וגידולים מרקמות אדם ועכבר. המחשה במבט חטוף של השיטה לבידוד אורגנואידים אפיתליאליים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית מוצגת בתהליך העבודה המצויר באיור 1A, המראה שרקמות ראשוניות ממינים שונים י...

Discussion

שיטות שונות תוארו בספרות ליצירת אורגנואידים סרטניים. פרוטוקול זה מדגיש שיטה ליצירת אורגנואידים סרטניים ישירות מהגידול ללא מעבר. באמצעות שיטה זו, אורגנואידים סרטניים ניתנים לייצור תוך שעות מתחילת ההליך ומייצרים קרוב ל -100% אורגנואידים קיימא לעומת 70% שדווחו בספרות31. לשם השוואה...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מימון שסופק על ידי METAvivor, קרן פיטר קרלסון, קרן המחקר של תרזה, ומרכז הסרטן NCI/UTSW סימונס P30 CA142543. אנו מכירים בסיוע של University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, משאב משותף במרכז סימונס לסרטן מקיף, הנתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לסרטן תחת פרס מספר P30 CA142543. תודה מיוחדת לכל חברי מעבדת צ'אן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM HEPES BufferGibco 15630080
100x Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-096
100x GlutamaxLife Technologies 35050-061Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Life Technologies 51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)Sigma P4333
10x DMEMSigma D2429
50 mL/0.2 µm filter flaskFisher #564-0020
Amphotericin BLife Technologies 15290-018
bFGFSigmaF0291
BSA Solution (32%)Sigma #A9576
Cholera Toxin Sigma C8052
CO2-Independent Medium Gibco18045-088
Collagenase A Sigma C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)SigmaD4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD6546Common basal medium
D-MEM/F12 Life Technologies #10565-018Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma#D8662PBS
Fetal bovine serum (FBS)Sigma #F0926
Gentamicin Life Technologies #15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0396
Insulin Sigma #I9278
Matrigel Corning #354230Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)Sigma S2770
Rat Tail Collagen ICorning 354236
RPMI-1640 mediaFisher SH3002701
Trypsin Life Technologies 27250-018

References

  1. Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  2. Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
  3. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  4. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  5. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  8. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  9. Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  10. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  13. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  14. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  15. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  16. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  17. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
  18. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  19. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  20. Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
  21. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  24. Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
  25. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  26. Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
  27. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  28. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
  29. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  31. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
  32. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
  33. Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved